способ определения индолентной и прогрессирующей форм хронического лимфолейкоза в стадии а

Формула изобретения

Способ прогнозирования индолентной и прогрессирующей форм хронического лимфолейкоза, включающий определение количества NK-клеток в сыворотке крови с помощью проточной цитометрии в дебюте заболевания, отличающийся тем, что на ранних стадиях опухолевого процесса при индолентной форме ХЛЛ относительное количество NK-клеток в периферической крови регистрируется 5,0%, абсолютное количество 7,0·10⁹/л, а при прогрессирующей форме ХЛЛ процентное содержание NK-клеток <5,0%, абсолютное количество <7,0·10⁹/л.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемая разработка относится к области медицины, в частности к гематологии, онкологии.

Одной из важнейших задач современной диагностики хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) является выявление ряда факторов, позволяющих в стадии А предсказывать дальнейшее клиническое течение заболевания. В последнее десятилетие это стало особенно актуальным в связи с появлением новых эффективных лекарственных препаратов и режимов лечения ХЛЛ с включением моноклональных анти-CD20 и анти-CD52 антител, иммуномодуляторов и аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, с помощью которых у большинства пациентов можно получить длительные полные клинико-гематологические и молекулярные ремиссии.

Особенностью ХЛЛ является выраженная гетерогенность клинического течения. Продолжительность жизни больных колеблется от нескольких месяцев до десятков лет. В одних случаях заболевание имеет вялотекущее (индолентное) течение и длительное время (24 и более месяцев) не требует назначения терапии. При этом выживаемость больных не отличается от таковой в популяции населения в целом. В других случаях болезнь быстро прогрессирует и, несмотря на проводимое интенсивное лечение, большинство пациентов погибает в течение ближайших 5-7 лет после постановки диагноза [1].

Существующие системы стадирования K.R. Rai и J.L. Binet не позволяют определить индолентную и прогрессирующую формы ХЛЛ на ранних стадиях заболевания и, следовательно выбрать адекватную тактику лечебных мероприятий [2]. В то же время эффективность лечения больных с прогрессирующей формой заболевания во многом зависит от своевременности начала терапии. Если несколько лет назад уточнение формы ХЛЛ не имело большого значения, то на данном этапе с появлением специфических и достаточно агрессивных терапевтических вмешательств положение изменилось. Ранняя диагностика индолентной формы ХЛЛ позволит избежать неоправданного агрессивного лечения. Ранняя диагностика прогрессирующей формы ХЛЛ позволит избежать неоправданного применения неэффективных традиционных программ терапии, которые только снижают возможности последующих интенсивных лечебных мероприятий. Поскольку на современном этапе имеется возможность проведения эффективной терапии в оптимальные сроки, актуальной становится разработка информативных стратификационных параметров для прогнозирования течения ХЛЛ.

В настоящее время известно большое количество признаков, которые влияют на длительность периода от момента постановки диагноза до начала лечения, эффективность терапии и продолжительность жизни больных ХЛЛ. Наиболее точными и значимыми из них являются мутационный статус генов вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов и цитогенетические нарушения [1]. Однако данные методы являются технологически сложными, долговременными, дорогостоящими и неприемлемыми для большинства лабораторий, вследствие чего не могут широко использоваться в рутинной клинической практике. В то же время у больных ХЛЛ в момент постановки диагноза легко доступным является исследование показателей иммунологической реактивности организма, включая эффекторные иммунные клетки, определение которых не связано с разработкой и реализацией новых трудновыполнимых тестов. На сегодняшний день доказано, что у больных ХЛЛ имеются разнообразные нарушения иммунного ответа. При этом характерны изменения физиологической активности важнейших эффекторных клеток не только системы адаптивного иммунитета - CD3⁺/CD4⁺ Т-хелперов, CD3 ⁺/CD8⁺ цитотоксических Т-лимфоцитов, но и системы естественной резистентности организма - CD3^-CD16/56 ⁺ натуральных киллерных клеток (NK-клеток). Известно, что NK-клетки играют ведущую роль в противоопухолевом иммунитете. Они обладают уникальной способностью быстро и без предварительной иммунизации лизировать клетки-мишени, в том числе опухолевые клетки, независимо от антител и комплемента [3]. Кроме того, от функций NK-клеток зависят темпы прогрессирования заболевания. К сожалению, до сих пор при ХЛЛ недооценивалось непосредственное вовлечение в опухолевый процесс клеток иммунной системы и не изучалось прогностическое значение иммунного компонента.

