малосывороточная среда для культивирования фибробластов человека

Формула изобретения

1. Малосывороточная среда для культивирования фибробластов человека, состоящая из «Основы среды для фибробластов», содержащей следующие компоненты, мг/л:

Глюкоза	4000
2-Аминоэтанол	0,80
Глютатион	0,80
Гипоксантин Na	2,00
Липоевая кислота	0,2
Пируват натрия	110
Ацетат натрия ×3H 2O	2,00
Путресцин 2HCl	0,03
NaCl	5950
KCl	400
MgSO 4	73,00
Na2HPO4	150,00
NaH2PO4	54,00
Ca(NO3)2 ×4H2O	50,00
CaCl2	100
FeNO3×9H2 O	0,05
FeSO 4×7H2O	0,04
CuSO4×5H2O	0,001
ZnSO 4x×7H2O	0,20
HEOES	1500,0
NaHCO3	2900,0
Аскорбиновая кислота	3,00
D-Ca-Пантотенат	3,00
Холина хлорид	5,00
i-Инозитол	20,00
Ниацинамид	4,00
Пиридоксал HCl	1,00
Пиридоксин HCl	2,50
Рибофлавин	0,30
Тиамин HCl	3,00
п-Аминобензойная к-та	0,25
B12	0,30
Фолиевая к-та	3,00
Биотин	0,10
-Токоферол фосфат Na2	0,002
Менадион бисульфат Na 2	0,030
Эргокальцийферол	0,020
Витамин A ацетат	0,020
Аденозин	5,00
Цитидин	5,00
Гуанозин	5,00
Тимидин	0,45
Уридин	5,00
L-Аланин	10,00
L-Аргинин HCl	137
L-Глицин	30
L-Гистидин	25,00
L-Изолейцин	88,00
L-Лейцин	88,00
L-Лизин HCl	108
L-Метионин	25,00
L-Фенилаланин	55,00
L-Серин	35,00
L-Треонин	65,00
L-Триптофан	16,00
L-Валин	69,00
L-Аспарагин H2O	16,00
L-Аспарагиновая кислота	6,00
L-Глутаминовая к-та	7,00
L-Гидроксипролин	5,00
L-Пролин	9,00
L-Цистин 2HCl	59,00
L-Тирозин	59,00
L-Орнитин HCl	0,40
L-Таурин	0,30
L-Аланил-глутамин	330,0
Деионизованная вода	1 л

обогащенную эмбриональной телячьей (ксеногенной) или человеческой (аутогенной, аллогенной) сывороткой крови в концентрации 2% от общего объема среды.

2. Малосывороточная среда для культивирования фибробластов человека по п.1, отличающаяся тем, что в состав сред введены белковые стимуляторы клеточного роста: инсулин - 5 мкг/мл; фактор роста фибробластов - FGF - 5 нг/мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, более конкретно - тканевой и клеточной трансплантологии, экспериментальной медицины и биологии развития человека. Изобретение включает разработанные прописи сред для культивирования фибробластов человека в присутствие малых (1-2%) концентраций сыворотки ксеногенного, аллогенного и аутогенного (аутологичного) происхождения.

Известно, что диплоидные штаммы клеток животных и человека, полученные из материала первичных культур, демонстрируют ограниченный пролиферативный потенциал и нуждаются в стимуляторах клеточного роста, обеспечивающих рост и размножение таких клеток in vitro [1].

Практика культуральной работы позволила установить, что необходимый набор стимуляторов удается обеспечить путем введения в состав сред экстрактов тканей, биологических жидкостей, - в т.ч. сыворотки периферической крови различного происхождения [2]. Вместе с тем, введение комплексных добавок неопределенного и вариабельного состава способно серьезно модифицировать результаты проводимых на культурах клеток работ [2, 3]. Более того, такие добавки являются потенциальным источником природных патогенов, что делает их использование в медицине особенно проблематичным [4]. Путем решения этих проблем является разработка методов культивирования и сред с низким содержанием таких комплексных добавок [5]. В отношение сывороток, обычное содержание которых в классических прописях сред от 5 до 50%, количество сыворотки снижается до уровня 1-2%. При этом, наряду со снижением себестоимости и решением проблемы доступности необходимых количеств сыворотки, происходит нивелирование вариабельных параметров питательных, ростостимулирующих и цитотоксических свойств конструируемых сред.

Общая тенденция создания сред с пониженным содержанием сыворотки определяет возможность использования аллогенной и аутогенной сывороток человека, что является особо актуальным для клеточной терапии и получения аутотрансплантов для лечения травматических повреждений и дегенеративных заболеваний паренхиматозных органов [5, 6].

