способ прогнозирования клинической формы хронического лимфолейкоза

Формула изобретения

Способ прогнозирования агрессивной формы хронического лимфолейкоза, включающий исследование лимфоцитов периферической венозной крови, выделение ДНК с последующими амплификацией и рестрикцией, отличающийся тем, что проводят генотипирование полиморфного локуса 309T>G гена главного регулятора супрессора опухолей p53 (MDM2) и при выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития агрессивной формы хронического лимфолейкоза.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, может быть использовано для прогнозирования риска развития хронического лимфолейкоза.

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) - моноклональное заболевание крови, относящееся к гемобластозам и характеризующееся накоплением атипичных В-лимфоцитов, преимущественно, в крови, костном мозге, лимфатических узлах, печени и селезенке.

При исследовании механизмов такого сложного многостадийного процесса, как опухоль, мутациям генов отводится большая роль. Хотя изменение отдельного онкогена может вызывать предрасположенность к раку, для того чтобы опухоль развилась, необходимы последующие мутации, затрагивающие другие онкогены, в частности, гены-суппрессоры опухолей или гены, контролирующие программируемую клеточную смерть. Каждый из генов, принадлежащих к этим трем категориям, выполняет свою роль по разным механизмам. Вопрос о том, как они взаимодействуют в многоступенчатом процессе, приводящем в конечном счете к возникновению раковой клетки, и какова их роль в нормальных процессах жизнедеятельности, до конца не раскрыт.

Белок р53 - это транскрипционный фактор, который регулирует клеточный цикл и является супрессором образования злокачественной трансформации клеток (р53, OMIM 191170. В нормальных условиях, наряду с белком р53, в клетке экспрессируется главный регулятор супрессора опухолей р53 - белок MDM2 (OMIM 164785). N-концевой домен белка MDM2 связывается с N-концевым трансактивирующим доменом белка р53, что ведет к снижению активности последнего. Показано, что повышенная экспрессия белка MDM2 является важным фактором прогрессии опухолей. Ген белка MDM2 локализован на длинном плече 12 хромосомы в локусе 12q14.3-12q15.

Существует много предложений по прогнозированию различных форм ХЛЛ на основе данных биохимического, иммунохимического, цитологического и молекулярно-генетического обследования. Так, Т.П.Загоскиной, В.И.Шардаковым, Е.Л.Назаровой, М.М.Куликовой, И.М.Земцовой предложен способ дифференциальной диагностики доброкачественной и прогрессирующей формы хронического лимфолейкоза на основе определение ²-микроглобулина в сыворотке крови с помощью радиоиммунологического метода с I¹²⁵ в дебюте заболевания, на ранних стадиях опухолевого процесса, отличающийся тем, что доброкачественную форму ХЛЛ определяют уровнем ²-микроглобулина <5 мг/л; а прогрессирующую >5 мг/л (RU 2242004, 2003 г.). Однако данный метод остается достаточно трудоемким и дорогостоящим. Также его недостатком, на который указывают авторы, является прогнозирование формы заболевание лишь в его дебюте.

Известен способ дифференциальной диагностики развернутой и терминальной стадии ХЛЛ (Цепова Е.Л., Литвинов А.В.). В крови больного определяют способность эритроцитов сорбировать витальные красители. При значении сорбционной способности эритроцитов менее 44,5% судят о развернутой стадии, при ее значении более 44,5% - о терминальной стадии ХЛЛ [патент RU 2138808, 1999 г.]. Существенным недостатком этого способа является отсутствие ранней диагностики ХЛЛ.

Известен способ диагностики форм ХЛЛ (Дудко Е.Т., Тищенко Л.М.). В лимфоцитах периферической крови больного определяют количество ядрышковых организаторов на клетку путем импрегнации серебром и при значении их 1,0-1,39 диагностируют прогрессирующий вариант ХЛЛ, а при значении - 1,4-1,7 диагностируют опухолевую форму заболевания [патент RU 2068995, 1996 г.]. Способ позволяет упростить диагностику форм ХЛЛ и повысить ее точность. Недостатками данного метода является, невозможность диагностики ХЛЛ до начала заболевания и в ранних периодах заболевания.

Прототипом изобретения является способ прогнозирования течения и развития хронического лимфолейкоза, предложенный Б.А.Бакировым, А.Б.Бакировым, Т.В.Викторой, О.В.Гринчук [патент RU 2248574, 2003], включающий генотипирование полиморфных локусов генов TNFA и TNFB, на основе которого делается прогноз о течении и риске развития ХЛЛ. Недостатком данного способы является то, что прогнозирование основано на двух генных полиморфизмах, точность прогнозирования ниже.

Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования агрессивной и доброкачественной формы ХЛЛ на самых ранних стадиях развития заболевания.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования агрессивной формы хронического лимфолейкоза, включающем исследование лимфоцитов периферической венозной крови, выделение ДНК с последующими амплификацией и рестрикцией, согласно изобретению проводят генотипирование полиморфного локуса 309T>G гена главного регулятора супрессора опухолей р53 (MDM2) и при выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития агрессивной формы хронического лимфолейкоза.

Предлагаемый способ прогнозирования клинической формы хронического лимфолейкоза осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической венозной крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press; - 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисHCl (pH 7,6).

2. Смесь центрифугируется 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, pH 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°C.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трисHCl до pH 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной H₂O; раствор хранят при -20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательность олигонуклеотидных праймеров для полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 F: 5'-CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG-3' R: 5'-CTGAGTCAACCTGCCCACTG-3'. Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 тМ MgCl₂ , 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°C, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°C - 45 секунд, 55°C - 45 секунд, 72°C - 45 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°C в течение 7 минут.

Нуклеотидную замену T G в положении 309 гена MDM2 выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Msp A1I, смесь выдерживают при 37°C в течение 10-12 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl pH=7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с pH=8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Генотипы полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 157 пар нуклеотидов (пн) идентифируется аллель Т и гомозиготный генотип ТТ, при наличии двух фрагментов размером 157 и 109 пн идентифицируется гетерозиготный генотип TG, при наличии фрагмента размером 109 пн идентифицируется гомозиготный по редкому аллелю генотип GG. При генотипировании полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 генетическим маркерами злокачественной формы ХЛЛ является генотип GG полиморфного локуса 309T>G гена MDM2.

Обследовано 133 больных ХЛЛ, находившихся на стационарном лечении в гематологическом отделении Республиканской клинической больнице. Средний возраст обследованных пациентов, отобранных случайным образом, составил 49,57±1,42 лет. Половое соотношение мужчин к женщинам - 56,4% (75) к 43,6%(58). Клиническое обследование больных проводилось врачами больницы и включало в себя обязательные и дополнительные методы исследования.

В группу с агрессивной формой ХЛЛ вошли больные с прогрессирующим развитием заболевания (быстрое нарастание лимфоузлов и селезенки, диффузный или диффузно-интерстициальный рост опухоли в костном мозге), опухолевой трансформацией клеток (наличие больших плотных конгломератов лимфоузлов, диффузный рост опухоли в костном мозге) и абдоминальной формой (отличающейся наличием конгломератов лимфоузлов в брюшной полости и диффузной пролиферацией в трепанате), плохим ответом на проводимую терапию, небольшим сроком выживаемости. Так же включена опухолевая, спленомегалическая и костномозговая форма классификации А.И. Воробьева. В группу с доброкачественным течением вошли все остальные пациенты.

Больные наблюдались в амбулаторных условиях. Длительность наблюдения с момента установления заболевания более двух лет.

С целью выявления клинико-генетических особенностей течения ХЛЛ проведено исследование полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 между группой с агрессивной и доброкачественной формой хронического лимфолейкоза (таблица).

Проведя статистический анализ связи полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 с течением ХЛЛ было показано, что генотип GG связан со злокачественным течением заболевания ( 2=4,87; p=0,028; OR=3,27; 95% CI 1,22-8,72), также показано, что генотип TG ассоциирован с доброкачественным течением ХЛЛ ( 2=6,50; p=0,012; OR=0,36; 95% CI 0,18-0,76).

На основании полученных результатов можно сделать вывод об ассоциации генотипа GG полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 с агрессивной формой ХЛЛ.

Для иллюстрации приведем клинический пример. Больной К., 1975 года рождения, город Ишимбай, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в марте 2008 года, подтвержден стернальной пункцией, костный мозг богат клеточными элементами, представлен зрелыми лимфоцитами 79%. Химиотерапию не получал. В настоящее время диагноз ХЛЛ, стадия по K. Rai II. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 выявило у больного генотип GG, что позволило, соответственно, прогнозировать агрессивную форму ХЛЛ. Прогноз был подтвержден в результате наблюдения за пациентом, у которого наблюдалось быстрое нарастание лимфоузлов и селезенки, диффузный рост опухоли в костном мозге, плохой ответом на проводимую терапию, срок жизни после постановки диагноза 6 месяцев.

Таблица
Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 в группах со злокачественной формой и доброкачественной формой ХЛЛ
	Злокачественная форма ХЛЛ (N=55)		Доброкачественная форма (N=68)		2	P	OR	CI - 95%
	Абс.	%	Абс.	%
TT	18	32,73	17	25,00	0,55	0,458	1,46	0,67-3,21
TG	22	40,00	44	64,71	6,50	0,012	0,36	0,18-0,76
GG	15	27,27	7	10,29	4,87	0,028	3,27	1,22-8,72
T	58	52,73	78	57,35	0,36	0,551	0,83	0,50-1,38
G	52	47,27	58	42,65	0,36	0,551	1,21	0,73-2,00