штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения нефти и дизельного топлива

Классы МПК:C12N1/26 способы, использующие, или питательные среды, содержащие углеводороды
C02F3/34 отличающаяся используемыми микроорганизмами
B09C1/10 микробиологическими способами или с использованием ферментов
C12R1/38 Pseudomonas
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное унитарное предприятие "Всероссийский нефтяной научно-исследовательский геологоразведочный институт" (ФГУП "ВНИГРИ") (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-08-14
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм pseudomonas citronellolis 48-У, обладающий высокой скоростью утилизации нефти и дизельного топлива, депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под регистрационным номером RCAM 01441 и может быть использован для очистки загрязненных почв от нефти и дизельного топлива. Изобретение позволяет повысить качество очистки почв от нефти и дизельного топлива. 3 табл.

Формула изобретения

Штамм Pseudomonas citronellolis, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под регистрационным номером RCAM 01441 и используемый для разложения нефти и дизельного топлива.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и дизельное топливо, и которая может быть использована для очистки загрязненных почв.

Известен консорциум штаммов углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas aeruginosa НД К3-1 и Pseudomonas fluorescens НД К3-2 (Патент РФ № 2312719, C12N 1/26, В09С 1/10, опубл. 2007), который выделен из образцов почв и подземных вод карстовых полостей, отобранных на территории Пермской области и используемый для деструкции нефти и нефтепродуктов.

Следует отметить, что выращивание смеси культур, в данном случае консорциума двух штаммов, возможно при больших материальных и энергозатратах, в сравнении с наращиванием биомассы, состоящей из одной культуры клеток микроорганизмов.

Известен штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa XP-25 (Патент РФ № 2270806, C12N 1/20, C02F 3/34, C12R 1/385, опубл. 2006), который был выделен из фенолзагрязненных почв Стерлитамакского нефтехимического завода путем культивирования почвенного образца в минерализованной среде с последующим отбором наиболее активных форм, и используемый для очистки сточных вод химических предприятий от ароматических соединений.

Из представленных в патенте данных следует, что спектр действия штамма Pseudomonas aeruginosa XP-25 направлен на утилизацию ароматических соединений, в частности фенола, и не распространяется на другие «тяжелые» фракции углеводородов, а также экотоксикантов, таких как спирты, альдегиды, технические масла, жиры и др.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств и получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и дизельного топлива, которые являются единственными источниками углерода и энергии.

Для достижения поставленной задачи предложен штамм Pseudomonas citronellolis 48-У, выделенный из осадка водоема, расположенного в овраге Медвежий под складом горюче-смазочных материалов. Ульяновской области. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под номером RCAM01141.

Выделение штамма осуществлялось путем культивирования исходного образца загрязненного нефтью осадка водоема в жидкой минеральной среде с добавлением углеводородов с последующим рассевом на мясопептонный агар (МПА) для получения изолированных колоний.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определителе бактерий Bergey (Bergey's. Manual of Systematic Bacteriology. 1986. 8th ed V.2. Baltimore-Londone, William & Wilkins), а также на основании изучения последовательности генов 16S рРНК.

Культивирование в лабораторных условиях производилось на питательных средах следующего состава:

1) Среда Кинг Б (глицерин - 10,0 г/л; пептон - 20,0 г/л; K 2HPO4 - 1,5 г/л; MgSO4 - 1,5 г/л; агар-агар - 15,0 г/л), рН среды ~7,6 до стерилизации.

2) Минеральная среда с С1417 для сохранения практической ценности культуры: (K2HPO4 - 0,5 г/л; KH2PO4 - 0,5 г/л; MgSO 4 - 0,3 г/л; NH4H2PO4 - 1,0 г/л; пептон - 2,0 г/л; агар-агар - 15,0; после внесения среды в пробирки до стерилизации наслаиваем ~0,8 мл фракции жидких углеводородов С1417, рН среды 7,1-7,2 до стерилизации.

Условия выращивания: на среде Кинг Б: 72 часа при 28°С, на минеральной среде с углеводородами 96-120 часов при 28°С.

Хранение штамма производят при периодическом пересеве на свежеприготовленные среды 1 раз в 3 месяца.

По морфологическим признакам штамм характеризуется как грамотрицательная палочка с закругленными концами размером 0,5×(1-1,5) мкм, подвижная с одним полярным жгутиком, спор не образует, капсулы не имеет.

