способы созревания фолликулов яичника in vitro

Формула изобретения

1. Способ созревания и/или активации in vitro овариальных фолликулов и ооцитов, включающий в себя применение ингибиторов PTEN.

2. Способ по п.1, где овариальные фолликулы представляют собой нерастущие фолликулы, такие как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы.

3. Способ по п.1, где зрелые ооциты дополнительно применяют для оплодотворения in vitro.

4. Способ по п.1, где овариальные фолликулы или ооциты являются человеческими.

5. Способ по п.1, где овариальные фолликулы или ооциты получают от животного.

6. Способ по любому из пп.1-5, где ингибитор PTEN выбирают из:

Биспероксо(бипиридин)оксованадата,

Биспероксо(1,10-фенантролин)оксованадата,

Биспероксо(пиколинато)оксованадата,

Биспероксо(5-гидроксипиридин-2-карбоксил)оксованадата,

Ди-(пиколинат)оксованадата,

Ди-(3-гидроксипиколинат)оксованадата,

Биспероксо(фенилбигуанид)оксованадата,

Ди-(фенилбигуанид)оксованадата и

Биспероксо(изохинолинкарбоновой кислоты)оксованадата.

7. Способ созревания in vitro ооцита, который включает в себя активацию фолликулов по п.1.

8. Способ оплодотворения in vitro, включающий в себя имплантацию эмбриона, нуждающегося в этом, где указанный эмбрион получают посредством способа, включающего в себя обработку зрелого ооцита семенной жидкостью, где указанный ооцит получают посредством способа по п.7.

9. Способ идентификации соединений, которые потенциально могут быть использованы для созревания in vitro овариальных фолликулов и/или ооцитов, причем способ включает в себя измерение способности соединения действовать как ингибитор PTEN.

10. Применение одного или более ингибиторов PTEN для получения лекарственного средства для применения при улучшении созревания in vitro овариальных фолликулов и ооцитов и для применения в активации in vitro нерастущих фолликулов, таких как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы.

11. Применение по п.10, где ингибитор PTEN выбирают из:

Биспероксо(бипиридин)оксованадата,

Биспероксо(1,10-фенантролин)оксованадата,

Биспероксо(пиколинато)оксованадата,

Биспероксо(5-гидроксипиридин-2-карбоксил)оксованадата,

Ди-(пиколинат)оксованадата,

Ди-(3-гидроксипиколинат)оксованадата,

Биспероксо(фенилбигуанид)оксованадата,

Ди-(фенилбигуанид)оксованадата и

Биспероксо(изохинолинкарбоновой кислоты)оксованадата.

12. Фармацевтическая композиция, содержащая один или более ингибиторов PTEN для активизации созревания in vitro овариальных фолликулов и ооцитов и для активации in vitro нерастущих фолликулов, таких как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы.

13. Фармацевтическая композиция по п.12, где ингибитор PTEN выбирают из:

Биспероксо(бипиридин)оксованадата,

Биспероксо(1,10-фенантролин)оксованадата,

Биспероксо(пиколинато)оксованадата,

Биспероксо(5-гидроксипиридин-2-карбоксил)оксованадата,

Ди-(пиколинат)оксованадата,

Ди-(3-гидроксипиколинат)оксованадата,

Биспероксо(фенилбигуанид)оксованадата,

Ди-(фенилбигуанид)оксованадата и

Биспероксо(изохинолинкарбоновой кислоты)оксованадата.

14. Композиция по пп.12 и 13, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемые носитель, эксципиент или разбавитель.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам, используемым для созревания in vitro овариальных фолликулов и ооцитов. Более конкретно, изобретение касается применения ингибиторов фосфатазы PTEN в способах для созревания in vitro овариальных фолликулов и ооцитов.

Предшествующий уровень техники

Стимуляция активации овариальных фолликулов для достижения созревания является высоко желательной с точки зрения исследовательской перспективы, но также в многочисленных областях применения. Примордиальные (зачаточные) фолликулы могли бы служить источником ооцитов для оплодотворения in vitro, но способность использования активированных и созревших овариальных фолликулов для других применений, например, после химиотерапевтического или лучевого лечения рака, является также чрезвычайно важной. Однако, отсутствие в настоящее время средств для активации примордиальных фолликулов означает, что возможный жизненно важный источник ооцитарного материала остается неиспользованным. В свете дискуссии, касающейся оплодотворения in vitro, такие соображения являются все более и более важными.

Клинически, если примордиальные фолликулы женщины не могут начать расти, то есть активироваться из состояния покоя, ее фолликулы не будут откликаться на гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). Следовательно, женщина является бесплодной, и она не может использовать свои собственные ооциты для оплодотворения in vitro. В настоящее время, как упоминалось выше, отсутствует технология для использования примордиальных фолликулов как источников ооцитов для оплодотворения in vitro. Таким образом, в данной области техники имеется необходимость в разработке способов для стимуляции активации и созревания либо in vivo и/или in vitro овариальных фолликулов для различных применений.

