способ прогнозирования ответа на химиотерапию при хроническом лимфолейкозе

Формула изобретения

Способ прогнозирования ответа на химиотерапию при хроническом лимфолейкозе, включающий исследование периферической венозной крови, отличающийся тем, что проводят выделение ДНК из лимфоцитов с последующими амплификацией и рестрикцией, генотипирование методом ПЦР полиморфного локуса 936С>Т гена фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и при выявлении у больного генотипа СС или аллеля С прогнозируют высокую вероятность положительного ответа на проводимую химиотерапию.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, может быть использовано для прогнозирования ответа на проводимую химиотерапию при хроническом лимфолейкозе.

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) - это онкологическое заболевание лимфатической ткани, при котором опухолевые лимфоциты накапливаются в периферической крови, костном мозге и лимфатических узлах. ХЛЛ имеет В-клеточное происхождение и является самым частым заболеванием среди всех лейкозов у взрослых (Волкова М.А., 1998).

Этиология ХЛЛ включает как влияние факторов внешней среды, так и генетические факторы. В последние годы был изучен ряд генов, продукты которых предположительно влияют на риск развития ХЛЛ, однако лишь для нескольких из них он был доказан.

Несмотря на значительные успехи фармакологии некоторая часть пациентов ХЛЛ имеет устойчивость к химиотерапии, и, не смотря на проводимое лечение, происходит прогрессирование заболевания. Для работы гематолога необходимо факторы прогноза ответа на проводимую химиотерапию, для коррекции тактики лечения.

Выбор терапии между FC (циклофосфан вводился в дозе 250 мг/м² в 1, 2 и 3-й дни; флударабин - 40 мг/м² в 1, 2 и 3-й дни) и FCR (циклофосфан вводился в дозе 250 мг/м² в 1, 2 и 3-й дни; флударабин - 40 мг/м² в 1, 2 и 3-й дни; ритуксимаб 375 мг/м внутривенно в 1-й день) определялся несколькими критериями: возраст пациента до 65 лет, лимфаденопатия, спленомегалия, время удвоения лимфоцитов менее 12 месяцев, рецидив после проведения курса XT СОР и FC. Медиана возраста больных в группе FC составляла 62,1 год (37-85 лет), в группе FCR - 56 лет (38-75 лет). В группе FC было 39 мужчин и 12 женщин, в группе FCR - 28 мужчин и 17 женщин. В целом характеристики больных в группах FC и FCR до начала терапии сопоставимы по основным показателям.

Эффективность терапии оценивали согласно стандартным критериям, разработанным международной рабочей группой (International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia, IWCLL).

Главным показателем эффективности служила беспрогрессивная выживаемость (БПВ), определяемая как время от начала терапии до одного из следующих событий: прогрессия болезни (ПБ), рецидив после ремиссии, назначение нового варианта лечения, смерть от любой причины. Так же оценивались частота ремиссий и общая выживаемость (ОВ), вычисляемые от начала терапии до даты смерти или последнего визита. Полной ремиссией (ПР) считали исчезновение всех пальпируемых и определяемых по данным ультрасонографии и рентгенологического исследования органов грудной клетки лимфатических узлов, нормализацию размеров селезенки и картины крови, лимфоцитоз не более 10% в костном мозге через 2-а месяца после завершения курса XT. Частичную ремиссию (ЧР) констатировали при сокращении размеров лимфатических узлов и селезенки более чем на 50%, уменьшении лимфоцитоза более чем на 50%. Прогрессию опухоли констатировали при увеличении размеров ранее пораженных или появлении новых лимфатических узлов, увеличении размеров селезенки и числа лимфоцитов во время терапии. Стабилизацией считали все ситуации, не укладывающиеся в перечисленное. Кроме того, стабилизацию заболевания констатировали при наличии цитопении, сохраняющейся в течение 2 месяцев после завершения терапии, и других критериев, укладывающихся в ЧР. Рецидивом после ПР считали появление пальпируемых лимфатических узлов, селезенки, повышение лейкоцитоза более 10¹⁰ /л за счет лимфоцитов, появление тромбоцитопении. Рецидивом после ЧР считали рост старых и появление новых лимфоузлов, увеличение размеров селезенки, повышение абсолютного количества лимфоцитов более 10¹⁰/л. Многие пациенты с В-ХЛЛ имели цитопению перед началом лечения. В связи с этим для оценки гематологической токсичности использовали критерии токсичности NCI. Данные пациентов, у которых до начала терапии количество тромбоцитов было менее 20 000/мкл и/или количество нейтрофилов не превышало 1000/мкл, при оценке токсичности не учитывали. Тяжесть других осложнений оценивали по стандартным критериям.

