способ моделирования неоваскуляризации переднего отрезка глаза у крыс

Формула изобретения

Способ моделирования неоваскуляризации переднего отрезка глаза у крыс, отличающийся тем, что проводят однократное интравитреальное введение водного раствора рекомбинантного человеческого сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в дозе 3,5 мкг.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для моделирования неоваскуляризации глаза у крыс.

Сосудистые заболевания глазного дна, приводящие к развитию неоваскуляризации, являются актуальной проблемой офтальмологии. Разработка экспериментальных моделей является необходимой для изучения процессов патогенеза и поиска новых возможностей лечения.

Уровень техники.

Известен способ моделирования неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва (Сарыгина О.И., Нероев В.В., Левкина О.А. Экспериментальное моделирование пролиферативной ретинопатии путем интравитреального введения сосудистого эндотелиального фактора (VEGF) кроликам. // Офтальмология, 2009, Том 6, № 3, с.25-29), включающий многократное введение в стекловидное тело кроликов водного раствора рекомбинантного человеческого сосудистого эндотелиального фактора роста. Интравитреальные инъекции осуществляли с помощью иглы 26 gauge, в 4 мм от лимба, в меридиане 12 часов. Курс включал 6 инъекций препарата, проводимых по следующей схеме: в первые и третьи сутки вводили - по 3 мкг VEGF, на седьмые и одиннадцатые сутки - по 1,5 мкг VEGF, на пятнадцатые сутки - 1 мкг препарата. На двадцать четвертые сутки после начала эксперимента производилась инъекция разрешающей дозы - 5,0 мкг, приводящая к появлению неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва. Суммарная доза препарата составляла - 15 мкг.

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ моделирования неоваскуляризации переднего отрезка глаза у обезьян, включающий многократное интравитреальное введение обезьянам водного раствора рекомбинантного человеческого сосудистого эндотелиального фактора роста (Tolentino M.J., Miller J.W., Gragoudas E.S., Ferrara N., Adamis A.P. Vascular endothelial growth factor is sufficient to iris neovascularization and neovascular glaucoma in a nonhuman primate. // Arch Ophthalmol. Vis. Sci. - 1996. Aug; 114(8) - P.964-70). В данном способе осуществляли введение в стекловидное тело обезьян водного раствора рекомбинантного человеческого сосудистого эндотелиального фактора роста в дозе 1,25 мкг каждые 3 дня в течение месяца. Данная модель вызывает нарушение проницаемости сосудов переднего отрезка глаза и индукцию роста новообразованных сосудов в радужке и углу передней камеры у обезьян.

Недостатками аналогов являются: необходимость длительного срока наблюдения, многократные интравитреальные введения препарата, что является достаточно травматичным, а также связано с большими финансовыми затратами, обусловленными расходами на дорогостоящих животных (обезьяны), реактивы и уход.

Раскрытие изобретения.

Задачей изобретения является разработка простого и легко воспроизводимого способа моделирования неоваскуляризации переднего отрезка глаза.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение полноценной неоваскуляризации в переднем отрезке глаза в короткие сроки при минимальной хирургической манипуляции, позволяющей снизить травматичность воздействия, и обусловливает экономические преимущества, связанные с затратами на экспериментальных животных, реактивы и уход.

Технический результат достигается за счет однократного введения в стекловидное тело крыс водного раствора VEGF в дозе 3,5 мкг.

В настоящее время проведено большое количество исследований, в которых оценивалось системное действие сосудистого эндотелиального фактора роста, а также его роль при заболеваниях глаз (Bandello P., Battaglia Parodi M. Anti-VEGF // Dev Ophthalmol. Basel, Karger, 2010. P.186).

VEGF является гомодимерным гликопротеидом, который одновременно является фактором проницаемости сосудов и фактором ангиогенеза. Кроме того, ростовой фактор является активным митогенным лигандом для эндотелиальных клеток сосудов. Сосудистый эндотелиальный фактор роста также стимулирует проколлагеназную активность эндотелия и усиливает хемотаксис через сосудистую стенку клеток мезенхимальной природы, которые способствуют созреванию стромы. Эти особенности дают возможность предполагать, что VEGF играет важную роль в развитии микрососудистых осложнений, наблюдаемых при пролиферативной ретинопатии, развитие которой характеризуется гипоксией ткани, ангиогенезом и повышенной сосудистой проницаемостью. На основании этого в предлагаемом способе моделирования также использовали VEGF.