Предшествующий уровень описывает липидкиназы, а именно, фосфатидилинозит-3-киназы (PI3Ks), которые фосфорилируют 3'-OH группу в инозитном цикле инозитсодержащих фосфолипидов. PTEN (фосфатаза и гомолог тензина с делецией по десятой хромосоме), фосфатаза липидов, поворачивает этот процесс в обратном направлении и, таким образом, функционирует как основной отрицательный регулятор действия PI3K (Cantley, Science 2002, 296: 1655-1657).

Краткое описание изобретения

Авторы настоящего изобретения идентифицировали PTEN как фактор, который подавляет активацию примордиальных фолликулов. В мышиной модели с ооцит-специфической делецией гена Pten, все примордиальные фолликулы были преждевременно активированы.

Соответственно, настоящее изобретение предоставляет способы активации и созревания in vitro овариальных фолликулов и ооцитов, включающие в себя, применение одного или более ингибиторов PTEN. Способы могут применяться для активации фолликулов во время созревания in vitro фолликулов и ооцитов для оплодотворения in vitro. Фолликулы могут представлять собой нерастущие фолликулы, такие как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы.

Способ может включать в себя инкубацию фолликулов и/или ооцитов в физиологически приемлемой среде, содержащей один или более ингибиторов PTEN. Среда может дополнительно содержать гонадотропин, такой как ФСГ и/или CG.

Продолжительность инкубации может иметь любое время, которое является достаточным для получения активации и/или созревания овариальных фолликулов и/или ооцитов.

Ингибитор PTEN может присутствовать в любой концентрации, обеспечивающей активацию и/или созревание овариальных фолликулов и/или ооцитов, такой как концентрация в интервале от 1 нМ до 1,0 мМ, особенно от 1,0 до 100 мкМ.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активация и/или созревание овариальных фолликулов и/или ооцитов включает в себя следующие стадии: (i) получение подходящих клеток и/или органов для активации и/или созревания овариальных фолликулов и/или ооцитов из подходящего пациента, (ii) культивирование указанных клеток и/или органов во влажной камере, например, при температуре, равной по существу 37ºС, и приблизительно 5% СО₂, (iii) инкубацию клеток и/или органов кратковременно или непрерывно с ингибитором PTEN, в интервале концентрации от 1 нМ до 1,0 мМ, предпочтительно от 1,0 до 100 мкМ, чтобы индуцировать активацию и/или созревание указанных овариальных фолликулов и/или ооцитов и (iv) использование полученного материала в соответствии с объемом притязаний изобретения.

Способы в соответствии с изобретением могут быть применены к человеческим фолликулам или фолликулам, полученным от животных, таких как домашнее или находящееся под угрозой исчезновения животное. Домашнее животное может, например, представлять собой лошадь, корову, свинью, кошку, собаку.

Изобретение дополнительно предоставляет применение одного или более ингибиторов PTEN в производстве лекарственного средства для применения в улучшении созревания in vitro овариальных фолликулов и ооцитов, особенно при активации in vitro нерастущих фолликулов, таких как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы.

Изобретение дополнительно предоставляет композицию, содержащую один или более ингибиторов PTEN для активизации созревания in vitro овариальных фолликулов и ооцитов, особенно при активации in vitro нерастущих фолликулов, таких как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы. Композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носитель, эксципиент или разбавитель.

Ингибиторы PTEN описаны в WO 2005/097119 и соответствующей заявке США 10/599,748, WO 2004/075897 и соответствующей заявке США 10/546,632, которые все включены в данный документ посредством ссылки.

Ингибиторы PDZ-доменных взаимодействий, особенно взаимодействий между PDZ-доменами в ассоциированных с PTEN MAGIs (мембран-ассоциированных гуанилаткиназных белков с обращенной ориентацией), могут применяться в качестве ингибиторов активности PTEN в соответствии с изобретением. Такие ингибиторы описаны в WO 2004/092346, Патенте США № 7141600, WO 2006/07542, которые все включены в данный документ посредством ссылки.

Было показано, что комплексы пероксованадия являются сильнодействующими ингибиторами PTEN (Schmid et al. FEBS Lett 2004, 566: 35-38; Rosivatz et al. ACS Chem Biol 2006, 1: 780-790).

Синтез комплексов пероксованадия может быть осуществлен, как описано Shaver et al. (Inorg Chem 1993, 32:3109-3113), Rosivatz et al. (ACS Chem Biol 2006, 1: 780-790) и Posner et al. (J Biol Chem 1994, 269: 4596-604).

Примеры соединений, которые могут применяться в соответствии с изобретением, представляют собой;

bpV(bipy), Биспероксо(бипиридин)оксованадат (V) калия, K[VO(O ₂)₂C₁₀H₈N₂];

bpV(phen), Биспероксо(l,10-фенантролин)оксованадат (V) калия, K[VO(O₂)₂C_I2H ₈N₂];

bpV(pic), Биспероксо(пиколинато)оксованадат (V) дикалия, K₂[VO(O₂)₂C ₆H₄NO₂];

bpV-HOpic, Биспероксо(5-гидроксипиридин-2-карбоксил)оксованадат (V) дикалия, K₂[VO(O₂)₂C₆H ₄NO₃];

VO-pic, Ди-(пиколинат)оксованадат (IV), VOC₁₀H₁₀NO₄;

