способ верификации фазы гнойно-септических осложнений при остром деструктивном панкреатите

Формула изобретения

Способ верификации фазы гнойно-септических осложнений при остром деструктивном панкреатите, включающий забор биологического материала и его последующий анализ, отличающийся тем, что у пациента под контролем УЗИ осуществляют чрескожную прицельную пункционную биопсию печени и проводят иммуногистохимическое исследование микропрепаратов биоптата на параллельных срезах с маркированием моноклональными антителами CD 79a для идентификации В-лимфоцитов (B-Lm) и CD 68 для идентификации макрофагов (МФ), затем выполняют световую микроскопию на увеличении ×400 с морфометрией B-Lm перипортальных областей и МФ паренхимы долек, обработку результатов осуществляют при помощи автоматизированных систем анализа изображений, определяют относительную площадь, занимаемую анализируемыми клеточными элементами в микропрепарате по формуле



где А - относительная площадь, занимаемая анализируемыми клеточными элементами, %; Ai - значение абсолютной площади анализируемых клеток в поле зрения i, пиксели; n - количество исследованных полей зрения в микропрепарате; S - общая площадь поля зрения, пиксели,

и если значение относительной площади А для B-Lm перипортальных областей принадлежит интервалу от 0,4 до 1,14 и значение А для МФ паренхимы печени принадлежит интервалу от 0,89 до 2,95, то определяют доинфекционную фазу ОДП, если значение А для B-Lm перипортальных областей принадлежит интервалу от 1,41 до 4,98 и значение А для МФ паренхимы печени принадлежит интервалу от 4,34 до 9,52, то определяют фазу гнойно-септических осложнений.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к гистологии, морфометрии, абдоминальной хирургии.

Тактика лечебно-диагностических мероприятий при остром деструктивном панкреатите (ОДП) определяется фазой заболевания (доинфекционная фаза и фаза гнойно-септических осложнений).

Для верификации инфицирования очагов некроза поджелудочной железы и забрюшинной клетчатки у больных с ОДП определяют с помощью биохимических тестов серологические маркеры, такие как: С-реактивный белок, прокальцитонин, кальций, ИЛ 10, ИЛ 18, глюкоза, фосфолипаза А2, карбоксипептидаза, трипсиноген и др.; при этом требуется проведение динамического анализа этих показателей (J. Iovainna. "Pancreatology. From bench to bedside". Marseille: Springer, 2009).

Но при помощи данных критериев возможна только опосредованная оценка состояния поджелудочной железы в конкретный момент, лабораторные методы диагностики при панкреатогенной инфекции обладают более низкой чувствительностью и специфичностью (B.C. Савельев, М.И. Филимонов, Б.Р. Гельфанд, С.З. Бурневич. "Инфицированный панкреонекроз". URL: http://epidept.spb.ru/Content/SSI/Topic/cont/7/b_vi.htm), используемые показатели требуют динамического контроля, что также делает их недостатком высокую стоимость исследования.

Для верификации инфицирования некротических очагов ткани поджелудочной железы и забрюшинной клетчатки при ОДП обычно используют данные бактериологического анализа биоматериала, полученного при тонкоигольной пункции забрюшинного пространства под контролем компьютерной томографии (КТ) или ультразвуковым контролем (УЗИ). При наличии положительного результата бактериологических тестов (бактериоскопия и культуральное исследование аспирационного материала) судят о наступлении фазы гнойно-септических осложнений, при этом доказанное инфицирование некротических очагов является показанием к оперативному вмешательству (Савельев B.C. Стандарты лечения и диагностики деструктивного панкреатита. Москва; проект Российского государственного медицинского университета с учетом данных анкетирования хирургических клиник РФ. URL: http://doctormedcin.narod.ru/TEXT/pancreatit.htm; Büchler M.W., Gloor В., Müller С.А., Friess Н., Seiler С.А. and Uhl W. "Acute necrotizing pancreatitis: treatment strategy according to the status of infection". // Ann. Surg. 2000; 232:619-626).

Недостатками тонкоигольной пункции забрюшинной клетчатки, помимо возможных осложнений (повреждение сосудистых, нервных структур и т.д.), является определенный риск вторичного инфицирования (Werner J., Feuerbach S., Uhl W. and Büchler M.W. "Management of acute pancreatitis: from surgery to interventional intensive care". Gut. 2005; 54:426-436; J. Iovanna. "Pancreatology. From bench to bedside". Marseille: Springer, 2009; 84). Кроме того, данный метод требует наличия дорогостоящей аппаратуры в условиях операционной и достаточной квалификации специалистов, использование метода в широкой клинической практике также в ряде случаев ограничено отсутствием жидкостных образований при наличии очага инфицирования или «эхо-окна» для целенаправленной пункции структур очага некроза и малым опытом клинических исследований (B.C. Савельев, М.И. Филимонов, Б.Р. Гельфанд, С.З. Бурневич. "Инфицированный панкреонекроз". URL: http://epidept.spb.ru/Content/SSI/Topic/cont/7/b_vi.htm).