Исследований посвященных резистентности к проводимой химиотерапии проводится не много. В одном из них, проведенном Daphne R. и соавторами (A Genomic Approach to Improve Prognosis and Predict Therapeutic Response in Chronic Lymphocytic Leukemia. Daphne R. Friedman, J. Brice Weinberg, William T. Barry, Barbara K. Goodman, Alicia D. Volkheimer, Karen M. Bond, Youwei Chen, Ning Jiang, Joseph O. Moore, Jon P. Gockerman, Louis F. Diehl, Carlos M. Decastro, Anil Potti, Joseph R. Nevins, Clin Cancer Res. Author manuscript; available in PMC 2010 November 15. 6947-6955), показана ассоциация отрицательного ответа на химиотерапию при повышении экспрессии определенных генов. Недостатком данного метода является его дороговизна и вариабельность уровня профиля экспрессии генов в зависимости от формы заболевания, фазы, проводимого лечения и даже времени суток.

Прототипом данного изобретения является способ Silvia Deaglio и Fabio Malavasi (Chronic lymphocytic leukemia microenvironment: shifting the balance from apoptosis to proliferation., Silvia Deaglio, Fabio Malavasi, Haematologica. 2009 June; 94(6): 752-756. doi: 10.3324/haematol.2009.006676), включающий определение в периферической крови экспрессии факторов роста, при повышении их уровня прогнозируют отрицательный ответ на химиотерапию.

Недостатками данных методов является следующее.

1. Определение профиля экспрессии менее постоянно и зависит от многих причин в отличие от постоянных полиморфных локусов.

2. Генотипирование полиморфных локусов значительно дешевле. Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования ответа на химиотерапию ХЛЛ на самых ранних стадиях развития заболевания.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования ответа на химиотерапию при хроническом лимфолейкозе, включающем исследование периферической венозной крови, согласно изобретению проводят выделение ДНК из лимфоцитов с последующими амплификацией и рестрикцией, генотипирование методом ПЦР полиморфного локуса 9360Т гена фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), и при выявлении у больного генотипа СС или аллеля С прогнозируют высокую вероятность положительного ответа на проводимую химиотерапию.

При генотипировании полиморфного локуса 936>Т гена VEGF генетическим маркерами резистентности к химиотерапии ХЛЛ был генотип СТ и аллель С.

Предлагаемый способ прогнозирования осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической венозной крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; - 1984. - V.2. - P. 31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис HCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трис HCl до рН 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной H₂O; раствор хранят при -20°С.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательность олигонуклеотидных праймеров для полиморфного локуса 936С>Т гена VEGF F: 5'-AGGAAGAGGAGACTCTGCGCAGAGC-3 , R: 5'-TAAATGTATGTATGTGGGTGGGTGTGTCTAC AGG-3 . Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, рН 8.8, 6.7 mM MgCl₂, 16,6 mM (NH₄)₂SO ₄ 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°С, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°С - 45 секунд, 55°С - 45 секунд, 72°С - 45 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°С в течение 7 минут.

Нуклеотидную замену С Т в положении 936 гена VEGF выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Hin1II, смесь выдерживают при 37°С в течение 10-12 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют IX боратный буфер (0,089М трис HCl рН=7,8; 0,089М борная кислота, 0,002М ЭДТА с рН=8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят в при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Генотипы полиморфного локуса 936 гена VEGF типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 207 пар нуклеотидов (пн) идентифируется аллель С и гомозиготный генотип СС, при наличии двух фрагментов размером 207 и 122 пн идентифицируется гетерозиготный генотип СТ, при наличии фрагмента размером 122 пн идентифицируется гомозиготный по редкому аллелю генотип ТТ. При выявлении у больного генотипа СС или аллеля С прогнозируют высокую вероятность положительного ответа на проводимую химиотерапию.