VO-OHpic, Ди-(3-гидроксипиколинат)оксованадат (IV), VOC₁₀ H₁₀NO₆;

bpV-biguan, Биспероксо(фенилбигуанид)оксованадат (V) калия, K[VO(O₂)₂C₈H ₁₁N₅];

VO-biguan, Ди-(фенилбигуанид)оксованадат (IV), VOC₁₆H₂₀N₁₀;

bpV-isoqu, Биспероксо(изохинолинкарбоновой кислоты)оксованадат (V) дикалия, K₂[VO(O₂)₂C ₁₀H₇NO₂];

соединения формулы

где

R представляет собой циклоалкильную группу,

A представляет собой низшую алкиленовую группу,

и связь между 3- и 4-положениями карбостирильного ядра означает одинарную связь или двойную связь;

производное аскорбиновой или производное дегидроаскорбиновой кислоты, выбранное из следующих:

или

где

R1 представляет H, C1-C3 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_n COXR3, (CH₂)_nXCOR3, (CH₂) _nCOR3, (CH₂)_nSO₂R3, (CH ₂)_nXR3, (CH₂)_nSO₂ XR3, (CH₂)_nXSO₂R3, (CH₂ )_nNR3R4 или (CH₂)_nCO(CH ₂)_mXR3;

R2 представляет H, C1-C3 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_nCOXR3, (CH ₂)_nXCOR3, (CH₂)_nCOR3, (CH₂)_nSO₂R3, (CH₂ )_nXR3, (CH₂)_nSO₂XR3, (CH₂)_nXSO₂R3, (CH₂ )_nNR3R4 или (CH₂)_nCO(CH ₂)_mXR3;

R3, R5, R6 независимо представляют собой H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R4 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, NHSO₂ R5, NHCO₂R5 или NR5R6;

m = от 0 до 3; n = от 0 до 3; и X представляет O или NR4;

соединения в соответствии с формулой

где

R1 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, C0XR2, COR2, SO₂XR2, SO ₂R2;

R2 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_nCOXR4, (CH₂ )_nXCOR4, (CH₂)_nXR4, (CH ₂)_nSO₂XR4, (CH₂)_n XSO₂R4, NHSO₂R4, NHCOR4, NHCO₂ R4, NHCOCO₂R4 или NR4R5;

R3 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_n COXR4, (CH₂)_nXCOR4, (CH₂) _nXR4, (CH₂)_nSO₂XR4, (CH ₂)_nXSO₂R4, NHSO₂R4, NHCOR4, NHCO₂R4, NHCOCO₂R4 или NR4R5;

R4 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R5 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, NHSO₂ R6, NHCOR6, NHCO₂R6, NR6R7 или N=C(R6R7);

R6 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R7 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

n = от 0 до 3; и X представляет О или NR5;

соединения в соответствии с формулой

где

A представляет собой пяти- или шестичленное кольцо; R1 представляет H, C1-C3 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_nCOXR3, (CH₂ )_nXCOR3, (CH₂)_nCOR3, (CH ₂)_nSO₂R3, (CH₂)_n XR3, (CH₂)_nSO₂XR3, (CH₂ )_nXSO₂R3, NHSO₂R3, NHCO ₂R3, NHCOR3, NHCOCO₂R3, NR3R4 или (CH₂ )_nCO(CH2)_mX3;

R2 представляет H, C1-C3 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_n COXR3, (CH₂)_nXCOR3, (CH₂) _nCOR3, (CH₂)_nSO₂R3, (CH ₂)_nXR3, (CH₂)_nSO₂ XR3, (CH₂)_nXSO₂R3, NHSO ₂R3, NHCO₂R3, NHCOR3, NHCOCO₂R3, NR3R4 или (CH₂)_nCO(CH2)_mX3;

R3 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R4 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, NHSO₂R5, NHCO₂R5 или NR5R6;

R5 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R6 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

n=0-3; m=0-3; и X представляет O или NR4;

кольцо A может быть насыщенным, ненасыщенным или ароматическим и может необязательно содержать N и О;

соединения в соответствии с формулой

где

R1 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_nCOXR3, (CH ₂)_mXCOR3, (CH₂)_mXR3, (CH ₂)_nCOR3, (CH₂)_mSO ₂XR3 или (CH₂)_mXSO₂R3;

R2 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R3 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R4 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, NHSO₂R5, NHCO₂R5, N=C(R5R6) или NR5R6;

R5 представляет H, C1-C4 алкил, арил, или алкиларил;

R6 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

m=1-3; n=0-3; и X представляет O или NR4;

замещенные 1,10-фенантролин-5,6-дионы формулы:

где

R1 представляет O, C1-C4 алкил, (CH₂)_nCOXR2, (CH₂ )_nXCOR2, (CH₂)_nXR2, (CH ₂)_nCOR2, (CH₂)_nSO ₂XR2, (CH₂)_nXSO₂R2 или (CH₂)_nSO₂R2;

R2 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, NHSO₂ R4, NHCOR4, NHCO₂R4, NHCOCO₂R4 или NR4R5;

R3 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, NHSO₂R4, NHCOR4, NHCO₂R4, NHCOCO₂ R4 или NR4R5;

