консорциум бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет, и способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет

Формула изобретения

1. Консорциум бифидобактерий Bifidobacterium bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum Я-3, В. longum OV-20, В. adolescentis ГО-13 для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет.

2. Способ получения консорциума по п.1, предусматривающий совместное культивирование в питательной среде входящих в него штаммов, отличающийся тем, что проводят посев каждого из штаммов в ферментер по 2% к объему питательной среды культивирования поэтапно с периодичность в 30 мин, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом каждого штамма до 6,8, при этом очередность засева каждого штамма устанавливают в зависимости от длительности экспоненциальной фазы его роста в питательной среде, содержащей следующие ингредиенты в расчете на 100 л:

Гидролизат молока	50 л
Аутолизат дрожжей	500 г
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Аскорбиновая кислота	250 г
Инулин	500 г
Олигофруктоза	500 г
Вода очищенная водопроводная	до 100 л

3. Биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет, характеризующаяся тем, что содержит сухую биомассу консорциума Bifidobacterium bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum Я-3, В. longum OV-20, В. adolescentis ГО-13, яблочный пектин, инулин, олигофруктозу в следующем процентном соотношении:

Биомасса бифидобактерий	30%
Пектин яблочный	20%
Инулин	20%
Олигофруктоза	30%

4. Бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет, отличающийся тем, что содержит сухую биомассу консорциума Bifidobacterium bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum Я-3, В. longum OV-20, В. adolescentis ГО-13 с содержанием КОЕ/г не менее 10⁸.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для приготовления лечебно-профилактических средств пробиотической направленности, предназначенных для коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта и поддержания ее колонизационной резистентности у людей старше 14 лет. Средства для профилактики и лечения конструируются преимущественно на основе двух групп микроорганизмов - бифидобактерий и лактобацилл. Бифидобактерии являются одними из наиболее значимых представителей микрофлоры человеческого организма, выполняя многофункциональную роль в поддержании гомеостаза организма. Бифидобактерии обеспечивают колонизационную резистентность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; обладают иммуномодулирующим действием; синтезируют аминокислоты, витамины, летучие жирные кислоты, ферменты, участвующие в процессах пищеварения и обмена веществ; способствуют усвоению железа, кальция, поддержанию водно-солевого баланса [1, 2, 3]. Частичная или полная элиминация бифидобактерий приводит к угнетению иммунных сил организма, развитию дисбиоза.

Многофакторное позитивное воздействие на организм человека позволяет рассматривать бифидобактерии как эффективный биокорректор и основу для создания препаратов, обладающих регулирующим и стимулирующим воздействием на организм [4, 5].

В России традиционным подходом к бактериотерапии является назначение больным препаратов на основе культур штаммов бифидобактерий с доказанным пробиотическим действием преимущественно в виде монокультур штаммов Bifidobacterium bifidum 1, В. bifidum 791, В. bifidum ЛВА-3, B. longum В379М, B. adolescentis МС-42.

Это, прежде всего, широко применяющийся лечебный препарат "Бифидумбактерин" [6].

При этом следует отметить, что в микробиоценозе кишечника человека бифидобактерии представлены одновременно многими видами - как отдельными, так и в ассоциациях [7]. Это позволяет предположить, что введение в состав пробиотических препаратов сразу нескольких видов бифидобактерии будет способствовать повышению их лечебной и профилактической эффективности.

Подобный подход предлагается в Российском патенте [8], касающемся консорциума на основе штаммов бифидобактерии.

Вместе с тем, указанный консорциум не учитывает, что рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен основываться на таком явлении, как аутогенная сукцессия - последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише [9, 10]. В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. При этом образуется так называемый сукцессионный ряд с образованием конечного - устойчивого биоценоза. Все биоценозы в живой природе развиваются по законам сукцессии. Что касается микроэкологии человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающей с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте: становлением иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального фона, сменой пищевого рациона. В то же время, видовой состав бифидофлоры взрослых людей относительно стабилен [11, 12].

Таким образом, препараты должны представлять собой ассоциации доминирующих микроорганизмов, которые максимально приближены по составу к естественному микробиоценозу желудочно-кишечного тракта человека в определенный возрастной период. Это является обоснованным подходом, обеспечивающим индивидуализацию бактериотерапии и повышение ее эффективности, способствуя устойчивой локализации или новому заселению биотопа теми видами бифидобактерий, которые преобладают в микробиоценозе конкретного человека.

