способ моделирования хронической цитостатической миелосупрессии

Формула изобретения

Способ моделирования хронической цитостатической миелосупрессии на мышах для последующего избирательного выбора лекарственного средства, корригирующего гематологические нарушения, включающий внутрибрюшинное введение циклофосфана в дозе 200 мг/кг 1 раз в семь дней в течение 5 недель до достижения стойкой миелосупрессии, определяемой содержанию нейтрофильных гранулоцитов и коммитированных клеток-предшественников грануломоноцитопоэза.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, конкретно к фармакологии и гематологии, и касается моделирования хронической миелосупрессии для изучения особенностей восстановления кроветворения и фармакологической коррекции нарушений в системе крови, развивающихся при многократном цитостатическом воздействии.

Многокурсовая химиотерапия, назначаемая при злокачественных новообразованиях, наряду с гибелью трансформированных клеток приводит к такому тяжелому для больных осложнению как угнетение кроветворения, которое усугубляется после каждого курса лечения [1, 2]. Лейкопении, анемии, тромбоцитопении, отмечаемые у большинства онкологических больных при проведении полихимиотерапии, приводят к снижению эффективности противоопухолевого лечения и повышению агрессивности роста опухоли. Как правило, специфические и неспецифические гемостимуляторы, предлагаемые для коррекции нарушений в системе крови в большинстве своем оказывают положительное действие на начальном этапе лечения. После многокурсовой химиотерапии желаемое восстановление клеток крови не наступает. Во многом это связывается с существующими подходами к созданию гемостимуляторов [3]. Значительная часть этих препаратов исследуется в условиях однократного введения цитостатиков, при этом их мишенью выступают коммитированные клетки предшественники, пул которых после 3-5 введения цитостатика, как правило, истощается. В клинической практике это бедственно сказывается на больных, гемостимуляторы оказываются не эффективными в случае применения [3].

Адекватного прототипа в проанализируемой нами литературе не обнаружено.

Задачей, решаемой данным изобретением, является создание модели хронической цитостатической миелосупрессии.

Поставленная задача решается тем, что цитостатик вводят 1 раз неделю в течение 5 недель до достижения стойкой миелосупрессии в костном мозге, определяемой по снижению содержания нейтрофильных гранулоцитов и коммитированных клеток-предшественников грануломоноцитопоэза.

Новым в предполагаемом способе является исследование содержания коммитированных кроветворных клеток-предшественников и морфологически распознаваемых клеток костного мозга и периферической крови в условиях длительного 1 раз в неделю в течение 5 недель введения цитостатика. Предлагаемый способ исследования динамики восстановления клеток гемопоэза после пятикратного назначения цитостатика наиболее полно раскрывает картину нарушений в системе крови больных после многокурсовой химиотерапии.

Алкилирующий цитостатический препарат циклофосфан (Р № 000459/01-2001) обладает широким противоопухолевым спектром действия [4]. Циклофосфан до настоящего времени остается одним из наиболее широко используемых препаратов, входя в большинство разработанных схем комбинированной химиотерапии разных опухолей [1, 2, 4]. Механизм угнетения гемопоэза циклофосфаном заключается, прежде всего, в поражении пролиферирующих клеток (коммитированные кроветворные клетки-предшественники) и истощении пула морфологически распознаваемых миелокариоцитов в костном мозге [5].

В клинической практике цитостатики применяются повторными циклами, с интервалами между циклами, достаточными для купирования побочных явлений и профилактики кумулятивной токсичности [1, 2]. Практически все цитостатические препараты при клиническом применении небезопасны для организма и оказывают, в том числе, выраженное миелосупрессивное действие, которое характеризуется подавлением отдельных, либо всех ростков кроветворения на разных уровнях клеточной дифференцировки. Депрессия гемопоэза, отмечаемая у большинства онкологических больных при проведении полихимиотерапии, приводит к снижению эффективности противоопухолевого лечения и повышению агрессивности роста опухоли [3]. Большинство гемостимуляторов не всегда успешно используются в лечении хронических лейкопений, анемий и тромбоцитопений. Во многом, сложившаяся ситуация связана с отсутствием адекватных экспериментальных моделей хронической цитостатической миелосупрессии, которая позволила бы произвести отбор гемостимуляторов, эффективных в условиях хронического цитостатического воздействия.

Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено в проанализированной патентной и научно-медицинской литературе.

Способ может быть использован для поиска эффективных гемостимуляторов. Исходя из вышеизложенного, заявляемое изобретение соответствует критериям патентоспособности изобретения «Новизна» и «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».

Предлагаемый способ изучен в экспериментах на мышах-самцах линии C57BL/6 100 штук, массой 20-22 г. Животные первой категории, конвенциональные линейные мыши, получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Способ осуществляют следующим образом:

У лабораторного животного (мыши) хроническую цитостатическую миелосупрессию моделируют внутрибрюшинным введением алкилирующего агента циклофосфана в дозе 200 мг/кг 1 раз в семь дней в течение 5 недель. В проведенных ранее экспериментах указанная доза была определена как оказывающая наиболее выраженное угнетающее действие на гемопоэз при сохранении жизни животного. Непосредственно перед использованием цитостатик растворяют стерильной водой для инъекций. Объем введений - 0,1 мл. В качестве фона используют интактных животных

Дополнительно мы исследовали длительное введение растворителя (вода для инъекций) на интактных животных, которым вводили эквивалентный объем растворителя 5 раз (1 раз в семь дней).

На 3, 5, 7-е сут после каждого введения циклофосфана у животных определяют количество морфологически распознаваемых клеток периферической крови и костного мозга, содержание клеток-предшественников гранулоцитарно-макрофагального (КОЕ-ГМ) и эритроидного (КОЕ-Э) типа в костномозговой ткани [6].

Изучение общего количества лейкоцитов (ОКЛ), подсчет лейкоцитарных формул проводят стандартными гематологическими методами [6]. Мазки крови фиксируют в метаноле в течение 3-5 минут и после высушивания окрашивают по Нохту-Максимову.

Для изучения клеточности костного мозга выделяют бедренную кость мыши, очищают ее от мягких тканей и промывают центральный канал 1 мл 3% раствора уксусной кислоты. Костный мозг суспендируют шприцем через иглы уменьшающегося диаметра. Общее количество миелокариоцитов подсчитывают в камере Горяева. Для приготовления мазков костного мозга содержимое бедренной кости выдавливают на обезжиренное стекло, затем разводят изологичной сывороткой и делают мазок с помощью шлифованного стекла. Высохшие мазки фиксируют в метаноле 3-5 минут и окрашивают азур II - эозином. Миелограмму подсчитывают на 400 клеток, после чего определяют абсолютное содержание клеточных элементов отдельных ростков гемопоэза [6].

Стандартными культуральными методами изучают содержание коммитированных кроветворных предшественников гранулоцитарно-макрофагального (КОЕ-ГМ) и эритроидного типа (КОЕ-Э) [6].

Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

Пример.

На предварительном этапе изучалось действие растворителя для циклофосфана на мышей, при этом схема введения была аналогичной для раствора циклофосфана: пять внутрибрюшинных инъекций 1 раз в неделю. Проведенные эксперименты показали, что у интактных животных многократное введение растворителя не вызывает статистически достоверных изменений ОКЛ и содержания отдельных форм лейкоцитов на протяжении всего периода наблюдения (табл.1).

В условиях курсового назначения циклофосфана происходит снижение общего количества лейкоцитов (ОКЛ) в периферической крови животных (табл.2). Минимальный уровень данного показателя был зарегистрирован на 3 сут исследования после первого введения циклофосфана. Наблюдается снижение ОКЛ на 3 и 5 сут и после следующих назначений цитостатика, и тенденция к восстановлению к 7 сут опыта. Следует отметить, что до исходного уровня общее количество лейкоцитов не увеличивается ни в одни сроки эксперимента.