R4 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R5 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R6 в каждом случае независимо выбирают из водорода, галогена, NO₂, R4R10, C1-C4 алкила, NH(CH₂)_pCO(CH₂) _qXR2, (CH₂)_PCOXR2, (CH₂ )_PXCOR2, (CH₂)_PXR2, (CH ₂)_PCOR2, (CH₂)_PSO ₂XR2 или (CH₂)_PXSO₂R2;

R7 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, SO₂R4, NHSO₂R4, NHCO₂R4 или NR8R9;

R8 представляет независимо H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_nCOXR2 или (CH ₂)_nXR2;

R9 представляет независимо H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_n COXR2, (CH₂)_nXR2, (CH₂) _pCOXR2, (CH₂)_PXCOR2, (CH₂ )_PXR2, (CH₂)_PCOR2, (CH₂ )_pSO₂XR2, (CH₂)_PXSO ₂R2 или (CH₂)_PSO₂R2;

R10 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, SO₂R4, NHSO₂R4, NHCO₂R4 или NR8R9;

m представляет независимо 0 или 1; n=1-5; p=0-5; q=0-5; X представляет O или NR3; и Z представляет О или NR7;

замещенные фенантрен-9,10-дионы формулы:

где

R1 представляет H, NO₂, NR5R6, галоген, циано, алкил, алкиларил, карбонил, карбокси, COR2 или CONR5R6;

R2 и R3 представляют независимо H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R4 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, SO₂ R2, NHSO₂R2, NHCOR2, NHCO₂R2, N=CR2R3 или NR5R6;

R5 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_nCOXR2, (CH₂)_n XR2, (CH₂)_nCO(CH₂)_m XR2, SO₂R2, (CH₂)_nCO(CH ₂)_nCOXR2 или (CH₂)_nCOR2;

R6 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_nCOXR2, (CH₂)_n XR2, (CH₂)_nCO(CH₂)_m XR2, S0₂R2, (CH₂)_nCO(CH ₂)_nCOXR2 или (CH₂)_nCOR2;

m=0-3; n=0-3; и X представляет CR2R3, O или NR4;

соединения формулы:

где

R1 представляет H, NO₂, NR5R6, галоген, циано, алкил, алкиларил, карбонил, карбокси, COR2, CONR5R6, SO₃R2 или SO₂NR2 R3;

R2 и R3 представляют независимо H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R4 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, SO₂R2, NHSO₂ R2, NHCOR2, NHCO₂R2, N=CR2R3 или NR5R6;

R5 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂ )_nCOXR2, (CH₂)_nXR2, (CH ₂)_nCO(CH₂)_mXR2, SO ₂R2, (CH₂)_nCO(CH₂) _nCOXR2 или (CH₂)_nCOR2;

R6 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂ )_nCOXR2, (CH₂)_nXR2, (CH ₂)_nCO(CH₂)_mXR2, S0 ₂R2, (CH₂)_nCO(CH₂) _nCOXR2 или (CH₂)_nCOR2;

m=0-3; n=0-3; и X представляет CR2R3, O или NR4;

замещенные фенантрен-9-олы формулы:

где

R1 представляет H, NO₂, NR5R6, галоген, циано, алкил, алкиларил, карбонил, карбокси, COR2 или CONR5R6;

R2 и R3 представляют независимо H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R4 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, SO₂ R2, NHSO₂R2, NHCOR2, NHCO₂R2, N=CR2R3 или NR5R6;

R5 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_nCOXR2, (CH₂ )_nXR2, (CH₂)_nCO(CH₂ )_mXR2, SO₂R2, (CH₂)_n CO(CH₂)_nCOXR2 или (CH₂) _nCOR2;

R6 представляет H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_nCOXR2, (CH₂ )_nXR2, (CH₂)_nCO(CH₂ )_mXR2, S0₂R2, (CH₂)_n CO(CH₂)_nCOXR2 или (CH₂) _nCOR2;

m=0-3; n=0-3; и X представляет CR2R3, O или NR4;

замещенные нафталин-l,2-дионы формулы:

где

R1 представляет H, NO₂, NR3R4, галоген, циано, алкил, алкиларил, карбонил, карбокси, (CH₂)_nCOXR3, COR2, SO₃ R2, SO₂NR3R4, NHSO₂R3, NHCO₂ R3, NHCOR3, NHCOCO₂R3, NR3R4 или CONR3R4;

R2 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R3 и R4 представляют независимо H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_nCOXR2, (CH₂)_n OR2 или (CH₂)_nCO(C ₂)_mXR2;

m=0-3; n=0-3; и X представляет O или NR2;

замещенные нафталин-1,4-дионы формулы:

где

R1 представляет H, NO₂, NR3R4, галоген, циано, алкил, алкиларил, карбонил, карбокси, (CH₂)_nCOXR3, COR2, SO₃ R2, SO₂NR3R4, NHSO₂R3, NHCO₂ R3, NHCOR3, NHCOCO₂R3, NR3R4 или CONR3R4;

R2 представляет H, C1-C4 алкил, арил или алкиларил;

R3 и R4 представляют независимо H, C1-C4 алкил, арил, алкиларил, (CH₂)_nCOXR2, (CH₂)_n OR2 или (CH₂)_nCO(C ₂)_mXR2;

m=0-3; n=0-3; и X представляет O или NR2; и

соединения, имеющие формулу

или

где n равно 0, 1 или 2;