Нами оценена эффективность терапии 96 больных хроническим лимфолейкозом в возрасте от 41 до 85 лет (средний возраст 59,2±1,2 лет), которым проводилось лечение в гематологическом отделении РКБ им. Г.Г. Куватова г.Уфа в 2005-2011 годах. Решение о начале терапии принималось относительно пациентов с ранее не леченным хроническим лимфолейкозом в соответствии с критериями Национального института по изучению рака (Hallek М. Et all, 2008). Больные получали следующие программы лечения: 51 человек - FC, 45 - FCR). Программу FC выполняли по следующей схеме: (циклофосфан вводился в дозе 250 мг/м ² в 1, 2 и 3-й дни; флударабин - 40 мг/м² в 1, 2 и 3-й дни). Пациенты в группе FCR, кроме этих препаратов, получали ритуксимаб в дозе 375 мг/м внутривенно в 1-й день каждого цикла или накануне (день 0). Курсы лечения повторяли каждые 28 дней. При развитии цитопении и других осложнений увеличивали межкурсовые промежутки или отменяли лечение. Шесть циклов терапии и более получили 49 (96,1%) больных по программе FC и 41 (91,1%) - FCR. В группе пациентов по программе FCR, терапия была прекращена двум пациентам, вследствие летального исхода из-за инфекционных осложнений, а 5 пациентам интервалы между циклами были увеличены, из-за затяжной цитопении и инфекционных осложнений после проведенного курса лечения. По программе FC три курса и менее получили 4 пациента, на фоне резистентности к проводимой терапии. Случаев прекращения терапии из-за непереносимости ритуксимаба не было. Клиническое обследование больных проводилось врачами больницы и включало в себя обязательные и дополнительные метода исследования.

Проведен анализ ассоциаций между положительным ответом на проводимую терапию и генотипами полиморфного локуса 936С>Т гена VEGF (табл.1, 2).

При проведении статистического анализа ассоциаций между исследованным полиморфным локусом и положительным ответом на проводимую терапию была обнаружена ассоциация по полиморфному локусу 936>Т гена VEGF и химиотерапией по схеме FC и FCR. Так у больных с генотипом СС и аллелем С чаще регистрировался положительный ответ на терапию по схеме FC ( 2=4,71; р=0,030; 2=4,62; р=0,032, соответственно). Пациенты с генотипом СС и аллелем С так же лучше отвечали на схему FCR ( 2=15,71; р=0,1; OR=7,56; CI=95%, 4,34-11,16), чем с другими генотипами.

На основании полученных результатов можно сделать вывод об ассоциации генотипа СС и аллеля С полиморфного локуса 936С>Т гена VEGF с ответом на проводимую химиотерапию. Изобретение иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Пациентка Ф-ва 1958 года рождения, г.Дюртюли, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в сентябре 2009 года, подтвержден стернальной пункцией, 95%-зрелых лимфоцитов. Проводилась химиотерапия по схеме FCR. При молекулярно-генетическом тестировании у больной было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25мкл однократного буфера для ГШР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hin1II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип СС, что позволило нам прогнозировать положительный ответ на химиотерапию.

Что подтвердилось при наблюдении за данной пациенткой, беспрогрессивная выживаемость составила 60 мес.

Пример 2. Пациент Д-в 1964 года рождения, г.Салават, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в ноябре 2009 года, подтвержден стернальной пункцией, 90%-зрелых лимфоцитов. Проводилась химиотерапия по схеме FCR. При молекулярно-генетическом тестировании у больной было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hin1II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлено наличие аллеля С, что позволило нам прогнозировать положительный ответ на химиотерапию. Что подтвердилось при наблюдении за данной пациенткой, беспрогрессивная выживаемость составила 65 мес.

Таблица 1
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса 936С>Т гена VEGF у больных ХЛЛ с ответом на терапию по схеме FC
Генотипы	Положительный ответ на FC (N=42)		Без ответа (N=9)		2	Р	OR	CI - 95%
	Абс.	%	Абс.	%
СС	42	100,00	7	77,78	4,71	0,030	1,81	1,20-1,48
CT	0	0,00	2	22,22	4,71	0,030	0,51	0,01-1,02
TT	0	0,00	0	0,00	0,00	1,00	0,00	0,00-0,00
C	84	100,00	16	88,89	4,62	0,032	1,23	1,18-1,29
T	0	0,00	2	11,11	4,62	0,032	0,42	0,18-0,85

Таблица 2
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса 936С>Т гена VEGF у больных хроническим лимфолейкозом, с ответом на терапию по схеме FCR
Генотипы	Положительный ответ на FCR (N=42)		Без ответа (N=3)		2	Р	OR	CI - 95%
	Абс.	%	Абс.	%
СС	42	100,00	1	33,33	15,71	0,001	7,56	4,34-11,16
СТ	0	0,00	1	33,33	3,09	0,079	0,51	0,02-1,02
TT	0	0,00	1	33,33	3,09	0,079	0,51	0,02-1,02
C	84	100,00	3	50,00	29,32	0,001	11,48	8,22-16,69
T	0	0,00	3	50,00	29,32	0,001	0,51	0,04-1,03