Штамм Pseudomonas citronellolis 48-У характеризуется следующими культурально-морфологическими особенностями. Колонии светлого молочного цвета, прозрачные, округлые, выпуклые с ровными краями, на среде Кинг Б (пептон - 20 г/л, K2HPO4 - 1,5 г/л, MgSO4×7H2O - 1,5 г/л, глицерин - 10 г/л) дает желто-зеленую пигментацию, растет при рН 5-6, растет в присугствии 1-4% NaCl, 1% лактата натрия, гуанидин HCl, в присутствии K2TeO3, бутирата натрия. Облигатный аэроб (анаэробный рост только в присутствии нитратов), оптимальная температура роста 30°С. Может расти при 41°С.

Данный штамм характеризуется следующими биохимическими характеристиками. Дает положительную реакцию с тетрадецил сульфатом натрия и тетразолевым фиолетовым, утилизирует штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения   нефти и дизельного топлива, патент № 2489484 -D-глюкозу, D-фукозу, фузидиевую кислоту, глицерин, глицил-L-пролин, L-аланин, L-аргинин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутаминовую кислоту, L-гистидин, L-серин, L-пироглутаминовую кислоту, D-глюконовую кислоту, амид глюкуроновой кислоты, хиннойную кислоту, штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения   нефти и дизельного топлива, патент № 2489484 -гидроксифенилуксусную кислоту, L-молочную кислоту, лимонную кислоту, L-яблочную кислоту, D-яблочную кислоту, штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения   нефти и дизельного топлива, патент № 2489484 -кето-глутаровую кислоту, штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения   нефти и дизельного топлива, патент № 2489484 -гидрокси-D,L-масляную кислоту, штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения   нефти и дизельного топлива, патент № 2489484 -аминомасляную кислоту, пропионовую кислоту, уксусную кислоту, является чувствительным к налидиксовой кислоте, азтреонаму, тролеандомицину, рафимицину SV, линкомицину, ванкомицину и миноциклину.

Применение на практике данного штамма обусловливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения почвы нефтью и дизельным топливом.

Ниже приведены примеры биологического окисления нефти и дизельного топлива загрязненной почвы штаммом Pseudomonas citronellolis 48-У.

Подготовленная для опытов садово-огородная почва была расфасована по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый. Загрязнение почвы нефтью и нефтепродуктами осуществлялось непосредственно в стаканах. В качестве нефтяного загрязнителя были выбраны дизельное топливо и два образца нефти, качественный состав которых приведен в Табл.1. Навеска нефтяного загрязнителя в почву вносилась весовым методом и составляла ~30 г, или ~2,0 вес.% на почву. Стаканы с нефтезагрязненной почвой выдерживались в условиях лаборатории с периодическим рыхлением. Это способствовало более равномерному распределению нефтяного загрязнителя в почве и, по возможности, испарению его легких фракций.

В Табл.1 представлены результаты химико-битуминологического анализа средней пробы почв, загрязненных нефтью и дизельным топливом, вес.%. Нефть - нафтеново-ароматическая тяжелая нефть месторождения «Русское».

Таблица 1
Качественный состав исходных нефтяных загрязнителей и хлороформенных экстрактов (ХБА) образцов почвы, подготовленных для опытов по исследованию эффективности ее очистки
№ п/пОбразец Групповой состав ХБА, вес.% Углеводородный состав масел, вес%
маслабензольные смолы спиртобензоль

ные смолы
асфальтены метаново-нафтеновая фракция моноароматические углеводородыБиароматичес

кие углеводо

роды
Полиаромати

ческие углеводороды
1 Исходное дизельное топливо 89,023,105,73 2,1581,87 10,517,62-
2Хлороформенный битумоид штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения   нефти и дизельного топлива, патент № 2489484 , почва, загрязненная дизельным топливом 88,571,506,93 3,0073,44 19,493,004,07
3Исходная нефть 71,9517,89 8,941,2264,52 18,3814,84 2,26
4Хлороформенный битумоид штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения   нефти и дизельного топлива, патент № 2489484 , почва, загрязненная нефтью73,31 11,5511,95 3,1956,3517,96 25,69-

Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть и дизельное топливо проводилась в лабораторных условиях. В подготовленные почвенные образцы, предварительно расфасованные по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый, и загрязненные нефтью и дизельным топливом вносили культуру микроорганизмов с титром 105-108 кл/мл. Маточную культуру бактерий Pseudomonas citronellolis 48-У выращивали на качалке (200 об/мин) при 28°С в течение 48-72 часов в колбах со 100 мл одной из сред следующего состава, вес.%:

1. Пептон - 1%

K2 HPO4 - 0,15%

MgSO4 - 0,15%

Глицерин - 1%

Вода водопроводная - остальное до 100%

pH до стерилизации 7,6

2. Мясопептонный бульон с глюкозой (0,5%) и сахарозой (0,5%).

pH до стерилизации 7,6.