Из уровня техники известны патенты, описывающие приготовление питательных сред с малым содержанием сыворотки для культивирования клеток млекопитающих. Патент SU 1735360 Ф1 «Питательная среда для перевиваемых клеток млекопитающих» описывает конструирование питательной среды, содержащей гидролизат казеина в качестве источника пептидов и аминокислот, используемого совместно с поливинилпирролидоном. Содержание сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) в предложенной рецептуре среды составлял 1%. Заявленная рецептура среды обеспечивала ростовые свойства в культуре перевиваемых клеток ВНК-21 (с.13). Патент RU 2107724 С1 «Способ получения жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата» заявляет создание компонентов питательной среды с включением ферментативного гидролизата мышечной ткани рогатого скота с раздельной стерилизацией в сухом виде облучением и последующей реконструкцией. Количество добавляемой сыворотки (СКРС) в используемой среде снижено до 5%. Среда использовалась для культивирования клеток карциномы гортани человека (линия Нер-2). Модифицированный вариант описанного выше патента - RU 2201958 С2 «Сухая стерильная малосывороточная питательная среда для культивирования клеток млекопитающих» заявляет получение многокомпонентной сухой рецептуры среды на основе ферментативного гидролизата мышечной ткани с длительными сроками хранения и резко пониженным содержанием СКРС (до 2%). Среда обеспечивает монослойный способ культивирования клеток линии Нер-2 и суспензионное культивирование клеток лимфомы Беркита.

Следует отметить, что все описанные варианты малосывороточных сред направлены на поддержание и культивирование биотехнологических линий клеток-продуцентов, применимых в вирусологии и фармакологии. Эти линии трансформированных клеток отличаются отсутствием тенденций направленной дифференцировки и неограниченным пролиферативным потенциалом. Состав сред для культивирования диплоидных клеток, изолированных из тканей млекопитающих (фибробласты, кератиноциты, стволовые клетки и специализированные клетки паренхиматозных органов) предполагает исключение компонентов с потенциальными цитотоксическими свойствами, а также введение в их состав дополнительных факторов, управляющих клеточным циклом и цитодифференцировкой.

Патент RU 2370227 С1 «Способ лечения многооскольчатых и множественных переломов длинных трубчатых костей» описывает опыт применения аутогенной сыворотки в качестве оптимальной среды для введения в зону восстановления культуры стволовых клеток костного мозга (СККМ). Аутогенная сыворотка, наряду с наличием специфических и индуцированных травмой ростостимулирующих компонентов исключала риск патогенной контаминации, потенциальной ксенобиологической цитотоксичности и иммунной реакции на чужеродные антигены. Было показано, что использование аутологичной сыворотки больного, приводило к быстрому приживлению СККМ в зоне повреждения, ускоренному образованию первичной костной мозоли и полноценному восстановлению структуры кости и костномозгового канала. Вместе с тем наработку биомассы СККМ проводили по классической методике на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).

Целью настоящего изобретения является создание малосывороточных композиций питательных сред на основе сывороток ксеногенного, аллогенного и аутогенного происхождения для применения в практике клеточной, тканевой трансплантологии и экспериментальной медицины с применением фибробластов и других клеток мезенхимального происхождения.

Технический результат.

Культивирование клеток фибробластов и других клеток мезенхимального происхождения в среде содержащей малые концентрации сыворотки обеспечивает:

- снижение вариабельности состава существенных факторов роста, риска контаминации клеточными патогенами, уменьшение уровня цитотоксичности сред и их потенциальной иммуногенности;

- создание полноценных малосывороточных сред поддержания и ростовых сред для решения разнообразных задач культивирования клеток диплоидных штаммов и тканевых культур;

- создание возможности использования аутогенной сыворотки для культивирования клеток и тканей донора при отсутствии рисков инфекционной контаминации, цитотоксичности и иммунного конфликта;

- существенное удешевление стоимости сред культивирования.

Заявленный технические результаты достигаются за счет того, что ростовая среда для длительного культивирования фибробластов человека состоящая из специальной основы, содержащей глюкозу, органические и неорганические соли, комплекс незаменимых и заменимых аминокислот, липидов, нуклеотидов и витаминов, отличающаяся тем, что содержит пониженную 2%-ную концентрацию ксеногенной (эмбриональной телячьей) сыворотки. Кроме того, в состав среды может быть введено 1 или 2% аллогенной или аутогенной сыворотки периферической крови человека. Кроме того, в состав среды может быть введены белковые стимуляторы клеточного роста: инсулин - 5 мкг/мл; фактор роста фибробластов - FGF - 5 нг/мл.

