штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения нефти и дизельного топлива

Формула изобретения

Штамм Pseudomonas citronellolis, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под регистрационным номером RCAM 01441 и используемый для разложения нефти и дизельного топлива.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и дизельное топливо, и которая может быть использована для очистки загрязненных почв.

Известен консорциум штаммов углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas aeruginosa НД К3-1 и Pseudomonas fluorescens НД К3-2 (Патент РФ № 2312719, C12N 1/26, В09С 1/10, опубл. 2007), который выделен из образцов почв и подземных вод карстовых полостей, отобранных на территории Пермской области и используемый для деструкции нефти и нефтепродуктов.

Следует отметить, что выращивание смеси культур, в данном случае консорциума двух штаммов, возможно при больших материальных и энергозатратах, в сравнении с наращиванием биомассы, состоящей из одной культуры клеток микроорганизмов.

Известен штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa XP-25 (Патент РФ № 2270806, C12N 1/20, C02F 3/34, C12R 1/385, опубл. 2006), который был выделен из фенолзагрязненных почв Стерлитамакского нефтехимического завода путем культивирования почвенного образца в минерализованной среде с последующим отбором наиболее активных форм, и используемый для очистки сточных вод химических предприятий от ароматических соединений.

Из представленных в патенте данных следует, что спектр действия штамма Pseudomonas aeruginosa XP-25 направлен на утилизацию ароматических соединений, в частности фенола, и не распространяется на другие «тяжелые» фракции углеводородов, а также экотоксикантов, таких как спирты, альдегиды, технические масла, жиры и др.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств и получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и дизельного топлива, которые являются единственными источниками углерода и энергии.

Для достижения поставленной задачи предложен штамм Pseudomonas citronellolis 48-У, выделенный из осадка водоема, расположенного в овраге Медвежий под складом горюче-смазочных материалов. Ульяновской области. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под номером RCAM01141.

Выделение штамма осуществлялось путем культивирования исходного образца загрязненного нефтью осадка водоема в жидкой минеральной среде с добавлением углеводородов с последующим рассевом на мясопептонный агар (МПА) для получения изолированных колоний.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определителе бактерий Bergey (Bergey's. Manual of Systematic Bacteriology. 1986. 8^th ed V.2. Baltimore-Londone, William & Wilkins), а также на основании изучения последовательности генов 16S рРНК.

Культивирование в лабораторных условиях производилось на питательных средах следующего состава:

1) Среда Кинг Б (глицерин - 10,0 г/л; пептон - 20,0 г/л; K ₂HPO₄ - 1,5 г/л; MgSO₄ - 1,5 г/л; агар-агар - 15,0 г/л), рН среды ~7,6 до стерилизации.

2) Минеральная среда с С₁₄-С₁₇ для сохранения практической ценности культуры: (K₂HPO₄ - 0,5 г/л; KH₂PO₄ - 0,5 г/л; MgSO ₄ - 0,3 г/л; NH₄H₂PO₄ - 1,0 г/л; пептон - 2,0 г/л; агар-агар - 15,0; после внесения среды в пробирки до стерилизации наслаиваем ~0,8 мл фракции жидких углеводородов С₁₄-С₁₇, рН среды 7,1-7,2 до стерилизации.

Условия выращивания: на среде Кинг Б: 72 часа при 28°С, на минеральной среде с углеводородами 96-120 часов при 28°С.

Хранение штамма производят при периодическом пересеве на свежеприготовленные среды 1 раз в 3 месяца.

По морфологическим признакам штамм характеризуется как грамотрицательная палочка с закругленными концами размером 0,5×(1-1,5) мкм, подвижная с одним полярным жгутиком, спор не образует, капсулы не имеет.

Штамм Pseudomonas citronellolis 48-У характеризуется следующими культурально-морфологическими особенностями. Колонии светлого молочного цвета, прозрачные, округлые, выпуклые с ровными краями, на среде Кинг Б (пептон - 20 г/л, K₂HPO₄ - 1,5 г/л, MgSO₄×7H₂O - 1,5 г/л, глицерин - 10 г/л) дает желто-зеленую пигментацию, растет при рН 5-6, растет в присугствии 1-4% NaCl, 1% лактата натрия, гуанидин HCl, в присутствии K₂TeO₃, бутирата натрия. Облигатный аэроб (анаэробный рост только в присутствии нитратов), оптимальная температура роста 30°С. Может расти при 41°С.

