композиция для получения кремнийорганической золь-гель матрицы для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах

Формула изобретения

Композиция для получения кремнийорганической золь-гель матрицы для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах, состоящая из 20% раствора полиэтиленгликоля в фосфатном буферном растворе, тетраэтоксисилана и 0,2 моль/дм³ раствора катализатора NaF, отличающаяся тем, что дополнительно введена гидрофобная добавка - метилтриэтоксисилан, при этом компоненты взяты в объемном соотношении ПЭГ: ТЭС: МТЭС: NaF 4:(18-3,4):(2-16,6):1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к системам на основе микроорганизмов, иммобилизованных в матрицу синтетического носителя.

Известна золь-гель матрица на основе тетраметоксисилана для иммобилизации клеток Escherichia coli, которая используется для формирования биорецепторных элементов в люминесцентных биосенсорах [Е. Sagi, N. Never, R. Rosen, A.J. Bartolome, J.R. Premkumar, R. Ulber, O. Lev, T. Scheper, S. Belkin. Fluorescence and bioluminescence reporter functions in genetically modified bacterial sensor strains. // Sensors and Actuators 90, p.2-8, 2003]. Процедура приготовления золь-гель матрицы по описанному способу является трудоемкой, требует больших временных затрат и ультразвуковой обработки. Активность иммобилизованной таким образом биомассы существенно снижается по сравнению с активностью неиммобилизованных клеток, что связано с негативным воздействием компонентов матрицы на ферментные системы микроорганизмов. Биосенсоры на основе клеток, иммобилизованных в такую золь-гель матрицу, не обладают высокой чувствительностью.

Наиболее близкой по своим признакам, принятая за прототип, является композиция для получения кремнийорганической золь-гель матрицы на основе тетраэтоксисилана (ТЭС) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) [М. Waibel, H. Schulze, N. Huber, Т.Т. Bachmann. Screen-printed bienzymatic sensor based on sol-gel immobilized Nippostrongylus brasiliensis acetylcholinesterase and a cytochronie P450 BM-3 (CYP102-A1) mutant. // Biosensors and Bioelectronics 21, p.1132-1140, 2006.]. Для включения ферментов в такую матрицу использовали следующий порядок смешивания прекурсоров: к 1 мл 20% раствора полиэтиленгликоля (с молярной массой 6000) в фосфатном буферном растворе (рН=7,5) прибавляли 2,5 мл раствора фермента в фосфатном буферном растворе и 5 мл тетраэтоксисилана, перемешивали в течение 3 минут. Затем приливали 250 мкл 0,2 моль/дм³ раствора катализатора NaF и перемешивали еще 15 минут. Полученный гель помещали в чашку Петри. После окончания поликонденсации получали белый порошок, который промывали фосфатным буферным раствором (рН=7,5) для удаления неиммобилизованного фермента.

Недостатком полученной кремнийорганической золь-гель матрицы является ее невысокая механическая прочность и, как следствие, недостаточная долговременная стабильность биорецепторных элементов биосенсора на основе. Значительная полярность кремнийсодержащей матрицы на основе тетраэтоксисилана приводит к значительному воздействию матрицы на ферментные системы микроорганизмов, что приводит к падению активности клеток и, как следствие, к уменьшению чувствительности биосенсора.

Задачей технического решения является повышение основных характеристик биосенсора, путем получения кремнийорганической золь-гель матрицы на основе этоксипроизводных кремния и полиэтиленгликоля для иммобилизации клеток микроорганизмов, обеспечивающей снижение токсичного действия матрицы на биоматериал и повышение ее механической прочности.

Технический результат, который может быть получен при применении заявляемой кремнийорганической золь-гель матрицы, заключается в том, что полученная прочная не растворимая в воде золь-гель матрица может быть использована для иммобилизации микроорганизмов при создании рецепторных элементов биосенсорных анализаторов.

Сущность технического решения заключается в том, что композиция для получения кремнийорганической золь-гель матрицы для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах, состоит из 20% раствора полиэтиленгликоля в фосфатном буферном растворе, тетраэтоксисилана и 0,2 моль/дм³ раствора NaF, дополнительно введена гидрофобная добавка - метилтриэтоксисилан, при этом компоненты взяты в объемном соотношении ПЭГ:ТЭС:МТЭС:NaF 4:(18-3,4):(2-16,6):1.