Культивирование фибробластов человека в среде, содержащей пониженные концентрации сыворотки.

Известно, что клетки диплоидных штаммов фибробластов обладают ограниченным пролиферативным потенциалом и демонстрируют высокую чувствительность к условиям роста in vitro [7, 8]. Культура клеток диплоидного штамма фибробластов неоднородна по составу клеточных элементов и представляет динамичную систему переходящих уровней дифференцировки от профибробластов до зрелых, митотически неактивных форм [9]. Сыворотки крови, использующиеся в качестве комплексной добавки при создании полноценных питательных сред, помимо трофических компонентов содержат необходимые управляющие сигналы для поддержания способных к делению клеток диплоидных штаммов в состоянии клеточного цикла [10].

Основная концепция изобретения состоит в том, что варьирование качественными и количественными характеристиками сыворотки как компонента питательной среды можно создавать среды с различными потенциалами роста (от среды поддержания до ростовой). Более того, качественная замена ксенологичной сыворотки (ЭТС) на человеческую, в свою очередь позволяет получать среды с пониженной иммунореактивностью, вплоть до полной совместимости в случае применения аутологичного варианта. Это создает возможность создания полноценных культуральных сред для использования в области клеточной и тканевой трансплантологии.

Использование дополнительных стимуляторов клеточного роста, в свою очередь, может обеспечить управляемость пролиферативным и дифференцировочным потенциалом конструируемых сред.

Пример 1.

Малосывороточные питательные среды для культивирования фибробластов готовят путем смешивания «Основы среды для фибробластов» с сыворотками периферической крови различного происхождения и, в случае необходимости, дополнительными стимуляторами клеточного роста непосредственно перед использованием среды для пассажа клеток.

Приготовление «Основы среды для фибробластов» осуществляют путем последовательного растворения компонентов (минеральных солей, аминокислот, витаминов, нуклеотидов) квалификации «Для культуры клеток» («Cell Culture Grade») в деионизованной воде. Пропись «Основы среды для фибробластов»:

Компонент	Содержание (мг/л)
Соли и органические вещества
Д-глюкоза		4000
2-аминоэтанол		0,80
Глютатион (reduced)		0,80
Гипоксантин Na в щелочи		2,00
Липоевая кислота в щелочи		0,2
Пируват натрия		110
Ацетат натрия ×3H2O		2,00
Путресцин 2HCl		0,03
NaCl		5950
KCl		400
MgSO4 (безводн)		73,00
Na2HPO4		150,00
NaH2PO 4		54,00
Ca(NO3)2×4H2O		50,00
CaCl2		100

FeNO3×9H2O	0,05
FeSO 4×7H2O	0,04
CuSO4×5H2O	0,001
ZnSO 4×7H2O	0,20
ZnSO4×H2O	0,10
Витамины (готовятся отдельно)
Аскорбиновая кислота	3,00
D-Ca-пантотенат	3,00
Холина хлорид	5,00
i-Инозитол	20,00
Ниацинамид	4,00
Пиридоксал HCl	1,00
Пиридоксин HCl	2,50
Рибофлавин	0,30
Тиамин HCl	3,00
П-аминобензойная к-та	0,25
Bi2	0,30
Фолиевая к-та	3,00
Биотин	0,10
-токоферол фосфат Na2 (в спирте)	0,002
Менадион бисульфат Na 2(в спирте)	0,030
Эргокальцийферол (в спирте)	0,020
Витамин А ацетат (в спирте)	0,020
Нуклеозиды
Рибонуклеозиды
Аденозин	5,00
Цитидин	5,00
Гуанозин	5,00
Тимидин	0,45
Уридин	5,00
Аминокислоты
L-Аланин	10,00

L-Аргинин HCl	137
Глицин	30
L-Гистидин	25,00
L-Изолейцин	88,00
L-Лейцин	88,00
L-Лизин HCl	108
L-Метионин	25,00
L-Фенилаланин	55,00
L-Серин	35,00
L-Треонин	65,00
L-Триптофан	16,00
L-Валин	69,00
L-Аспарагин H2 O	16,00
L-Аспарагиновая кислота	6,00
L-Глутаминовая к-та	7,00
L-Гидроксипролин	5,00
L-Пролин	9,00
L-Цистин 2HCl	59,00
L-Тирозин	59,00
L-Орнитин HCl	0,40
L-Таурин	0,30
L-Аланил-глутамин	330,0
Буферные компоненты
HEPES	1500,0
NaHCO3	2900,0
Феноловый-красный	10,00

После приготовления «Основу среды для фибробластов» подвергают стерилизующей фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм. Фильтрат флаконируют и хранят при температуре 2-8°С в течение года.