X1 представляет собой NH, N(CH₃), CH₂, CH(CH₃), C(CH₃)₂, O, S, S(O) или SO₂;

R0 выбирают из группы, состоящей из C1-C3 алкила, циклопропила, гало, OR5 и S(O)_mR5, в котором m равно 0, 1 или 2;

R1 и R2 независимо выбирают из группы, состоящей из C2-C8 алкенила, фенилциклопропила, фенилпропенила, R6-X2-C(R8)(R8)-R7-, R6-X2-N(R8)-R7- и R10X3R7-;

R3 и R4 независимо представляют собой водород, метил или этил:

R5 представляет собой метил или этил;

R6 выбирают из группы, состоящей из водорода, C1-Cl0 алкила, арила, W, Y, NH₂, NHCONR3R4, NHCOOR3 и NHSO ₂R9;

R7 выбирают из группы, состоящей из прямой связи, алкильной группы, имеющей от 1 до 10 атомов углерода, арила, -(NH)_p(CH₂CH₂O)_q (NH)_p-, в котором p равен 0 или 1, а q является целым числом от 1 до 4, и W;

R8 выбирают из группы, состоящей из H, Y, OH, -NHCONR3R4; -NHCOOR3; -NHSO₂ R9, -(CH₂)_rCO₂R3 и (CH₂ )_rCONR3R4, в которых r является целым числом от 1 до 3;

R9 представляет собой арил или C1-C6 алкил;

R10 выбирают из Cl-Cl0 алкила, арила и W;

X2 выбирают из группы, состоящей из прямой связи, -NH-, -N(CH ₃)-, -NCONR3R4, -NCOOR3 и -NSO₂R9;

X3 выбирают из О, S, SO и SO₂;

X4 выбирают из -CH-, C-галогена, -C(CH₃) или -C(C ₂H₅);

W представляет собой насыщенную карбоциклическую или гетероциклическую группу;

Y выбирают из группы, состоящей из COOH, COOR3, CONR3R4, CONHSO ₂R5, гидроксиметила, -CH₂COOH, CH₂ CONR3R4; и 5-тетразолила;

Z представляет собой -CH₂-, -CH(CH₃)-, -C(CH₃) ₂- или -CO-;

Антисмысловые олигонуклеотиды и двухцепочечная РНК, нацеленные на нуклеиновые кислоты, кодирующие PTEN, могут применяться в качестве ингибиторов PTEN в соответствии с изобретением. Такие соединения описаны в WO 01/07457 и WO 01/90341, WO 2004/27030 и WO 2004/63329 и соответствующих патентах США № № 6020199 и 6284538, которые все включены в данный документ посредством ссылки. Антитела и/или фрагменты антител, действующие как ингибиторы, специфичные для PTEN, также находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Изобретение дополнительно предоставляет способы для идентификации соединений, которые потенциально могут использоваться для активации in vitro примордиальных фолликулов. Способ включает в себя измерение способности соединения действовать как ингибитор активности PTEN.

Активность PTEN может быть измерена по высвобождению фосфата, как описано у Schmid et al (FEBS Lett 2004, 566: 35-38). По существу, ферментативную активность рекомбинантной PTEN измеряют в 200 мМ Трис, pH 7,4, содержащем 50 нг/мкл БСА, 150 мкМ синтетического дипальмитоил-PtdIns(3,4,5)P3 (Cell Signals) и 0,25% (м/о) октилгликозида (Sigma) при 30°C в течение 30 мин. Для остановки ферментативной реакции, в аналитическую среду добавляют 0,7 об. окрашивающего реагента (2,3 мг/мл малахитового зеленого в 3,6 M HCl и 17 мМ молибдата аммония). Смеси дают проявиться в течение 20 мин и измеряют поглощение при 625 нм.

Соединение определяют как ингибитор PTEN, если соединение имеет IC50 меньшее, чем 100 мкМ, предпочтительно IC50 меньшее, чем 10 мкМ или даже более предпочтительно IC50 меньшее, чем 1 мкМ.

Функция ингибитора PTEN может быть подтверждена посредством измерения увеличенной активности PI3 киназы в присутствии PTEN, активность PI3 киназы может также быть измерена по уровню фосфорилирования Akt на серине 473.

Изобретение дополнительно предоставляет способы созревания ооцита in vitro, который включает в себя активацию примордиальных фолликулов в соответствии со способами изобретения.

Изобретение также предоставляет способы оплодотворения in vitro, включающие в себя имплантацию эмбриона, нуждающегося в этом, где указанный эмбрион получают посредством способа, включающего в себя обработку зрелого ооцита семенной жидкостью, где указанный ооцит получают посредством способа, который включает в себя активацию примордиальных фолликулов в соответствии со способами изобретения.

Изобретение дополнительно предоставляет способы улучшения развития эмбриона после оплодотворения in vitro или перенос эмбриона в женскую особь млекопитающего, включающие в себя имплантацию в женскую особь млекопитающего эмбриона, полученного из ооцита, где указанный ооцит получают посредством способа, который включает в себя активацию примордиальных фолликулов в соответствии со способами изобретения.