Обязательным критерием диагноза ХЛЛ является наличие у пациента абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови более 5×10⁹/л, а также характерного иммунофенотипа лимфоидных клеток - экспрессия CD19, CD5, CD23, слабая экспрессия CD20 и CD79b, отсутствие CD10 и FMC7, рестрикция легких цепей иммуноглобулинов - к или . В то же время считается, что наиболее значительное повышение относительного (более 30%) и абсолютного количества лимфоцитов (5-30×10⁹/л и более) в костном мозге и периферической крови в момент постановки диагноза наблюдается, как правило, при прогрессирующей форме ХЛЛ. По количеству лимфоцитов косвенно можно судить о размере опухолевой массы [2]. Недостатком вышеуказанного признака является то, что как относительное, так и абсолютное число лимфоцитов не представляет собой только меру опухолевого клона клеток. Помимо опухолевых В-лимфоцитов, относительное и абсолютное число лимфоцитов у больных ХЛЛ включает в себя нормальные В-лимфоциты, Т-лимфоциты и NK-клетки. Поэтому общее количество лимфоидных элементов при ХЛЛ не может использоваться в качестве абсолютного признака прогрессии опухолевого процесса.

Заявителем и авторами предлагается новая разработка, направленная на определение индолентной или прогрессирующей форм заболевания у больных ХЛЛ в стадии А. По результатам патентной и отраслевой литературы авторами не обнаружено идентичных способов прогнозирования.

Исследования по изучению прогностической значимости количества NK-клеток у больных ХЛЛ проводились в гематологической клинике ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в течение 5 лет. Авторами проведено изучение относительного и абсолютного количества NK-клеток в периферической крови у 60 больных ХЛЛ в стадии А, из них у 27 (45%) больных заболевание характеризовалось индолентным течением и у 33 (55%) пациентов - прогрессирующим. По результатам исследования получены данные, которые приведены в таблице 1 и 2 (Приложение 1 и 2).

Из таблицы 1 и 2 видно, что при относительном содержании 5,0% и при абсолютном количестве NK-клеток в периферической крови 0,7×10⁹/л - в 100% случаев отмечалось индолентное течение ХЛЛ, а при относительном количестве <5,0% и при абсолютном числе NK-клеток <0,7×10⁹/л - в 100% случаев наблюдалось прогрессирующее течение заболевания (p<0,001).

Следовательно, низкое относительное и абсолютное количество NK-клеток у больных ХЛЛ в дебюте заболевания может рассматриваться в качестве дополнительного признака прогрессирующего течения заболевания.

При индолентной форме ХЛЛ, несмотря на то, что больные не получали специфической терапии, у них не наблюдалось нарастания лейкоцитоза, абсолютного лимфоцитоза, увеличения лимфатических узлов на протяжении 24 месяцев и более. Печень и селезенка оставались нормальных размеров. У пациентов с прогрессирующей формой заболевания удвоение числа лимфоцитов, увеличение размеров лимфатических узлов, селезенки и печени, развитие анемии и тромбоцитопении отмечалось в ближайшие 12-24 месяца от момента постановки диагноза. Срок наблюдения за больными составил 5 лет. На момент оценки результатов исследования все пациенты с индолентным течением ХЛЛ живы. Диагностирование прогрессирующей формы ХЛЛ в стадии А позволило назначить больным химиотерапию с включением моноклональных анти-CD20 антител (n=18), в результате которой удалось получить клинически значимый лечебный общий эффект у 17 (94%) пациентов, из них у 12 (66%) - полную ремиссию, у 5 (28%) - частичную ремиссию. Медиана выживаемости у больных с прогрессирующей формой заболевания, не получивших иммунохимиотерапию (n=15), составила 3,6 года. У пациентов с прогрессирующей формой ХЛЛ, получивших иммунохимиотерапию (n=18), медиана выживаемости не достигнута (больные наблюдаются по настоящее время) (лог-ранг тест, p=0,036).