Пример 2.

Для приготовления малосывороточных сред на основе сыворотки ксенологичного происхождения использовали стерильную эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС) стандартного качества в 2 вариантах с контролем:

1) для приготовления малосывороточной среды с содержанием ЭТС 1% (по объему) к 99 мл приготовленной как описано в примере 1 «Основы среды для фибробластов» добавляли 1 мл ЭТС и перемешивали встряхиванием;

2) для приготовления малосывороточной среды с содержанием ЭТС 2% (по объему) к 98 мл приготовленной как описано в примере 1 «Основы среды для фибробластов» добавляли 2 мл ЭТС и перемешивали встряхиванием;

3) для приготовления контрольной среды с содержанием ЭТС 10% (по объему) к 90 мл приготовленной как описано в примере 1 «Основы среды для фибробластов» добавляли 10 мл ЭТС и перемешивали встряхиванием.

Проводили сравнительное культивирование клеток диплоидного штамма фибробластов кожи взрослого человека HSF-W58 (15 пассаж) на приготовленных средах в 5 последовательных пассажах. Плотность засеваемой культуры составляла 4×10 ³ клеток/см². Инкубирование клеток проводили в шести луночных культуральных планшетах, изготовленных из полистирола с обработанными рабочими поверхностями площадью 10 см² . Планшеты помещали в CO₂-инкубатор в атмосферу 5% CO₂, при 37°C и влажности 100% и выдерживали в течение 96 часов. После каждого пассажа определяли урожай и морфологию клеток культивированных в каждом изготовленном варианте среды. Результаты сравнительного исследования представлены на Фиг.1, Фиг.5 (а, б, в). Результаты проведенного исследования показали:

1. Уменьшение концентрации добавляемой ксеногенной сыворотки от 10% до 1-2% приводит к снижению пролиферативной активности фибробластов и изменению морфологии клеток, характеризующейся усилением адгезии клеток субстрату, снижением клеточной подвижности и появлением признаков терминальной дифференцировки (для случая 1% ЭТС).

2. Среда, содержащая 2% ксеногенной сыворотки сохраняет ростовые свойства с более низким пролиферативным потенциалом и тенденцией культуры диплоидных клеток к адаптации к малосывороточным условиям культивирования. Клетки HSF-W58 в малосывороточной среде, содержащей 2% ксеногенной сыворотки сохраняют активную морфологию и способны к длительному культивированию и пассированию.

3. Среда, содержащая 1% ксеногенной сыворотки утрачивает ростовые свойства с переходом в разряд поддерживающих сред при отсутствии адаптации клеток к малосывороточным условиям культивирования и гибели культуры. Таким образом, малосывороточная среда, содержащая 2% ксеногенной сыворотки (ЭТС) может быть использована в качестве ростовой среды с умеренными пролиферативными свойствами с целью длительного культивирования фибробластов кожи человека в медицинских исследованиях.

Пример 3.

Для приготовления малосывороточных сред на основе сыворотки аллогенного происхождения использовали сыворотку человека (АлЧС), приготовленную из периферической венозной крови по стандартной методике. 20 мл негепаринизированной венозной крови человека инкубировали 1.5 часа при 37°C, отделяют сгусток от стенок «обведением» и центрифугировали 1500 об/мин 40 мин. Сыворотку отбирали и фильтровали через шприцевой мембранный фильтр с диаметром пор 0.22 мкм. Приготовленную сыворотку использовали для приготовления малосывороточных (АлЧС - 1; 2%) и контрольного (АлЧС - 10%) вариантов сред, как в примере 2.

Проводили сравнительное культивирование клеток диплоидного штамма фибробластов кожи взрослого человека HSF-W58 (15 пассаж) на приготовленных средах в 5 последовательных пассажах как в примере 2. Результаты сравнительного исследования представлены на Фиг.2, Фиг.5 (г, д, е). Результаты проведенного исследования показали:

1. Уменьшение концентрации добавляемой АлЧС от 10% до 1-2% приводит к снижению пролиферативной активности фибробластов и изменению морфологии клеток, характеризующейся усилением адгезии клеток субстрату и снижением клеточной подвижности.