В настоящее время для изучения таксономии представителей микробиоты, в том числе бифидобактерий и лактобацилл, разработаны и широко применяются различные молекулярно-генетические методы, включая секвенирование, мультилокусное генотипирование и другие, что существенно пополнило наши представления о видовом многообразии этих бактерий, позволило реклассифицировать известные и выявить новые виды (13, 14). Это тесным образом связано с разработкой новых пробиотических препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием, широким набором свойств, определяющих метаболическую и антагонистическую активность.

Так, изучение вышеперечисленных штаммов молекулярно-генетическими методами - на основе амплификации и секвенирования фрагментов двух генов: 16S рибосомальной РНК (16S) и трансальдолазы (tal) - показало несоответствие в видовой принадлежности некоторых штаммов, идентифицированных ранее с помощью биохимических тестов. Штамм В. bifidum 1, широко используемый в производстве пробиотиков, оказался природным рекомбинантом, состоящим из двух клонов: B. bifidum и B. breve. Штаммы B. adolescentis Г7513 и B. bifidum ЛВА-3 также показали себя как рекомбинанты B. bifidum / B. breve. Штамм B. adolescentis Я-3 по одной мишени был идентифицирован, как B. longum, а по другой - как B. adolescentis. И только штамм B. adolescentis ГО-13 по обеим мишеням был идентифицирован как истинный B. adolescentis. Данная информация говорит о необходимости новых подходов к конструированию мультипробиотических препаратов.

Представленные данные убедительно показывают, что для эффективной коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза людей данной возрастной группы в состав препарата должны входить штаммы не только с доказанным пробиотическим эффектом, но и в видовом отношении комплементарные бифидофлоре биоценоза кишечника желудочно-кишечного тракта. Важное значение имеет включение в состав средства коррекции микрофлоры штаммов, выделенных от здоровых людей в настоящий период времени, т.к. большинство производственных штаммов имеют происхождение 50-ти и более лет.

Это относится к всесторонне изученным и запатентованным штаммам бифидобактерии: штамм В. bifidum OV-19 [15] и штамм В. longum OV-20 [16]. Штамм В. longum OV-20 отличается широким спектром антибиотикорезистентности. Штамм В. bifidum OV-19 обладает устойчивым генотипом, высокотехнологичен.

Задачей настоящего изобретения является создание консорциума бифидобактерии, по составу максимально приближенного к микробиоценозу людей старше 14 лет, а также разработкой способа его получения, учитывающих биосовместимость штаммов в процессе культивирования и при дальнейшем хранении.

Техническим результатом настоящего изобретения является тот факт, что заявляемый консорциум является высокотехнологичным, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией пробиотических микроорганизмов, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Синергидный эффект совместного использования штаммов в консорциуме проявляется в повышении всех перечисленных свойств по сравнению с отдельными штаммами.

Предлагаемый консорциум имеют следующий видовой состав:

Консорциум бифидобактерий для препаратов и БАД, предназначенных для для людей старше 14 лет:

1. Bifidobacterium bifidum OV-19 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского

№ 216, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка. Ru 2375444.

2. Bifidobacterium B. bifidum 791 - ВНИИгенетика в ЦМПМ № В-3300, ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского № 80 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка.

3. Bifidobacterium longum Я-3 - ВНИИгенетика в ЦМПМ № B-3301, ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского № 103, выделен из содержимого кишечника здорового человека.

4. B.longum OV-20 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского № 214, выделен из содержимого кишечника здорового peбeнкa. RU 2375445

5. Bifidobacterium adolescentis ГО-13 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского № 48, выделен из кишечника здорового ребенка. Задачей настоящего изобретения является также разработка определенной схемы совместного культивирования отдельных культур для получения консорциума.

Техническим результатом предлагаемой схемы совместного культивирования отдельных штаммов является отсутствие взаимного ингибирования отдельных штаммов и расширение спектра ферментативной и антагонистической активности.

Способ получения консорциума основан на предварительном изучении и подборе для совместного культивирования штаммов по принципу биосовместимости и с учетом кинетики роста каждого из них.

Алгоритмом к созданию консорциума бифидобактерий является совместное культивирование входящих в него штаммов с учетом длительности экспоненциальной фазы роста каждого из них, на основании чего определяется временная точка засева питательной среды при поэтапном внесении инокулятов монокультур.

Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий.

Посев каждой из культур в ферментер, по 2% к объему среды культивирования, проводят поэтапно, с периодичностью в 30 минут, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом нового штамма до 6,8. Очередность засева зависит от длительности экспоненциальной фазы роста каждого из штаммов и в данном консорциуме является следующей:

1) - В. bifidum OV-19 - 2%,

2) - В. bifidum 791 - 2%,

3) - В. longum OV-20 - 2%,

4) - В. longum Я-3 - 2%,

5) - В. adolescentis ГО-13 - 2%.

Процесс длится 10-12 часов; рН конечного продукта составляет 5,1-5,5.

Культурально-морфологические признаки консорциума

Клетки представляют Грам+полиморфные палочки, расположенные преимущественно в виде скоплений; в стационарной фазе роста часто отмечаются клетки с раздвоениями на концах или булавовидными утолщениями.

При выращивании в ферментере в экспоненциальной фазе роста при микроскопии культура имеет вид ровных палочек, расположенных цепочками или скоплениями.

В полужидких питательных средах биомасса консорциума бифидобактерии растет по всему объему питательной среды, кроме зоны аэробиоза. Морфология колоний неоднородна и зависит от входящих в консорциум штаммов, сохраняя признаки каждого из них в совокупной культуре.

Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов, входящих в консорциум

Облигатные анаэробы. Оптимальная температура выращивания составляет 37-38°С, рН питательных сред 7,2-7,4. Каталазу не образуют, желатин не разжижают, газообразование отсутствует.Сбраживают глюкозу с образованием кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,3-5,1.

Сравнительные данные культивирования отдельных культур и их консорциума показывают, что при совместном культивировании при предложенной схеме внесения посевного материала не происходит взаимного ингибирования культур (таблица 1).

Консорциум возможно культивировать на различных питательных средах со стабильно высокими показателями КОЕ/мл пробиотических микроорганизмов и продуцируемых органических кислот (таблица 2).

Таблица 2
Результаты культивирования консорциумов на разных питательных средах
Среда выращивания	Консорциум бифидобактерии
	Число КОЕ/мл	°Т
Блаурокка	8,2±0,2×109	180°
Гидролизатно-молочная	7,2±0,6×109	190°
Среда для культивирования бифидобактерии согласно изобретению	8,4±0,3×10 9	180°

При предложенной схеме внесения посевного материала не происходит взаимного ингибирования культур.

Наиболее перспективной в производстве препаратов и БАД является гидролизатно-молочная среда, т.к. в настоящее время широко распространена непереносимость коровьего молока. Данная среда гипоаллергенна, так как ее основой является гидролизат молока, состоящий из низкомолекулярных пептидов и аминокислот, которые легко усваиваются, не вызывая аллергических реакций. Среда, изготовленная на основе гидролизата молока, имеет следующий состав (в расчете на 100 л):

Таблица 3
Состав гидролизатно-молочной среды
Гидролизат молока	50 л
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Вода водопроводная очищенная	до 100 л

Среда проста в приготовлении, экономически выгодна; вместе с тем, как видно из результатов, представленных в таблице 3, по ростовым свойствам уступает остальным средам.

Для устранения данного недостатка в нее были дополнительно включены добавки, стимулирующие рост пробиотических микроорганизмов - пребиотики инулин и олигофруктоза и дрожжевой аутолизат, содержащий витамины группы В, необходимые для их развития и аскорбиновая кислота, как антиоксидант.Состав усовершенствованной таким образом среды представлен в таблице 4.

Таблица 4
Состав заявляемой среды (в расчете на 100 л):
Гидролизат молока	50 л
Аутолизат дрожжей	500 г
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Аскорбиновая кислота	250 г
Инулин	500 г
Олигофруктоза	500 г
Вода водопроводная очищенная	до 100 л

При изучении ростовых свойств заявляемой среды было показано, что они превосходят ростовые свойства гидролизатно-молочной среды, т.е. желаемый результат был достигнут.Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5
Сравнительные результаты культивирования консорциума на гидролизатно-молочной и заявляемой средах

Среда выращивания	Консорциум бифидобактерии
	Число КОЕ/мл	°Т
Гидролизатно-молочная	7,2±0,6×10 9	140°
Заявляемая среда	8,2±0,3×10 9	180°

Таким образом, заявляемая среда является перспективной в производстве препаратов и Б АД для людей старше 14 лет.