Таким образом, важность определения индолентной и прогрессирующей форм ХЛЛ в стадии А заключается в возможности прогнозирования дальнейшего течения болезни и в различной тактике ведения больных, что позволит увеличить количество пациентов с достигнутой полной ремиссией и продлить продолжительность их жизни.

Литература

1. Клиническая онкогематология: руководство для врачей / под ред. М.А. Волковой. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2007. - 1120 с.

2. Руководство по гематологии / под ред. А.И. Воробьева. - М.: Медицина, 2003. - 448 с.

3. Пинегин Б.В. NK-клетки: свойства и функции / Б.В. Пинегин, С.В. Дамбаева // Иммунология. - 2007. - Т.28, № 2. - С.105-113.

Приложение 1
Таблица 1
Группа сравнения(n=50)			Индолентная форма ХЛЛ(n=27)			Прогрессирующая форма ХЛЛ (n=33)
№	Здоровые лица	NK-клетки, %	№	Больные	NK-клетки, %	№	Больные	NK-клетки, %
1	X	12,5	1	В	6,8	1	П	4,3
2	А	14,4	2	К	7,3	2	Т	2,6
3	К	11,6	3	М	5,8	3	Б	3,8
4	В	12,8	4	С	6,3	4	Ш	4,7
5	3	12,7	5	О	5,4	5	Ж	2,9
6	Ш	15,4	6	К	5,5	6	Л	4,6
7	У	13,8	7	С	6,8	7	Ч	4,2
8	Н	12,2	8	Ш	5,2	8	О	3,6
9	Р	13,9	9	Л	5,7	9	И	4,1
10	О	12,2	10	Я	8,1	10	К	2,4
11	М	9,7	11	К	7,4	11	Р	3,1
12	И	15,5	12	С	5,2	12	П	4,2
13	Ц	10,4	13	З	8,1	13	Д	4,0
14	Л	11,1	14	С	6,3	14	Д	4,8
15	Г	9,6	15	К	7,9	15	Б	2,1
16	И	11,7	16	Х	6,1	16	А	3,7
17	В	15,9	17	С	8,8	17	Б	1,9
18	Б	19,4	18	Б	5,9	18	С	4,7
19	Т	9,4	19	П	6,1	19	Б	3,6
20	О	10,5	20	А	5,5	20	П	4,7
21	Я	12,7	21	М	6,4	21	Я	4,3
22	В	13,5	22	Ш	5,1	22	В	2,9
23	Ч	11,3	23	Н	5,6	23	Г	4,2
24	С	13,9	24	Ч	7,5	24	П	3,9
25	Х	9,2	25	Ж	6,8	25	С	3,8
26	А	11,3	26	Ц	7,3	26	Р	4,3
27	М	13,7	27	К	5,1	27	Ш	3,9
28	К	10,8				28	С	2,5
29	З	14,4				29	Б	4,8
30	Л	9,9				30	Г	2,1
31	Ю	11,6				31	Г	4,5
32	С	18,4				32	Т	4,7
33	Ш	10,8				33	А	2,0
34	Н	10,4
35	М	14,3
36	Т	10,7