Для моделирования в офтальмологии в качестве опытных животных наиболее часто используются крысы и кролики, т.к. эти животные имеют практические преимущества, связанные с затратами на реактивы и уход (Hammes H-P, Porta M: Experimental Approaches to Diabetic Retinopathy. Front Diabetes. Basel, Karger, 2010. P42-600).

Однако использование крыс для моделирования сосудистой патологии глаза является наиболее корректным, по сравнению с использованием кроликов, т.к. по морфологическому строению и ангиоархитектонике сосуды сетчатки крысы ближе к сосудам сетчатки человека, чем у кролика. Мы провели исследование по отработке дозы VEGF при условии уменьшения количества интравитреальных введений. Было доказано морфологическими исследованиями, что доза VEGF величиной 3.5 мкг при однократном введении крысам является адекватной для создания патогенетически обоснованной модели неоваскуляризации переднего отрезка глаза. Для адекватного интравитреального введения VEGF у крыс была выбрана зона в области экватора с направлением иглы к заднему полюсу глаза.

Способ осуществляется следующим образом.

Экспериментальной крысе интравитреально вводят рекомбинантный человеческий сосудистый эндотелиальный фактор роста, например, производства фирм «Pro Spec», Израиль, «Pierce», США. Интравитреальное введение VEGF осуществляют с помощью иглы 30 gauge в области экватора по направлению к заднему полюсу глаза. Инъекцию выполняют в стерильных условиях под контролем операционного микроскопа. Введение препарата проводят однократно, в дозе 3,5 мкг. Данную дозу разводят в 0,02 мл стерильной воды для инъекций.

Пример: Крыса № 3. Крысе интравитреально ввели рекомбинантный человеческий сосудистый эндотелиальный фактор роста производства фирмы «Pro Spec», Израиль. Для введения использовали иглу 30 gauge. Инъекцию осуществили в области экватора по направлению к заднему полюсу глаза в стерильных условиях под контролем операционного микроскопа. Введение препарата провели однократно, в дозе 3,5 мкг. Дозу развели в 0,02 мл стерильной воды для инъекций.

При осмотре глаза крысы на 2 день после введения 3,5 мкг VEGF наблюдалась неоваскуляризация периферических отделов роговицы. В последующие дни наблюдалось усиление пролиферативной реакции - распространение новообразованных сосудов в центральные отделы роговицы, образование гифемы в передней камере. На 5 день неоваскуляризация занимала около 60% от площади роговицы, что не являлось препятствием для проведения флюоресцентной ангиографии (ФАГ) и осмотра глазного дна (Фиг.1).

По данным ФАГ на 2 день после интравитреального введения VEGF на ангиографических снимках наблюдалось расширение сосудов сетчатки. На 5 день эксперимента выявлялось увеличение дилатации и деформация интраретинальных вен, возникновение интраретинальных микрососудистых аномалий (Фиг.2). На 7 день эксперимента помимо имеющихся изменений отмечалось появление локальной гиперфлюоресценции, усиливающейся в поздней фазе исследования, что связанно с интенсивным просачиванием красителя из новообразованных сосудов (Фиг.3). Энуклеацию производили на 7 сутки после начала эксперимента.

Таким образом, по данным патоморфологического исследования, у крысы через 7 дней развивалась активная неоваскуляризация, преимущественно, в переднем отрезке глаза. Было выявлено, что основными тканевыми мишенями при интравитреальном введении VEGF крысы являлись роговица и зона цилиарного тела-корня радужки, изменения со стороны сетчатки были выражены в меньшей степени. В роговице отмечались многочисленные новообразованные сосуды, пронизывающие строму роговицы. Пролиферация сопровождалась лимфо-лейкоцитарной инфильтрацией (Фиг.4). Кроме этого на наружной поверхности цилиарного тела и в области корня радужки наблюдалось разрастание новообразованных сосудов, заполняющих переднюю камеру и угол передней камеры. Помимо новообразованных сосудов отмечалось появление эндотелиальных почек, свидетельствующих о начальном процессе ангиогенеза (Фиг.5). В радужке и передней камере выявлялись кровоизлияния (Фиг.6). В сетчатке наблюдалось полнокровие сосудов, периваскулярный отек, кровоизлияния и единичные новообразованные сосуды, а также изменения фоторецепторных элементов - деструкция наружных и внутренних сегментов палочек (Фиг.7). Полученные данные подтверждают получение адекватной модели неоваскуляризации переднего отрезка глаза у крысы.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить полноценную модель неоваскуляризации переднего отрезка глаза у крысы, является технически доступным, легко воспрозводимым и экономичным.