2. Среда, содержащая 1% АлЧС (в отличие от 1% ЭТС) относится к средам поддержания при сохранении основных морфологических признаков клеток фибробластов.

3. Клетки HSF-W58 в малосывороточной среде, содержащей 2% АлЧС сохраняют активную морфологию и способны к длительному культивированию и пассированию с более низким пролиферативным потенциалом чем в классической прописи, содержащей 10% АлЧС.

Таким образом, малосывороточные среды, содержащие 1 и 2% АлЧС могут быть использованы в качестве среды поддержания для длительного сохранения физиологически активной культуры диплоидных клеток фибробластов и ростовой среды с умеренными пролиферативными свойствами, соответственно.

Пример 4.

Для приготовления малосывороточных сред на основе сыворотки аутогенного происхождения (АутЧС) использовали сыворотку человека - донора штамма диплоидных фибробластов, приготовленную как в примере 3.

Приготовленную сыворотку использовали для приготовления малосывороточных (АутЧС - 1; 2%) и контрольного (АутЧС - 10%) вариантов сред, как в примерах 2, 3. Проводили сравнительное культивирование клеток диплоидного штамма фибробластов кожи взрослого человека (15 пассаж) на приготовленных средах в 5 последовательных пассажах как в примерах 2, 3. Результаты сравнительного исследования представлены на Фиг.3, Фиг.5 (ж, з, и).

Результаты проведенного исследования показали, что все тенденции роста фибробластов в малосывороточных средах, приготовленных на основе АутЧС совпадают с таковыми для АлЧС (пример 3).

Таким образом, АутЧС может быть использована для приготовления малосывороточных сред с ростовыми свойствами, характерными для аналогичных сред содержащих АлЧС.

Пример 5.

Готовили малосывороточные среды содержащие 2% ЭТС, АлЧС и АутЧС как описано в примерах 2, 3, 4. Перед применением в состав сред вносили коммерческие препараты рекомбинантных стимуляторов роста клеток:

- инсулин человеческий рекомбинантный - 5 мкг/мл;

- человеческий рекомбинантный фактор роста фибробластов основной (FGF-b) - 5 нг/мл.

Проводили сравнительное культивирование клеток диплоидного штамма фибробластов кожи взрослого человека HSF-W58 (15 пассаж) на приготовленных средах в 5 последовательных пассажах как в примерах 2, 3, 4. Результаты сравнительного исследования представлены на Фиг.4, Фиг.5 (к, л, м). Результаты проведенного исследования показали:

1. Малосывороточные среды, приготовленные с использованием сывороток различного происхождения (ЭТС, АлЧС, АутЧС) и дополнительные стимуляторы роста клеток демонстрируют высокие ростовые свойства. 2. Пролиферативный потенциал малосывороточных сред содержащих АлЧС и АутЧС и рекомбинантные белковые стимуляторы роста клеток на 15-20% превосходит показатели среды содержащей сыворотку ксенологичного происхождения (ЭТС). Таким образом, введение дополнительных стимуляторов роста клеток (инсулин - 5 мкг/мл; FGF-b-SHr/мл) в состав ростовых малосывороточных сред, содержащих 2% ксеногенной, аллогенной или аутогенной сыворотки значительно усиливает пролиферативный потенциал этих сред. Малосывороточные среды, содержащие дополнительные стимуляторы роста клеток могут быть использованы в практике клеточных технологий в качестве ростовых сред с повышенными пролиферативными свойствами.

Источники информации

1. Sharla М.O. et al. // Methods Mol Biol., V.371, 9-19, 2007.

2. Дьяконов Л.П. // Сб. «Животная клетка в культуре», М.: «Спутник+», -656, 2009.

3. Gstraunthaler G. // ALTEX, V.20, 275-281, 2003.

4. Megha S. Even et al. // Trends in Biotechnology, Vol.24, № 3, 105-108, 2006.

5. Chua K.H. et al. // Eur. Cells and Materials, Vol.9, 58-67, 2005.

6. Шумаков В.И. и др.// Вестник трансплантологии и искусственных органов, № 4, 94-102, 2006.

7. Hayflick L. // Exp. Cell Res., V.37, 614-636, 1965.

8. Егоров E.E. и др.// Биол. Мембраны, Т. 22, 458-465, 2005.

9. Бозо И.Я. и др.// Цитология, Т.52, № 2, 99-109, 2010.

10. Lambert К. and Pirt S.J. // J. Cell Sci, V.35, 381-392, 1979.