Продолжение таблицы 1
37	В	11,9
38	Я	9,8
39	Г	9,4
40	н	11,4
41	А	13,2
42	И	14,9
43	Ш	10,3
44	К	17,5
45	Н	16,2
46	С	13,6
47	П	12,8
48	Б	11,5
49	Л	9,3
50	Ч	13,1
12,5 (11,8-13,2) 1			6,4(6,0-6,9)*			3,7(3,4-4,0)***
Примечание. 1 Данные представлены в виде средней арифметической и 95% доверительного интервала.
*Достоверность различия относительного содержания NK-клеток у больных с индолентной и прогрессирующей формами ХЛЛ по сравнению с группой сравнения (p<0,001)
**Достоверность различия относительного содержания NK-клеток между группами больных с индолентной и прогрессирующей формами ХЛЛ (p<0,001)

Приложение 2
Таблица 2
Группа сравнения(n=50)			Индолентная форма ХЛЛ (n=27)			Прогрессирующая форма ХЛЛ (n=33)
№	Здоровые лица	NK-клетки, ×109/л	№	Больные	NK-клетки, ×109/л	№	Больные	NK-клетки, ×109/л
1	X	0,54	1	В	1,08	1	П	0,65
2	А	0,78	2	К	1,20	2	Т	0,23
3	К	0,78	3	М	0,72	3	Б	0,66
4	В	0,67	4	С	0,75	4	Ш	0,67
5	З	0,90	5	O	0,73	5	Ж	0,33
6	Ш	0,95	6	К	0,87	6	Л	0,41
7	У	1,14	7	С	1,26	7	Ч	0,22
8	Н	1,09	8	Ш	0,83	8	О	0,54
9	Р	0,53	9	Л	0,74	9	И	0,28
10	О	0,57	10	Я	1,22	10	К	0,55
11	М	0,49	11	К	1,56	11	Р	0,63
12	И	0,78	12	С	0,84	12	П	0,46
13	Ц	0,63	13	З	1,02	13	Д	0,40
14	Л	0,82	14	С	0,89	14	Д	0,59
15	Г	0,72	15	К	1,72	15	Б	0,55
16	И	0,97	16	Х	1,61	16	А	0,17
17	В	1,30	17	С	0,93	17	Б	0,29
18	Б	1,12	18	Б	0,72	18	С	0,03
19	Т	0,39	19	П	0,78	19	Б	0,67
20	О	0,45	20	А	0,75	20	П	0,53
21	Я	0,58	21	М	0,94	21	Я	0,68
22	В	0,96	22	Ш	0,81	22	В	0,14
23	Ч	0,88	23	Н	0,79	23	Г	0,22
24	С	0,88	24	Ч	0,76	24	П	0,37
25	Х	0,63	25	Ж	1,12	25	С	0,68
26	А	0,78	26	Ц	0,70	26	Р	0,63
27	М	1,01	27	К	0,92	27	Ш	0,45
28	К	0,92				28	С	0,28
29	З	0,50				29	Б	0,17
30	Л	0,42				30	Г	0,08
31	Ю	0,61				31	Г	0,54
32	С	1,03				32	Т	0,37
33	Ш	0,72				33	А	0,02
34	Н	0,72
35	М	1,00
36	Т	0,68

Продолжение
таблицы 2
37	В	0,84
38	Я	0,67
39	Г	0,51
40	Н	0,49
41	А	0,58
42	И	0,72
43	Ш	0,52
44	К	1,37
45	Н	1,30
46	С	0,87
47	П	0,68
48	Б	0,68
49	Л	0,66
50	Ч	0,94
0,78(0,71-0,84) 1			0,97(0,86-1,09)*			0,41 (0,34-0,48)***
Примечание. 1 Данные представлены в виде средней арифметической и 95% доверительного интервала.
*Достоверность различия абсолютного количества NK-клеток у больных с индолентной и прогрессирующей формами ХЛЛ по сравнению с группой сравнения (p<0,001)
**Достоверность различия абсолютного количества NK-клеток между группами больных с индолентной и прогрессирующей формами ХЛЛ (p<0,001)

Клинические примеры

Клинический пример 1.

Больной М., 58 лет.