Возможность варьирования соотношения количеств тетраэтоксисилана и метилтриэтоксилана позволяет подобрать в случае иммобилизации каждого конкретного штамма микроорганизмов оптимальное соотношение прекурсоров для получения золь-гель матрицы с подходящим размером микропор, при включении в которые клетки сохраняют свою высокую активность и при этом эффективно удерживаются в порах матрицы. Уменьшение полярности кремнийсодержащей матрицы за счет введения гидрофобной добавки способствует увеличению активности иммобилизованных в нее клеток. Кроме того, введение расчетного количества гидрофобной добавки уменьшает способность объемных молекул субстратов проникать через поры матрицы к ферменту, что позволяет повышать селективность биосенсоров. Введение расчетного количества гидрофобной добавки увеличивает механическую прочность матрицы, что приводит к увеличению долговременной стабильности при работе биорецепторных элементов, полученных на основе клеток, иммобилизованных в такую золь-гель матрицу.

Пример.

Для приготовления кремнийорганической золь-гель матрицы для иммобилизации микроорганизмов (с последующим использованием в биосенсорных анализаторах) в микропробирку отбирали 0,1 мл 20% раствора полиэтиленгликоля (с молярной массой 3000) в фосфатном буферном растворе (рН=6,8) и добавляли в него 0,25 мл суспензии клеток микроорганизмов дрожжей Pichia angusta BKM Y-2559 в фосфатном буферном растворе с концентрацией 150 мг/см³, перемешивали смесь в течение 3 мин, затем добавляли 0-0,45 мл тетраэтоксисилана и 0,05-0,5 мл метилтриэтоксисилана (в заданном соотношении, табл.1), после чего перемешивали смесь в течение 3 мин. Вносили 0,025 мл 0,2 моль/дм³ раствора NaF, перемешивали в течение 15 мин. Полученный гель (10 мкл) переносили на стекловолоконный фильтр Whatman GF/A подсушивали в течение 5 минут при комнатной температуре на воздухе. Подготовленный биорецепторный элемент помещали под колпачок кислородного электрода типа Кларка и фиксировали с помощью нейлоновой сетки.

В таблице 1 приведены характеристики биосенсора для определения метанола на основе иммобилизованных дрожжей Pichia angusta BKM Y-2559 (Всероссийская коллекция микроорганизмов, г.Пущине) в заявляемые кремнийорганические золь-гель матрицы.

Сравнение параметров биосенсора для определения метанола с рецепторными элементами на основе дрожжей Pichia angusta BKM Y-2559, иммобилизованных в различные по составу золь-гель матрицы показывает, что максимальная чувствительность биосенсора достигается в случае биорецепторного элемента № 5 (объемное соотношение ПЭГ:ТЭС:МТЭС:NaF 4:3,4:16,6:1). Определяемый минимум при этом снижается в 7 раз, а коэффициент чувствительности возрастает в 6 раз по сравнению с прототипом, не содержащим в матрице гидрофобной добавки. Максимальная долговременная стабильность (27 суток) наблюдается для биорецепторного элемента № 4 (объемное соотношение ПЭГ:ТЭС:МТЭС:NaF 4:6,6:13,4:1), что в 4 раза выше по сравнению с пртотипом. Все биорецепторные элементы обеспечивают высокую воспроизводимость результатов при определении метанола, относительное стандартное отклонение (рассчитанное по 15 параллельным определениям) составляет 0,5-0,9% и уменьшается при увеличении доли гидрофобной добавки.

Таким образом, введение в качестве прекурсора расчетного количества метилтриэтоксилана при формировании кремнийорганических золь-гель матриц на основе тетраэтоксисилана и полиэтиленгликоля приводит к значительному улучшению параметров биосенсора с рецепторными элементами на основе клеток микроорганизмов, иммобилизованных в заявляемые матрицы по сравнению с прототипом (матрицей, не содержащей гидрофобной добавки).

Табл.1
Параметр	Номер рецепторного элемента, объемное соотношение ПЭГ:ТЭС:МТЭС:NaF
	Прототип	№ 1,, 4:20:0:1	№ 2, 4:18:2:1	№ 3, 4:10:10:1	№ 4,. 4:6,6:13,4:1	№ 5, 4:3,4:16,6:1	№ 6, 4:0:20:1
Коэффициент чувствительности, нА·дм3/мин·моль	48±2	93±5	95±6	110±8	140±10	300±20	91±5
Предел обнаружения, мкмоль/дм3	5	3	3	2	2	1	3
Определяемый минимум, мкмоль/дм3	20	10	10	9	8	3	10
Относительное стандартное отклонение, %	0,9	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,5
Долговременная стабильность до падения на 50%, сутки	7	10	10	22	27	12	12