Задачей изобретения является повышение точности верификации фазы гнойно-септических осложнений, а также техническое упрощение и удешевление методики исследования.

Сущность способа состоит в том, что у пациентов с ОДП под контролем УЗИ осуществляют чрескожную прицельную пункционную биопсию печени, проводят иммуногистохимическое исследование микропрепаратов биоптата на параллельных срезах толщиной 5 мкм с маркированием моноклональными антителами: CD79 для идентификации В-лимфоцитов (B-Lm) и CD68 для идентификации макрофагов (МФ), после чего выполняют световую микроскопию на увеличении ×400 с морфометрией B-Lm перипортальных областей и МФ паренхимы долек и последующей обработкой результатов при помощи автоматизированных систем анализа изображений, при этом определяют относительную площадь, занимаемую анализируемыми клеточными элементами в микропрепарате по формуле:

, где А - относительная площадь, занимаемая анализируемыми клеточными элементами - в %, Ai - значение абсолютной площади анализируемых клеток в поле зрения i - в пикселях, n - количество исследованных полей зрения в микропрепарате, S - общая площадь поля зрения - в пикселях, при этом, если значение относительной площади А для B-Lm перипортальных областей принадлежит интервалу от 0,4 до 1,14 и значение А для МФ паренхимы печени принадлежит интервалу от 0,89 до 2,95, то определяют доинфекционную фазу ОДП, если значение А для B-Lm перипортальных областей принадлежит интервалу от 1,41 до 4,98 и значение А для МФ паренхимы печени принадлежит интервалу от 4,34 до 9,52, то определяют фазу гнойно-септических осложнений.

Впервые на основе объективного морфометрического исследования установлена взаимосвязь между показателями относительной площади B-Lm перипортальных областей печени и МФ паренхимы печени и фазами ОДП. Увеличение значений показателя относительной площади МФ печени в фазу гнойно-септических осложнений ОДП, предположительно, обусловлено возрастанием фагоцитарной и антиген-презентирующей активности данных клеток в отношении компонентов микроорганизмов, поступающих из анатомически и функционально близкого массивного воспалительно-некротического очага после его инфицирования. Увеличение значений относительной площади B-Lm печени в фазу гнойно-септических осложнений ОДП, предположительно, связано с активацией и пролиферацией B-Lm при массивной стимуляции бактериальными антигенами. Световая микроскопия на увеличении ×400 обеспечивает лучшую визуализацию и программную идентификацию анализируемых клеточных элементов, что позволяет применять средства компьютерных систем анализа изображений в режиме методик автоматического определения площади, занимаемой B-Lm и МФ, и, следовательно, увеличивает объективность и точность исследования.

Предложенный способ осуществляют следующим образом.

У пациента с ОДП после обработки операционного поля стандартными растворами антисептиков под контролем УЗИ осуществляют чрескожную прицельную пункционную биопсию печени под местной инфильтрационной анестезией 0,25% раствором новокаина с использованием игл для гистологической биопсии мягких тканей G16, G18. Биопсийный материал печени подвергают фиксации в 10% нейтральном забуференном растворе формалина, по общепринятым схемам выполняют проводку материала и заливку в парафин, на микротоме получают параллельные гистологические срезы толщиной 5 мкм, микропрепараты печени подвергают иммуногистохимическому исследованию при инкубации с «ready to use» антителами CD79a (rabbit anti-human CD79a monoclonal antibody: клон SP18 фирмы Spring, США) и CD68 (anti-human CD68 monoclonal antibody: клон 514H12 фирмы Monosan, Нидерланды) по стандартной методике. После этого выполняют световую микроскопию гистологических микропрепаратов на увеличении ×400 с морфометрией B-Lm перипортальных областей и МФ паренхимы долек и обработкой результатов при помощи автоматизированной системы анализа изображений (например, «ВидеоТест 4.0»). Затем определяют относительную площадь, занимаемую B-Lm перипортальных областей и МФ паренхимы долек в микропрепарате (например, с использованием редактора MS Excel) по формуле:

, где А - относительная площадь, занимаемая анализируемыми клеточными элементами - в %, Ai - значение абсолютной площади анализируемых клеток в поле зрения i - в пикселях, n - количество исследованных полей зрения в микропрепарате, S - общая площадь поля зрения - в пикселях. Если значение относительной площади А для B-Lm перипортальных областей принадлежит интервалу от 0,4 до 1,14 и значение А для МФ паренхимы печени принадлежит интервалу от 0,89 до 2,95, то определяют доинфекционную фазу ОДП. Если значение А для B-Lm перипортальных областей принадлежит интервалу от 1,41 до 4,98 и значение А для МФ паренхимы печени принадлежит интервалу от 4,34 до 9,52, то определяют фазу гнойно-септических осложнений. Представленные графические материалы иллюстрируют описанные выше изменения. На фиг.1 представлены результаты работы методики автоматического определения площади, занимаемой B-Lm перипортальной области микропрепарата печени, в рамках компьютерной программы анализа изображений «ВидеоТест 4.0» в доинфекционной фазе ОДП (иммуногистохимическое исследование с обработкой CD79a, световая микроскопия на увеличении 400). На фиг.2 представлена перипортальная B-Lm инфильтрация печени в доинфекционной фазе ОДП (маркировка CD 79 , световая микроскопия при увеличении 400). На фиг.3 представлена перипортальная B-Lm инфильтрация печени в фазу гнойно-септических осложнений ОДП (маркировка CD 79 , световая микроскопия при увеличении 400). На фиг.4 представлена МФ инфильтрация паренхимы печени в доинфекционной фазе ОДП (обработка CD 68, световая микроскопия при увеличении 400). На фиг.5 представлена МФ инфильтрация паренхимы печени в фазе гнойно-септических осложнений ОДП (обработка CD 68, световая микроскопия при увеличении 400). На фиг.6 представлена работа методики автоматического определения площади, занимаемой МФ паренхимы печени, в рамках компьютерной программы «ВидеоТест 4.0» в фазе гнойно-септических осложнений ОДП.

Пример 1.

Пациент И. А.Н., 44 лет (карта стационарного больного № 61/11) находился на лечении в МЛПУ «Клиническая больница скорой медицинской помощи» г.Смоленска по поводу острого деструктивного панкреатита. Биопсия печени получена на 5 сутки от начала клинических проявлений заболевания ( № 21-11): A (B-Lm) составила 1,12%, А(МФ) составила 2,57%, что позволило сделать вывод о доинфекционной фазе ОДП. Данные общеклинического анализа крови (5 сутки заболевания): Lc 20,8×10 ⁹/л, Ео 2%, миелоциты 2%, нейтрофилы палочкоядерные 37%, сегментоядерные 50%, лимфоциты 8%, моноциты 1%. Данные биохимического анализа крови: креатинин 86 мколь/л, мочевина 6,4 ммоль/л, белок 37 г/л, глюкоза 7,1 ммоль/л. При лапароскопии (5 сутки заболевания) выявлен тотальный геморрагический панкреонекроз, парапанкреатический инфильтрат (оментобурсит), асептическая флегмона забрюшинной клетчатки (парапанкреатической, параколической, паранефральной областей), ферментативный перитонит. При бактериологическом исследовании биоматериала (выпот из брюшной полости, сальниковой сумки) доинфекционная фаза ОДП подтверждена. Назначено комплексное лечение, включавшее: 1) детоксикацию, восстановление реологических свойств крови, возмещение плазмопотери; 2) антисекреторную терапию, 3) коррекцию респираторных и гемодинамических нарушений; 4) антиферментную терапию.

Пример 2.

Пациент Б. В.Е., 82 лет (карта стационарного больного № 1771/12) находился на лечении в ОГБУЗ «Клиническая больница скорой медицинской помощи» г.Смоленска по поводу острого деструктивного панкреатита. Биопсия печени получена на 10 сутки заболевания ( № 600-12): A (B-Lm) составила 2,52%, А(МФ) составила 4,86%, что позволило установить фазу гнойно-септических осложнений ОДП. Данные общеклинического анализа крови (10 сутки заболевания): Lc 10,2×10⁹/л, нейтрофилы палочкоядерные 9%, сегментоядерные 78%, лимфоциты 8%, моноциты 5%. Данные биохимического анализа крови: креатинин 75 мколь/л, мочевина 16 ммоль/л, белок 52 г/л, глюкоза 5,4 ммоль/л. При лапаротомии выявлен панкреатогенный абсцесс сальниковой сумки и абсцесс подпеченочной локализации, гнойно-септические очаги санированы, дренированы двухпросветными трубчатыми дренажами. Результаты бактериологического исследовании биоматериала (содержимое абсцесса сальниковой сумки и брюшной полости), а также интраоперационные данные подтвердили у больного наличие фазы гнойно-септических осложнений ОДП. В послеоперационном периоде назначено комплексное лечение, включавшее детоксикацию, восстановление реологических свойств крови, возмещение плазмопотери, коррекцию респираторных и гемодинамических нарушений, антибактериальную терапию препаратами широкого спектра действия, создающими эффективную бактерицидную концентрацию в ткани поджелудочной железы и парапанкреатической клетчатке для большинства возбудителей инфекции.