Изобретение дополнительно предоставляет способы активации и созревания in vivo овариальных фолликулов и ооцитов, включающие в себя введение композиции, содержащей один или более ингибиторов PTEN. Предпочтительно, введение осуществляют посредством местной инъекции, более предпочтительно посредством интрафолликулярной или интрабурсальной инъекции. Фолликулы могут представлять собой нерастущие фолликулы, такие как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы. Способы могут быть применены к людям или животным, таким как домашние животные или вымирающие животные. Домашнее животное может, например, представлять собой лошадь, корову, свинью, кошку, собаку.

Местная инъекция может быть сделана с помощью лапароскопии или ультразвука.

Изобретение дополнительно предоставляет применение одного или более ингибиторов PTEN в производстве лекарственного средства для применения в активации и созревании in vivo овариальных фолликулов и ооцитов посредством, конкретно, активации in vivo нерастущих фолликулов, таких как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы. Композиция может быть предназначена для введения посредством местной инъекции или других типов местной доставки, предпочтительно посредством интрафолликулярной или интрабурсальной инъекции. Композиция может быть предназначена для применения на людях или ветеринарного использования.

Изобретение дополнительно предоставляет композицию, содержащую один или более ингибиторов PTEN для применения в активации и созревании in vivo овариальных фолликулов и ооцитов, конкретно в активации in vivo нерастущих фолликулов, таких как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы. Композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. Композиция может быть получена в виде готовой лекарственной формы для местной инъекции, предпочтительно для интрафолликулярной или интрабурсальной инъекции. Композиция может быть предназначена для применения на людях или ветеринарного использования.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Сверхактивация примордиальных фолликулов у мышей с ооцитами, лишенными PTEN

Яичники от мышей возрастом 35 дней, погружали в парафин и получали сегменты толщиной 8 мкМ, и окрашивали их гематоксилином А. Контрольные мыши: Примордиальные фолликулы у контрольных обычных мышей (стрелка на вставке) B-C. Мыши, лишенные PTEN в ооцитах. В ооцитах, лишенных PTEN, все фолликулы вырастают преждевременно (C, стрелки), и весь яичник является значительно более крупным (B).

Фигура 2. Усиленная передача сигнала Akt в ооцитах Pten^loxP/loxP; GCre+

Ооциты выделяли из яичников мышей Pten^loxP/loxP; GCre+ и Pten^loxP/loxP на ПД5 и ПД12-14 и проводили вестерн-блоттинги. (A) Уровни p-Akt (серин 473) и общего Akt на ПД12-14 в ооцитах Pten^loxP/loxP; GCre+ и Pten^loxP/loxP. (B) Активация Akt (p-Akt, серин 473) посредством обработки лигандом Kit (KL) (100 нг/мл, 2 мин) ооцитов Pten^loxP/loxP; GCre+ и Pten^loxP/loxP на ПД12-14. Уровни Akt применяли в качестве внутренних контролей. (C) Исследования сигнальной передачи в ооцитах Pten^loxP/loxP; GCre+ и Pten ^loxP/loxP на ПД5 и ПД12-14, показывающие уровни p-Akt (серин 473), rpS6, p-rpS6 (серин 235/6), p-mTOR (серин 2448), p-TSC2 (треонин 1462) и p-S6K (треонин 389). Уровни общего содержания Akt, mTOR, TSC2, S6K и -актина использовали в качестве внутренних контролей. Все эксперименты повторяли по меньшей мере 3 раза. Для выделения ооцитов ПД5 для вестерн-блоттинга, 10-15 мышей Pten^loxP/loxP ; GCre+ или Pten^loxP/loxP использовали для каждой дорожки. Для выделения ооцитов ПД12-14, 3-5 мышей Pten^loxP/loxP ; GCre+ или 6-10 мышей Pten^loxP/loxP использовали для каждой дорожки. На каждую дорожку загружали 30-40 мкг белкового образца.

Фигура 3. Ингибитор PTEN инициирует выживаемость и развитие примордиальных фолликулов в культивируемых мышиных яичниках

Мышиные яичники на день 4 постнатального периода, содержащие примордиальные фолликулы, культивировали в течение 8 дней с носителем (A) или ингибитором PTEN bpv (Hopic) (B). Ингибитор PTEN увеличивал выживаемость фолликулов в культивируемых яичниках (стрелки на B по сравнению со стрелками на A, указывая на устранение некроза в яичниках, обработанных ингибитором PTEN); также ингибитор PTEN стимулирует пролиферацию и дифференциацию сплющенных прегранулезных клеток (наконечники стрелок, A) в кубовидные гранулезные клетки (наконечники стрелок, B), что является незаменимой стадией для активации примордиальных фолликулов в стадию роста.

Подробное описание изобретения

В настоящее время, если примордиальные фолликулы животного или человека культивируют in vitro, очень трудным для них является инициировать их рост и проходить созревание. В соответствии с настоящим изобретением, в присутствии ингибиторов PTEN, примордиальные фолликулы от человека или домашних/исчезающих животных могут быть активированы in vitro, т.е. рост примордиальных фолликулов будет инициирован. Эти активированные фолликулы могут затем культивироваться дополнительно, до их созревания, и их можно применять для оплодотворения in vitro.