Данный штамм характеризуется следующими биохимическими характеристиками. Дает положительную реакцию с тетрадецил сульфатом натрия и тетразолевым фиолетовым, утилизирует -D-глюкозу, D-фукозу, фузидиевую кислоту, глицерин, глицил-L-пролин, L-аланин, L-аргинин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутаминовую кислоту, L-гистидин, L-серин, L-пироглутаминовую кислоту, D-глюконовую кислоту, амид глюкуроновой кислоты, хиннойную кислоту, -гидроксифенилуксусную кислоту, L-молочную кислоту, лимонную кислоту, L-яблочную кислоту, D-яблочную кислоту, -кето-глутаровую кислоту, -гидрокси-D,L-масляную кислоту, -аминомасляную кислоту, пропионовую кислоту, уксусную кислоту, является чувствительным к налидиксовой кислоте, азтреонаму, тролеандомицину, рафимицину SV, линкомицину, ванкомицину и миноциклину.

Применение на практике данного штамма обусловливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения почвы нефтью и дизельным топливом.

Ниже приведены примеры биологического окисления нефти и дизельного топлива загрязненной почвы штаммом Pseudomonas citronellolis 48-У.

Подготовленная для опытов садово-огородная почва была расфасована по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый. Загрязнение почвы нефтью и нефтепродуктами осуществлялось непосредственно в стаканах. В качестве нефтяного загрязнителя были выбраны дизельное топливо и два образца нефти, качественный состав которых приведен в Табл.1. Навеска нефтяного загрязнителя в почву вносилась весовым методом и составляла ~30 г, или ~2,0 вес.% на почву. Стаканы с нефтезагрязненной почвой выдерживались в условиях лаборатории с периодическим рыхлением. Это способствовало более равномерному распределению нефтяного загрязнителя в почве и, по возможности, испарению его легких фракций.

В Табл.1 представлены результаты химико-битуминологического анализа средней пробы почв, загрязненных нефтью и дизельным топливом, вес.%. Нефть - нафтеново-ароматическая тяжелая нефть месторождения «Русское».

Таблица 1
Качественный состав исходных нефтяных загрязнителей и хлороформенных экстрактов (ХБА) образцов почвы, подготовленных для опытов по исследованию эффективности ее очистки
№ п/п	Образец	Групповой состав ХБА, вес.%				Углеводородный состав масел, вес%
		масла	бензольные смолы	спиртобензоль ные смолы	асфальтены	метаново-нафтеновая фракция	моноароматические углеводороды	Биароматичес кие углеводо роды	Полиаромати ческие углеводороды
1	Исходное дизельное топливо	89,02	3,10	5,73	2,15	81,87	10,51	7,62	-
2	Хлороформенный битумоид , почва, загрязненная дизельным топливом	88,57	1,50	6,93	3,00	73,44	19,49	3,00	4,07
3	Исходная нефть	71,95	17,89	8,94	1,22	64,52	18,38	14,84	2,26
4	Хлороформенный битумоид , почва, загрязненная нефтью	73,31	11,55	11,95	3,19	56,35	17,96	25,69	-

Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть и дизельное топливо проводилась в лабораторных условиях. В подготовленные почвенные образцы, предварительно расфасованные по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый, и загрязненные нефтью и дизельным топливом вносили культуру микроорганизмов с титром 10⁵-10⁸ кл/мл. Маточную культуру бактерий Pseudomonas citronellolis 48-У выращивали на качалке (200 об/мин) при 28°С в течение 48-72 часов в колбах со 100 мл одной из сред следующего состава, вес.%:

1. Пептон - 1%

K₂ HPO₄ - 0,15%

MgSO₄ - 0,15%

Глицерин - 1%

Вода водопроводная - остальное до 100%

pH до стерилизации 7,6

2. Мясопептонный бульон с глюкозой (0,5%) и сахарозой (0,5%).

pH до стерилизации 7,6.