В январе 2007 года установлен диагноз: хронический лимфолейкоз, А стадия. На момент постановки диагноза больной предъявлял жалобы на незначительную слабость, снижение работоспособности. При обследовании: общее состояние удовлетворительное. Периферические лимфатические узлы, печень и селезенка не увеличены. В общем анализе крови: эритроциты - 4,59×10¹² /л, гемоглобин - 134 г/л, лейкоциты - 22,6×10⁹ /л, зрелые лимфоциты - 65% (абсолютное количество - 14,7×10%), тромбоциты - 245×10⁹/л. При исследовании миелограммы инфильтрация костного мозга зрелыми лимфоцитами составила 54%. Иммунофенотип лимфоидных элементов: CD19+, CD5+, CD23+, CD10-, CD20+, CD79b+/-, FMC7-.

В момент постановки диагноза показания для начала химиотерапии отсутствовали. Через 44 месяца констатировано прогрессирование заболевания. В мае 2010 года назначена химиотерапия по программе «RFC» (ритуксимаб, флударабин, циклофосфан), проведено 6 курсов, достигнута полная ремиссия. В настоящее время пациент находится на диспансерном наблюдении у врача-гематолога, последний осмотр состоялся 16.02.12. Учитывая то, что у больного М. показания для начала лечения появились лишь спустя 3,7 года после постановки диагноза хронического лимфолейкоза, течение заболевания оценено как индолентное. Относительное содержание NK-клеток в периферической крови в момент первичного обследования равнялось 6,4%, абсолютное число - 0,94×10⁹/л.

Клинический пример 2.

Больной Б., 57 лет.

Обратился к врачу-гематологу в сентябре 2007 года с жалобами на небольшую слабость. При обследовании: общее состояние удовлетворительное. Размеры периферических лимфатических узлов, печени и селезенки были в норме. В общем анализе крови: эритроциты - 4,76×10⁹/л, гемоглобин - 133 г/л, лейкоциты - 24,6×10⁹/л, лимфоциты - 63% (абсолютное количество - 15,5×10⁹/л, тромбоциты - 205×10 ⁹/л. По данным миелограммы инфильтрация костного мозга лимфоидными элементами составила 57%. Иммунофенотип лимфоидных элементов: CD19+, CD5+, CD23+, CD10-, CD20+, CD79b+/-, FMC7-. На основании клинико-лабораторных данных был поставлен диагноз хронического лимфолейкоза, А стадия.

Прогрессирование заболевания выявлено через 8 месяцев после постановки диагноза (увеличились размеры периферических лимфатических узлов до 2,5×2,0 см, селезенки до 143×68 мм, вырос лейкоцитоз до 182×10 ⁹/л, лимфоцитоз до 90%). В июле 2008 года начата химиотерапия по программе «RFC» (ритуксимаб, флударабин, циклофосфан), проведено 6 курсов, в результате которых достигнута частичная ремиссия. В марте 2009 года развился рецидив заболевания, проведена монотерапия алемтузумабом. В июле 2010 года пациент умер от инфекционных осложнений.

Поскольку у больного показания к терапии появились менее чем через 12 месяцев от момента постановки диагноза, была установлена прогрессирующая форма хронического лимфолейкоза. Относительное содержание NK-клеток в периферической крови в момент первичного обследования составило 1,9%, абсолютное количество - 0,29×10⁹/л.

Таким образом, у представленных пациентов диагноз хронического лимфолейкоза был установлен в стадии А. В момент постановки диагноза клиническая картина заболевания, показатели общего анализа крови, миелограммы и иммунофенотипирования лимфоидных элементов были идентичными. Вместе с тем наблюдалась достоверная разница в относительном и абсолютном количестве NK-клеток в периферической крови. У больного М. с индолентной формой хронического лимфолейкоза относительное и абсолютное количество NK-клеток было более чем в 3 раза выше (6,4% и 0,94×10⁹/л) по сравнению с аналогичными показателями у больного Б. (1,9% и 0,29×10⁹/л), у которого была установлена прогрессирующая форма заболевания. Следовательно, по относительному и абсолютному количеству NK-клеток в периферической крови можно предсказывать индолентную или прогрессирующую форму хронического лимфолейкоза.