Этот способ предназначен для культивирования срезов яичников, содержащих примордиальные фолликулы от человека или домашних/исчезающих животных, с временной (преходящей) обработкой одним или более ингибиторами PTEN, для инициации их роста. Как только рост фолликулов будет индуцирован, действие ингибиторов PTEN будет прекращено, в дальнейшем фолликулярная культура будет поддерживаться рутинным образом с применением доступных в настоящее время методов.

Этот способ является применимым для женщин, примордиальные фолликулы которых не могут быть активированы природным образом, или для женщин, которым предстоит перенести химиотерапию или лучевую терапию в случае раковых заболеваний. Этот способ может также применяться для активации in vitro примордиальных фолликулов домашних или исчезающих животных для увеличения ресурсов фолликулов, а также степени успеха оплодотворения in vitro.

Эффективная супрессия активности PTEN в культивируемых срезах яичника может отслеживаться с использованием срезов мышиных яичников, которые культивируют в то же время.

Примеры

Пример 1. Функциональные роли ооцитарного пути PI3K в фолликулярной активации у млекопитающих

Для исследования функциональных ролей ооцитарного пути P13K в фолликулярной активации у млекопитающих ген Pten был подвергнут делеции из мышиных ооцитов посредством скрещивания мышей Pten ^loxP/loxP (Groszer et al., Science 2001, 294:2186) с трансгенными мышами, экспресирующими фактор дифференциации роста 9 (Gdf-9) промотор-опосредованной Cre рекомбиназы (обозначенными как мыши GCre), который активен особенно в ооцитах (Lan et al. Biol. Reprod. 2004, 71: 1469). Было обнаружено, что во время периода тестирования, составляющего от 6 до 34 недель возраста, самки Pten^loxP/loxP ; GCre+, т.е. мыши, с отсутствием PTEN в их ооцитах, производили максимум один выводок, но становились бесплодными в период раннего взросления (т.e. после 12-13 недель возраста жизни). Для исследования того, как потеря Pten из ооцитов затрудняет фертильность мышей, авторы сравнили первую волну постнатального фолликулярного развития у Pten^loxP/loxP; GCre+ и контрольных (Pten^loxP/loxP ) мышей. Никакого явного морфологического различия на постнатальный день (ПД)5 у яичников Pten^loxP/loxP; GCre+ и контрольных мышей не было обнаружено. Яичники обоих генотипов имели в основном примордиальные фолликулы, содержащие малые ооциты, окруженные сплющенными прегранулозными клетками и некоторые активированные фолликулы, содержащие укрупненные ооциты, в сравнимых количествах. На ПД 35, яичники Pten^loxP/loxP; GCre+ (Фигура 1, B) оставались крупнее, чем контрольные яичники, и содержали существенно больше активированных фолликулов (Фигура 1, C). Фактически, в мутантных яичниках не смогли идентифицировать никаких примордиальных фолликулов, в то время как основное количество фолликулов в контрольных яичниках все еще находилось на примордиальной стадии. Следовательно, полный пул примордиальных фолликулов был активирован в яичниках Pten^loxP/loxP; GCre+.

Таким образом, активация пула примордиальных фолликулов прекращается вместе с истощением фолликулов. Это вызывает POF (преждевременную овариальную недостаточность) у мышей Pten^loxP/loxP; GCre+. Фенотип, наблюдаемый у этих мышей, сходен с фенотипом человеческого POF (Beck-Peccoz and Persani, Orphanet. J. Rare. Dis. 2006, 1: 9). Для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе ускоренного укрупнения ооцитов в яичниках Pten^loxP/loxP$ GCre+, исследовали передачу сигналов Akt в ооцитах, выделенных из яичников Pten^loxP/loxP; GCre+ и контрольных мышей на ПД12-14. Было обнаружено, что уровень фосфо-Akt (p-Akt, серин 473) был повышен в ооцитах Pten^loxP/loxP; GCre+, которые культивировали in vitro и испытывали недостаток сыворотки (Фигура 2A). Дополнительно, лиганд Kit (KL), который может активировать путь PI3K в растущих ооцитах посредством его ооцитарного поверхностного рецептора Kit (Reddy et al. Dev. Biol. 2005, 281: 160), активировал Akt в большей степени в ооцитах Pten^loxP/loxP; GCre+, чем в контрольных ооцитах (Фигура 2 2B). Таким образом, потеря Pten в ооцитах приводит к усилению ооцитарной передачи сигналов PI3K/Akt. Чтобы разобраться в причине ускоренного роста ооцитов в яичниках Pten^loxP/loxP; GCre+, исследовали, приводила ли усиленная передача сигналов PI3K/Akt к увеличенной активации рибосомального белка S6 (rpS6). На ПД5, стадии развития без явных морфологических различий между яичниками Pten^loxP/loxP ; GCre+ и яичниками контроля (Фигура 2, A-C), активация Akt уже была повышенной в ооцитах Pten^loxP/loxP; GCre+ (Фигура 2C, ПД5, p-Akt). Это коррелировало с усиленной экспрессией (Фигура 2C, ПД5, rpS6) и фосфорилированием (указывая на активацию) rpS6 (Фигура 2C, ПД5, p-rpS6, серин 235/6). Этот результат позволяет предположить, что усиленная трансляция белка уже началась, когда Gdf-9-Cre-опосредованная делеция Pten в ооцитах только произошла. Подобным образом, в ооцитах, выделенных из яичников Pten ^loxP/loxP; GCre+ на ПД12-14, усиленная передача сигнала P13K/Akt приводила к повышению как экспрессии, так и фосфорилирования rpS6 (Фигура 2C, ПД12-14). Однако, активация у млекопитающих цели рапамицина каскада (mTOR)-p70 S6 киназы (S6K) не возросла при потере Pten, поскольку уровни фосфо-mTOR (p-mTOR, серин2448), фосфо-туберин/TSC2 (p-TSC2, треонин 1462), и фосфо-S6K (p-S6K, треонин 389) на ПД5 и ПД12-14 оставались близкими в ооцитах Pten ^loxP/loxP; GCre+ и контрольных ооцитах (Фигура 2C). Таким образом, усиленная активация rpS6 была вызвана повышенной экспрессией rpS6 как таковой (Фигура 2C). Однако, фосфорилирование rpS6 и S6K в мутантных ооцитах было чувствительным к PI3K-специфичному ингибитору LY294002 и mTOR-специфическому ингибитору рапамицину, указывая на то, что активация rpS6 в ооцитах Pten^loxP/loxP ; GCre+ является зависимой от активностей PI3K и mTOR. Ранее была сформулирована гипотеза, состоящая в том, что неизвестные факторы внутри яичника стимулируют некоторые примордиальные фолликулы для инициации роста, в то время как остальные фолликулы остаются в состоянии покоя.