Синергидный эффект, который был отмечен при культивировании консорциума, проявляется также при определении спектра биохимической активности.

В качестве иллюстрации в таблице 6 представлено, как расширяется спектр ферментативной активности штаммов при совместном культивировании - увеличивается число усвоенных субстратов.

Синергидный эффект консорциума проявляется также в большей антагонистической активности консорциума по сравнению с монокультурами, что повышает пробиотическую значимость препарата. Данный эффект можно наблюдать по зонам задержки роста тест-культур (табл.7).

Как показывают данные, представленные в таблице 7, по антагонистической активности в отношении тест-штаммов патогенных микроорганизмов консорциум превосходит отдельные штаммы, входящие в его состав.

Таким образом, полученные результаты говорят не только о возможности совместного культивирования различных видов бифидобактерии, но и синергидном эффекте консорциума штаммов, что позволяет решить сложную биотехнологическую задачу получения многокомпонентных пробиотических препаратов, имеющих определенный состав и назначение.

В предлагаемом консорциуме помимо определенного видового состава бифидобактерии, отмечается определенное количественное соотношение микробных культур после культивирования. Количественный учет долевого участия отдельных штаммов производится путем подсчета числа колоний, выросших в полужидкой среде. Культура каждого штамма имеет колонии определенной морфологии и размера, что позволяет их различать. Соотношение отдельных видов бифидобактерии в консорциуме представлено в таблице 8.

Таблица 8
Соотношение отдельных видов бифидобактерии в консорциуме
№ и/и	Штамм микроорганизма	Число КОЕ/г	Массовая доля микроорганизмов, %
1.	В. bifidum OV-19	109-1010	18,0-20,0
2.	В. bifidum 791	109-1010	20,0-18,0
3.	В. longum Я-3	109-1010	14,5-12,0
4.	В. longum OV-20	109-1010	23,5-23,0
5.	В. adolescentis ГО-13	109-1010	24,0-27,0

При составлении рецептуры препаратов для коррекции микрофлоры необходимо учитывался тот факт, что наиболее целесообразным является сочетанное использование консорциума пробиотических микроорганизмов совместно с пребиотиками инулином и олигофруктозой и яблочным пектином, стимулирующими рост как индигенной, так и микрофлоры, входящей в состав препарата. Кроме того, пребиотики, инкапсулируя микробные клетки, защищают их при прохождении желудочно-кишечного тракта от агрессивного действия окружающей среды. Техническим результатом данного изобретения является использование консорциума в качестве активного вещества в сочетании с пребиотиками - яблочным пектином, инулином и олигофруктозой. Присутствие питательных субстратов способствует эффективной колонизации биотопа. Сахаролитические микроорганизмы, увеличивая при этом продукцию органических кислот, способствуют лучшему усвоению кальция, железа, магния. Помимо этого, инулин ускоряется очищение организма от шлаков и непереваренной пищи вследствие стимулирования сократительной способности кишечной стенки, отмечается хороший слабительный эффект, он оказывает антитоксическое и защитное действие. Инулин обладает «обволакивающим действием», защищая слизистые оболочки желудка и частично кишечника от механического раздражения пищей. Использование диеты с добавлением инулина ингибирует развитие опухолей и уменьшает в кишечнике количество аммиака, повышенная концентрация которого способствует росту опухолей. Инулин улучшает углеводный и липидный метаболизм и нормализует уровень сахара в крови у больных сахарным диабетом. Олигофруктоза обладает выраженным желчегонным действием, которое усиливается в связи с облегчением оттока желчи из печени и желчного пузыря в двенадцатиперстную кишку, обусловленным улучшением опорожнения кишечника.