Апробация способа была проведена на материале 30 биопсий печени, полученных у пациентов с ОДП, находившихся на стационарном лечении в клинической больнице скорой медицинской помощи г.Смоленска. Изучение клеточного состава В-лимфоцитарной составляющей инфильтратов перипортальных зон и макрофагальной инфильтрации паренхимы производилось в параллельных срезах на основе результатов иммуногистохимии при инкубации с «ready to use» моноклональными антителами для идентификации B-Lm CD 79 (клон SP18 фирмы Spring, США), МФ-CD 68 (клон 514Н12 фирмы Monosan, Нидерланды). В зависимости от размеров биоптата анализировалось от 3 до 10 полей зрения. При этом было выявлено, что в доинфекционную фазу ОДП (13 препаратов) значения относительной площади, занимаемой B-Lm перипортальных зон, составляли от 0,4% до 1,14%, в фазе гнойных осложнений (16 препаратов) значения относительной площади, занимаемой B-Lm перипортальных зон, находились в интервале от 1,41% до 4,98%. При оценке относительной площади МФ паренхимы печени в доинфекционной фазе ОДП (13 препаратов) получены значения от 0,89% до 2,95%. В фазе гнойно-септических осложнений (17 препаратов) значения относительной площади МФ паренхимы печени находились в интервале от 4,34% до 9,52%.

Проверка выборок на нормальность распределения проводилась с помощью критерия ². Статистическая обработка осуществлялась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различие между уровнями признаков в соответствующих выборках по критерию Манна-Уитни (данные приведены в табл.1, 2) является существенным при уровне статистической значимости 1%. В табл.1 представлена оценка различий между выборками по относительной площади A(B-Lm) перипортальных зон в микропрепаратах печени пациентов с ОДП в доинфекционной фазе заболевания (выборка 1) и в фазе гнойно-септических осложнений (выборка 2) с помощью U-критерия Манна-Уитни. Принята альтернативная гипотеза, то есть различие между уровнем признака A(B-Lm) в выборках существенно при уровне статистической значимости 1% (U_эмп =0 при U_критич=51). В табл.2 представлена оценка различий между выборками по относительной площади А(МФ) в микропрепаратах печени пациентов с ОДП в доинфекционной фазе (выборка 1) и в фазе гнойно-септических осложнений (выборка 2) с помощью U-критерия Манна-Уитни. Принята альтернативная гипотеза, то есть различие между уровнем признака A(B-Lm) в выборках существенно при уровне статистической значимости 1% (U_эмп=0 при U_критич =55). Наличие гнойно-септических осложнений острого деструктивного панкреатита соответствовало интраоперационным данным, результатам бактериологического анализа содержимого брюшной полости и забрюшинного пространства.

Таким образом, описанные изменения морфометрических параметров печени для B-Lm перипортальных областей и МФ паренхимы долек могут быть использованы в качестве объективного критерия для верификации стадии гнойно-септических осложнений при ОДП, что позволяет использовать данный способ в качестве нового критерия для своевременной коррекции лечебных мероприятий, включая оперативные вмешательства. Описанный метод сопряжен с меньшей опасностью и характеризуется большей простотой технического исполнения пункционной биопсии печени, нежели пункция забрюшинной клетчатки, а также экономически более выгоден (не требует КТ-контроля. Затраты на иммуногистохимическое исследование и обработку морфометрических данных сравнительно меньше, чем при применении серологических маркеров инфицирования некроза в динамике), метод обладает высокой точностью.

Табл.1
Выборка 1, А	Ранг	Выборка 2, А	Ранг
1,02	8	1,93	18
0,43	2	2,8	22
1,08	11	3,01	24
0,47	5	1,76	16
0,72	7	4,93	28
0,44	3,5	2,92	23
1,05	9	1,74	15
0,44	1	1,41	14
1,12	12	3,29	26
1,14	13	3,54	27
1,06	10	3,18	25
0,59	6	2,59	21
0,44	3,5	2,45	19
		1,88	17
		4,98	29
		2,52	20
Сумма	91		344
Uэмп=0 (Uкритич=51 при р 0,01).

Табл.2
Выборка 1, А	Ранг	Выборка 2, А	Ранг
2,95	13	6,82	25
2,62	7,5	5,63	22
2,84	10	5,24	19
2,27	3	6,9	26
2,85	11	5,27	20
2,41	4	5,17	17
0,89	1	7,12	27
2,94	12	4,67	15
2,57	6	9,52	30
2,52	5	8,53	29
2,75	9	6,72	24
2,62	7,5	7,33	28
1,4	2	5,61	21
		5,23	18
		4,34	14
		5,91	23
		4,86	16
Сумма	91		374
Uэмп=0 (Uкритич=55 при р 0,01).