Опыты проводились при комнатной температуре (в среднем 18-20°С) в течение 91 суток с периодическим перемешиванием и увлажнением по мере высыхания почвы. Увлажнение производилось стерильной водой; примерно раз в 3 недели увлажнение осуществлялось минеральной средой, содержащей K, P, N и имеющей рН до стерилизации 7,1-7,2. Почва в контрольных опытах увлажнялась только стерильной водой.

Учет численности живых клеток микроорганизмов в эксперименте проводился общепринятым методом предельных разведении на элективных средах.

Мониторинг происходящих процессов очистки нефтезагрязненной почвы выполнялся по следующим параметрам:

- содержание нефтепродуктов, мг/кг.

- содержание и качественный состав хлороформенного экстракта.

Периодичность отбора почвы на эти виды анализов составляла, как правило, 2 недели; анализ проводился согласно ГОСТу 17.1.4.01-80 и РД 52.18.575-96.

В Табл.2 приведены результаты проведенного мониторинга - содержание нефтепродуктов (НП), вес.% от первоначального содержания в почве при очистке штаммом Pseudomonas citronellolis 48-У загрязнений, состав которых приведен в Табл.1. Дано в вес.% относительно их исходного содержания в нефтезагрязненной почве.

Таблица 2
Содержание нефтепродуктов (НП) в загрязненной почве в процессе очистки штаммом Pseudomonas citronellolis 48-У
ЗагрязнительСодержание НП, вес.% от первоначального содержания в почве
Продолжительность очистки, недели
024 6813
штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения   нефти и дизельного топлива, патент № 2489484 Нефтепродукты
Дизельное топливо 0,0+7,7+5,7 -15,6-46,3 -72,2
Нефть 0,0-19,1-36,3 -48,1-59,9 -60,3

Согласно данным Табл.2, за 13 недель продолжительности опытов содержание нефтепродуктов в нефтезагрязненных образцах почвы снижается на 60,3-72,2% от первоначального их содержания. Снижение содержания нефтепродуктов в образцах, загрязненных дизельным топливом наблюдается с 6 недели, а в образцах, загрязненных нефтью, со 2 недели от начала постановки опытов. Обращает на себя внимание, что окисление нефтепродуктов в дизельном топливе отмечено только после 6 недель продолжения опытов. Объяснением этому может послужить активное окисление дизельного топлива углеводородокисляющими микроорганизмами с новообразованием промежуточных продуктов. В пользу этого свидетельствует высокий титр углеводородокисляющих микроорганизмов в почве, загрязненной дизельным топливом.

В Табл.3 приведено содержание и качественный состав ХБА нефтезагрязненной почвы по образцам Табл.1 через 91 сутки от начала опытов очистки штаммом Pseudomonas citronellolis 48-У.

штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения   нефти и дизельного топлива, патент № 2489484

Данные качественного состава ХБА - (хлороформенного битумоида а) образцов загрязненной почвы до очистки, представленных в Табл. 1, в сравнении с данными по опытным образцам, представленными в Табл. 3, позволяют сделать анализ характера изменения группового и углеводородного состава хлороформенного битумоида а в процессе биологического окисления штаммом Pseudomonas citronellolis 48-У.

Согласно результатам анализа, содержание ХБА в опытных образцах нефтезагрязненной почвы 2,69% при продолжительности опытов 91 сутки. Резко изменился и качественный состав ХБА опытных образцов почвы, по сравнению с доопытным составом ХБА. Через 91 сутки после начала опытов по утилизации нефтяного загрязнения почвы отмечается снижение наиболее доступных для микроорганизмов его фракций. Наиболее доступной для биоокисления в составе нефтяного загрязнения является фракция масел. Содержание масел снизилось до 42,71-70,12% отн.

Исходя из представленных выше данных следует, что штамм Pseudomonas citronellolis 48-У RCAM 01141 характеризуется высокой эффективностью в процессах разложения нефти и дизельного топлива и, как следствие, может быть использован для биологической очистки почв от данных загрязнителей.