Помимо описанных эффектов, данные ингредиенты обладают высокой сорбционной емкостью. Пектин способен, образовывая комплексы, выводить из организма человека тяжелые металлы (свинец, ртуть, цинк, кобальт, молибден и пр.) и долгоживущие (с периодом полураспада в несколько десятков лет) изотопы цезия, стронция и т.д. Кроме того, пектин может сорбировать и выводить из организма биогенные токсины, анаболики, ксенобиотики, продукты метаболизма и биологически вредные вещества, способные накапливаться в организме: холестерин, желчные кислоты, мочевину, продукты тучных клеток. Особо следует отметить многогранное действие пектинов при дисбактериозе. Они абсолютно естественно очищают кишечник, мягко обволакивают слизистую, защищают ее и способствуют ее быстрому восстановлению. Кроме того, пектины сдвигают рН толстого кишечника в более кислую сторону. Болезнетворные бактерии в такой среде погибают, а полезная микрофлора начинает, наоборот, активно размножаться. Эксперименты, сравнивающие сорбционную эффективности энтеросорбентов разных классов, проведенные с солями свинца и меди, показали, что самыми эффективными признаны низкоэтерифицированные пектины. Именно эти уникальные природные вещества признаны наиболее эффективными для очищения организма от вредных веществ, паразитов и продуктов их жизнедеятельности.

Еще одним вариантом рационального подхода к коррекции дисбиотических состояний является сочетанное применение микронутриентов и пробиотических микроорганизмы. При введении в организм человека такого комплекса происходит восполнение нарушенной индигенной микрофлоры. Пробиотическая микрофлора повышает биодоступность микронутриентов и снижает дефицит витаминов и минералов. Это, в свою очередь, должно способствовать более эффективному восстановлению индигенной микрофлоры и метаболитного баланса в организме.

Примеры

I. Консорциум бифидобактерий для бактерийных препаратов и БАД, предназначенных для людей старше 14 лет, и способ его получения.

1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В. bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum Я-3, В. longum OV-20, В. B. adolescentis ГО-13 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8. Инкубируют при температуре 37,5-38°С в течение 36 ч.

2-й пассаж. - каждую из выросших культур из разведения 10^6-8 в объеме 5% засевают в питательную полужидкую среду заявляемого состава (30 мл) и культивируют 7 ч при 37,0-38°С.

3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в заявляемую полужидкую среду и выращивают в течение 16 ч при 37-38°С.

Выращивание консорциума.

Консорциум бифидобактерий получают путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов на питательной среде, содержащей следующие ингредиенты на 100 литров

Гидролизат молока	50 л
Аутолизат дрожжей	500 г
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Аскорбиновая кислота	250 г
Инулин	500 г
Олигофруктоза	500 г
Вода водопроводная очищенная	до 100 л

Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерии.

Посев культур в ферментер по 2% каждой к объему засеваемой среды проводят последовательно, с периодичностью в 30 мин, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом каждого штамма до 6,8: 1) В. bifidum OV-19 - 2%, 2) В. bifidum 791-2%, 3) В. longum OV-20 - 2%, 4) В. longum Я-3 -2%, 5) В. adolescentis ГО-13 - 2%.

Процесс культивирования ведут при 37-38°С. до достижения рН конечного продукта 5,1.

2. Биологически активная добавка к пище для нормализации микрофлоры людей стпрше 14 лет и способ ее производства

1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В. bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum Я-3, В. longum OV-20, В. В. adolescentis ГО-13 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10 ^7-8. Инкубируют при температуре 37,5-38°С в течение 24 ч.

2-й пассаж - каждую из выросших культур из разведения 10^6-8 в объеме 5% засевают в питательную полужидкую среду (30 мл) и культивируют 7 ч при 37-38°С.

3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в питательную полужидкую среду и выращивают в течение 16 ч при 37-38°С.

Выращивание консорциума.

Консорциум бифидобактерии получается путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов согласно разработанной схеме. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию КОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий.

Состав среды выращивания (в расчете на 100 л):

Гидролизат молока	50 л
Аутолизат дрожжей	500 г
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Аскорбиновая кислота	250 г
Инулин	500 г
Олигофруктоза	500 г
Вода водопроводная очищенная	до 100 л

Процесс культивирования ведут 10 часов при при 37-38°С. К выращенной биомассе бифидобактерий добавляют защитную сахарозо-желатиновую среду и обезжиренное 10%-ное молоко по 10% к объему биомассы бифидобактерий и лиофильно высушивают.

Техническим результатом, достигаемым при получении биологически активной добавки с использованием заявляемого консорциума, является более эффективная и быстрая коррекция микрофлоры ЖКТ людей старше 14 лет.