Анализ гемограмм позволил установить, что после каждой инъекции циклофосфана динамика изменения содержания сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови однотипна (табл.2). Начиная со второго назначения цитостатика, на 3 сут и 5 сут количество сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови мышей уменьшается, при чем после каждого последующего введения цитостатика ситуация ухудшается. К 7 сут после каждого введения алкилирующего агента происходит увеличение числа сегментоядерных нейтрофилов, при этом к 7 сут эксперимента показатель не превосходит исходный уровень. На протяжении всего периода исследования в периферической крови животных наблюдается развитие лимфопении. В гемограммах по нарастающей (от первого к пятому введению циклофосфана) отмечается появление патологических форм лейкоцитов (нейтрофилов и лимфоцитов) и эритробластов, увеличивающееся после каждого последующего введения алкилирующего агента. Следует отметить, что у животных в условиях оптимальной жизнедеятельности выявленные сдвиги не наблюдаются.

После первого введения циклофосфана отмечается ожидаемое снижение общего количества кариоцитов (ОКК) в костном мозге (3, 5, 7-е сут) (табл.3). Наиболее выраженное падение показателя наблюдается на 3-й день после введения алкилирующего агента. В дальнейшем ОКК поступательно повышается (5, 7-е сут после инъекций цитостатика), однако даже на 7-е сут после «цитостатического удара» клеточность костного мозга остается ниже исходной величины. Подобные изменения имеют место после 2, 3, 4 и 5 инъекции циклофосфана.

Анализ миелограмм позволил установить, что в основе снижения клеточности костного мозга после назначения циклофосфана лежит уменьшение количества клеток эритроидного, лимфоидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения (табл.3). В ряду чувствительности к токсическому действию цитостатика морфологически распознаваемые миелокариоциты мозга располагаются в следующем порядке: эритрокариоциты > гранулоциты > лимфоциты. Следует отметить, что после пятого введения циклофосфана выраженность нарушений со стороны клеточности эритроидного и гранулоцитарного ростков практически не отличается от предыдущих четырех. Исключение составляет лимфопоэз: после каждого последующего назначения цитостатика дефицит лимфоцитов в костном мозге возрастает (табл.3).

Изучение колониеобразующей способности костного мозга мышей, подвергнутых цитостатическому воздействию, позволило выявить длительное угнетение количества гранулоцитарно-макрофагальных и эритроидных клеток-предшественников (табл.4). Содержание коммитированных клеток-предшественников нормализовалось эпизодически: КОЕ-Э на 3 сут после 3 третьего введения циклофосфана, КОЕ-ГМ - на 3 сут после второго и третьего введения циклофосфана.

Таким образом, введение циклофосфана 1 раз в семь дней в течение 5 недель вызывает стойкое нарушение гемопоэза на протяжении всего периода наблюдения, выражавшееся в уменьшении количества морфологически распознаваемых нуклеаров костного мозга и периферической крови, а также в истощении пула коммитированных кроветворных клеток-предшественников гранулоцитарно-макрофагального и эритроидного типа.

Предъявляемый способ предлагается использовать для моделирования хронической цитостатической миелосупрессии с целью избирательного выбора эффективных лекарственных средств для коррекции развивающихся гематологических нарушений.

Литература

1. Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. - М.: Практическая медицина, 2006. - С.9-52, 371-378.

2. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний / Под ред. Н.И.Переводчиковой. - 2-е изд. доп. - М.: Практическая медицина, 2005. - С.21-55.

3. Птушкин В.В. Совершенствование методов поддерживающей терапии при проведении цитостатического лечения // Современная онкология. - 2002. - Т.4, № 2.

4. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: РИА «Новая волна», 2008. - С.969.

5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения при цитостатических миелосупрессиях. - Томск, 1999. - С.43-44; 55-57.

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск, 1992. - С.172-173, 208.