Класс C12N1/26 способы, использующие, или питательные среды, содержащие углеводороды

штамм rhodotorula sp. для очистки почв, вод, сточных вод, шламов от нефти и нефтепродуктов -  патент 2526496 (20.08.2014)
штамм бактерий exiguobacterium mexicanum - деструктор нефти и нефтепродуктов -  патент 2523584 (20.07.2014)
штамм бактерий bacillus vallismortis - деструктор нефти и нефтепродуктов -  патент 2513702 (20.04.2014)
препарат для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов -  патент 2501852 (20.12.2013)
штамм rhodococcus erythropolis, используемый для разложения нефти -  патент 2489485 (10.08.2013)
штамм rhodococcus fascians, используемый для разложения нефти -  патент 2489483 (10.08.2013)
штамм pseudomonas aeruginosa rcam01139 для разложения нефти и дизельного топлива -  патент 2489482 (10.08.2013)
штамм micrococcus luteus, обладающий каталазной активностью и осуществляющий трансформации органических остатков природного происхождения -  патент 2488630 (27.07.2013)
штамм penicillium sp., обладающий полифункциональными свойствами и осуществляющий трансформации органических остатков природного происхождения -  патент 2487933 (20.07.2013)
биосорбент для очистки воды от углеводородных загрязнений и способ его получения -  патент 2487752 (20.07.2013)

Класс C02F3/34 отличающаяся используемыми микроорганизмами

биосорбент для ликвидации нефти с поверхности водоемов -  патент 2529771 (27.09.2014)
штамм rhodotorula sp. для очистки почв, вод, сточных вод, шламов от нефти и нефтепродуктов -  патент 2526496 (20.08.2014)
способ очистки воды и мерзлотных почв от нефти и нефтепродуктов штаммом бактерий pseudomonas panipatensis вкпм в-10593 -  патент 2525932 (20.08.2014)
способ очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов спорообразующими бактериями bacillus vallismortis -  патент 2525930 (20.08.2014)
штамм бактерий exiguobacterium mexicanum - деструктор нефти и нефтепродуктов -  патент 2523584 (20.07.2014)
способ очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов штаммом бактерий exguobacterium mexicanum -  патент 2521654 (10.07.2014)
способ очистки водного раствора, содержащего соль никеля, от ионов никеля. -  патент 2521653 (10.07.2014)
способ биологической очистки -  патент 2520561 (27.06.2014)
способ учета нефтеокисляющих бактерий в морской воде -  патент 2520084 (20.06.2014)
штамм rhodococcus sp.-деструктор нефтяных углеводородов -  патент 2518349 (10.06.2014)

Класс B09C1/10 микробиологическими способами или с использованием ферментов

способ получения биопрепарата для очистки и восстановления плодородия почвогрунтов, загрязненных нефтепродуктами -  патент 2529735 (27.09.2014)
способ детоксикации грунта, загрязненного нефтью и нефтепродуктами -  патент 2528198 (10.09.2014)
выделение белка, ответственного за восстановление урана (vi) -  патент 2527892 (10.09.2014)
способ очистки воды и мерзлотных почв от нефти и нефтепродуктов штаммом бактерий pseudomonas panipatensis вкпм в-10593 -  патент 2525932 (20.08.2014)
способ очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов спорообразующими бактериями bacillus vallismortis -  патент 2525930 (20.08.2014)
штамм бактерий exiguobacterium mexicanum - деструктор нефти и нефтепродуктов -  патент 2523584 (20.07.2014)
грунтошламовая смесь -  патент 2522317 (10.07.2014)
способ очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов штаммом бактерий exguobacterium mexicanum -  патент 2521654 (10.07.2014)
способ учета нефтеокисляющих бактерий в морской воде -  патент 2520084 (20.06.2014)
штамм rhodococcus sp.-деструктор нефтяных углеводородов -  патент 2518349 (10.06.2014)

Класс C12R1/38 Pseudomonas

способ очистки воды и мерзлотных почв от нефти и нефтепродуктов штаммом бактерий pseudomonas panipatensis вкпм в-10593 -  патент 2525932 (20.08.2014)
препарат для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений и способ его получения -  патент 2516412 (20.05.2014)
ассоциация штаммов бактерий-нефтедеструкторов и способ ремедиации нефтезагрязненных объектов -  патент 2509150 (10.03.2014)
штамм rhodococcus erythropolis, используемый для разложения нефти -  патент 2489485 (10.08.2013)
штамм rhodococcus fascians, используемый для разложения нефти -  патент 2489483 (10.08.2013)
штамм penicillium sp., обладающий полифункциональными свойствами и осуществляющий трансформации органических остатков природного происхождения -  патент 2487933 (20.07.2013)
штамм бактерий pseudomonas panipatensis вкпм в-10593 - деструктор нефти и нефтепродуктов -  патент 2484130 (10.06.2013)
способ получения гидроксилированного l-лейцина и бактерия, трансформированная днк, кодирующей диоксигеназу -  патент 2468085 (27.11.2012)
штамм pseudomonas brassicacearum, используемый для получения бактериального удобрения под зерновые, овощные и кормовые культуры -  патент 2453596 (20.06.2012)
фосфатрастворяющий штамм pseudomonas species 181a с фунгицидными свойствами -  патент 2451069 (20.05.2012)
Наверх