После помола биомасса бифидобактерий смешивается с яблочным пектином, инулином и олигофруктозой. Смесь фасуется в капсулы по 0,5 г и укладывается по 20-60 штук в стерильные пластиковые баночки с герметично закрывающимися крышками, упаковывается в пенал, в который вкладывается инструкция по применению.

Содержание КОЕ/г бифидобактерии не менее 10⁸

3. Бактериальный препарат для лечения дисбиотических нарушений ЖКТ у людей старше 14 лет и способ его производства

1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В. bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum Я-3, В. longum OV-20, В. В. adolescentis ГО-13 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10 ^7-8. Инкубируют при температуре 37,5-38°С в течение 24 ч.

2-й пассаж. - каждую из выросших культур из разведения 10^6-8 в объеме 5% засевают в питательную полужидкую среду (30 мл) и культивируют 6 ч при 37,0-38°С. (маточные культуры).

3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в питательную полужидкую среду и выращивают в течение 16 ч при 37,0-38°С.

Выращивание консорциума. Консорциум бифидобактерий получается путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов согласно разработанной схеме. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию КОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий.

Состав среды выращивания (в расчете на 100 л):

Гидролизат молока	50 л
Аутолизат дрожжей	500 г
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Аскорбиновая кислота	250 г
Инулин	500 г
Олигофруктоза	500 г
Вода водопроводная очищенная	до 100 л

Процесс культивирования ведут 10 ч при 37-38°С. К выращенной биомассе бифидобактерий добавляют защитную сахарозо-желатиновую среду и обезжиренное 10%-ное молоко по 10% к объему биомассы бифидобактерий, разливают в асептических условиях по 5 мл в стеклянные пенициллиновые флаконы и лиофильно высушивают.

Техническим результатом, достигаемым при получении бактерийного препарата с использованием заявляемого консорциума бифидобактерий в качестве активного вещества, является более эффективная и быстрая коррекция микрофлоры ЖКТ людей старше 14 лет.

Содержание КОЕ/г бифидобактерии в готовом препарате не менее 10⁸.

Список цитируемой литературы

1. Mitsuoka Т. Intestinal Flora and Host. // Asian. Med. J. - 1989 - V.31. - N7. - P.400-409.

2. Гончарова Г.И., Лянная A.M., Козлова Э.П., Семенова Л.П. Роль бифидофлоры в повышении устойчивости организма к инфекции. // В сб. материалов международной конференции «Гнотобиология в теоретической и практической медицине». - М. - 1987. - С.62.

3. Шендеров Б.А. Микрофлора пищеварительного тракта - важнейший фактор поддержания микроэкологического гомеостаза хозяина. // Клиническое питание. - 2005, - № 2. - С.2-5.

4. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин // Автореф. дис. д-ра биол.. наук. - М. - 1982. - 48 С.

5. Шендеров Б.А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома // Москва: Дели принт. - 2008. - С.317.

6. Гончарова В.В. Изучение бифидобактерии, разработка препарата «сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. - Москва. 1970. - С.15.

7. Mitsuoka Т., Hayakawa К., Kimura N.. The fecal flora of man. I1. Communication: the composition of bifidobacterium flora of different age groups. // Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt. Orig. - A 1974. - V.226 / - P.469-478.

8. Патент РФ № 2196174

9. Сукачев B.H., Дылиса Н.В. Лесной биогеоценоз // М.:Наука. - 1964. - С.574.

10. Рыбальченко О.В., В.М.Бондаренко, Добрица В.П. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека. // С-Петербург. - 2008. - С.109.

11. Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве. // Сб. научных трудов. - М. - 1986. - С.208.

12. Леванова Л.Л., Алешкин В.А., Воробьев А.Л., и др. Возрастные особенности микробиоценоза кишечника у жителей г.Кемерово. // Журн. Микробиол. - 2001. - № 3. - С.72-75.

13. Карзанова М.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. // Сборник докладов Россельхозакадемии. - М. - 2006. - № 5. - С.9-12.

14. Namba К.,Hatano М. at all. Method of detecting Bifidobacterium infantis // United States Patent. - Prior Publication data 14.12.2006. - 22 P.

15. Патент РФ № 2375444 от 10.12.2009 Штамм Bifidobacterium bifidum OV-19, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка № 2008128540 от 15.07.2008.

16. Патент РФ № 2375445 от 10.12.2009 Штамм Bifidobacterium longum OV-20, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка № 2008128542 от 15.07.2008.