Опыты проводились при комнатной температуре (в среднем 18-20°С) в течение 91 суток с периодическим перемешиванием и увлажнением по мере высыхания почвы. Увлажнение производилось стерильной водой; примерно раз в 3 недели увлажнение осуществлялось минеральной средой, содержащей K, P, N и имеющей рН до стерилизации 7,1-7,2. Почва в контрольных опытах увлажнялась только стерильной водой.

Учет численности живых клеток микроорганизмов в эксперименте проводился общепринятым методом предельных разведении на элективных средах.

Мониторинг происходящих процессов очистки нефтезагрязненной почвы выполнялся по следующим параметрам:

- содержание нефтепродуктов, мг/кг.

- содержание и качественный состав хлороформенного экстракта.

Периодичность отбора почвы на эти виды анализов составляла, как правило, 2 недели; анализ проводился согласно ГОСТу 17.1.4.01-80 и РД 52.18.575-96.

В Табл.2 приведены результаты проведенного мониторинга - содержание нефтепродуктов (НП), вес.% от первоначального содержания в почве при очистке штаммом Pseudomonas citronellolis 48-У загрязнений, состав которых приведен в Табл.1. Дано в вес.% относительно их исходного содержания в нефтезагрязненной почве.

Таблица 2
Содержание нефтепродуктов (НП) в загрязненной почве в процессе очистки штаммом Pseudomonas citronellolis 48-У
Загрязнитель	Содержание НП, вес.% от первоначального содержания в почве
	Продолжительность очистки, недели
	0	2	4	6	8	13
	Нефтепродукты
Дизельное топливо	0,0	+7,7	+5,7	-15,6	-46,3	-72,2
Нефть	0,0	-19,1	-36,3	-48,1	-59,9	-60,3

Согласно данным Табл.2, за 13 недель продолжительности опытов содержание нефтепродуктов в нефтезагрязненных образцах почвы снижается на 60,3-72,2% от первоначального их содержания. Снижение содержания нефтепродуктов в образцах, загрязненных дизельным топливом наблюдается с 6 недели, а в образцах, загрязненных нефтью, со 2 недели от начала постановки опытов. Обращает на себя внимание, что окисление нефтепродуктов в дизельном топливе отмечено только после 6 недель продолжения опытов. Объяснением этому может послужить активное окисление дизельного топлива углеводородокисляющими микроорганизмами с новообразованием промежуточных продуктов. В пользу этого свидетельствует высокий титр углеводородокисляющих микроорганизмов в почве, загрязненной дизельным топливом.

В Табл.3 приведено содержание и качественный состав ХБА нефтезагрязненной почвы по образцам Табл.1 через 91 сутки от начала опытов очистки штаммом Pseudomonas citronellolis 48-У.

Данные качественного состава ХБА - (хлороформенного битумоида а) образцов загрязненной почвы до очистки, представленных в Табл. 1, в сравнении с данными по опытным образцам, представленными в Табл. 3, позволяют сделать анализ характера изменения группового и углеводородного состава хлороформенного битумоида а в процессе биологического окисления штаммом Pseudomonas citronellolis 48-У.

Согласно результатам анализа, содержание ХБА в опытных образцах нефтезагрязненной почвы 2,69% при продолжительности опытов 91 сутки. Резко изменился и качественный состав ХБА опытных образцов почвы, по сравнению с доопытным составом ХБА. Через 91 сутки после начала опытов по утилизации нефтяного загрязнения почвы отмечается снижение наиболее доступных для микроорганизмов его фракций. Наиболее доступной для биоокисления в составе нефтяного загрязнения является фракция масел. Содержание масел снизилось до 42,71-70,12% отн.

Исходя из представленных выше данных следует, что штамм Pseudomonas citronellolis 48-У RCAM 01141 характеризуется высокой эффективностью в процессах разложения нефти и дизельного топлива и, как следствие, может быть использован для биологической очистки почв от данных загрязнителей.