Пример 2. Ингибитор PTEN способствует выживаемости и развитию примордиальных фолликулов в культивируемых мышиных яичниках

В постнатальный день 4 мышиных яичника удаляли асептически и цельный яичник культивировали в Cell Strainer (размер пор 40 мкм) (BD Biosciences, Stockholm, Sweden) в 1 мл среды альфа-MEM (Gibco-BR1), дополненной 28 мМ аскорбиновой кислоты и 0,3% (м/о) БСА, с 10 мкМ ингибитора PTEN bpV-HOpic (Биспероксо(5-гидроксипиридин-2-карбоксил)оксованадата (V) дикалия, K₂[VO(O₂)₂C ₆H₄NO₃]) или без него. Культивируемые яичники инкубировали во влажной камере (5% CO₂, 37°C), причем одну треть среды заменяли на свежую среду каждый день в течение периода культивирования. Для фиксации, яичники промывали однократно в PBS и фиксировали в течение ночи в 4% параформальдегиде и сохраняли для морфологического анализа.

Ингибитор PTEN увеличивает выживаемость фолликулов в культивируемых яичниках (стрелки на Фигуре 3B по сравнению со стрелками на Фигуре 3A), указывая на устранение некроза в яичниках, обработанных ингибитором PTEN. Ингибитор PTEN также стимулирует пролиферацию и дифференциацию сплющенных прегранулезных клеток (наконечники стрелок, Фигура 3A) в кубовидные гранулезные клетки (наконечники стрелок, Фигура 3B), что является незаменимой стадией для активации примордиальных фолликулов в стадию роста.

Заключения

Настоящие данные демонстрирует, что PTEN ооцитов функционирует как супрессор фолликулярной активации. Внутриооцитарный сигнальный каскад PTEN/PI3K, по-видимому, играет роль в инициации роста ооцитов. Авторы полагают, что активация пути PI3K в каждом индивидуальном ооците может быть существенной при определении судьбы примодиального фолликула - остается ли он в состоянии покоя, становится ли он активированным в определенное время или претерпевает ли он атрезию непосредственно из примордиальной стадии.

Кроме того, продемонстрирован отличительный овариальный фенотип для POF у мышей с ооцит-специфическим удалением Pten, который вызывается избыточной активацией и истощением примордиальных фолликулов. Таким образом, результаты данного исследования имеют широкие физиологические и клинические приложения, внося вклад в более глубокое понимание как нормальной физиологии яичника, так и развития заболеваний яичника. У людей POF определяют как первичный дефект яичника, характеризуемый отсутствием менархе (первой менструации) (первичная аменорея) или преждевременным истощением овариальных фолликулов/задержанный фолликулогенез перед достижением 40-летнего возраста (вторичная аменорея) с оцененной частотой возникновения, равной 1% (Beck-Peccoz and Persani Orphanet. J. Rare. Dis. 2006, 1: 9). Среди различных возможных причин POF, генетические вариации, приводящие к сверхактивации и истощению фолликулов, могут быть одной из них у людей. С другой стороны, ретардация активации фолликулов и/или избыточная атрезия примордиальных фолликулов, каждая из которых может быть вызвана недоактивацией пути PI3K в ооцитах, может также приводить к POF, хотя и с противоположных направлений. Осознание важности сигнальной цепи PTEN/PI3K в ооцитах открывает новые перспективы для понимания физиологических и патологических процессов в яичнике млекопитающих.