средство и способ индукции апоптоза опухолевых клеток
Классы МПК: | A61K47/00 Лекарственные препараты, отличающиеся используемыми неактивными ингредиентами, например носителями, инертными добавками A61P35/00 Противоопухолевые средства A61P43/00 Лекарственные средства для специфических целей, не указанные в группах 1/00 |
Автор(ы): | Старикова Елена Григорьевна (RU), Таширева Любовь Александровна (RU), Рязанцева Наталья Владимировна (RU), Новицкий Вячеслав Викторович (RU), Васильева Ольга Александровна (RU) |
Патентообладатель(и): | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России) (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2012-03-22 публикация патента:
27.07.2013 |
Группа изобретений относится к области медицины и предназначена для индукции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat. Заявлено применение донора монооксида углерода - CORM-2 для индукции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat. Способ включает культивирование опухолевых клеток линии Jurkat в полной питательной среде. Затем вводят CORM-2 в конечной концентрации 50 мкМ с последующей экспозицией в течение 24 ч в условиях 5% CO2 и при температуре 37°C. Заявленная группа изобретений позволяет эффективно индуцировать апоптоз клеток и может быть использована для лечения онкозаболеваний. 1 ил., 3 табл., 1 пр., 2 н.п. ф-лы.
Формула изобретения
1. Применение донора монооксида углерода - CORM-2 для индукции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat.
2. Способ индукции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat, включающий культивирование опухолевых клеток с последующим введением индуктора, отличающийся тем, что культивируют опухолевые клетки линии Jurkat в полной питательной среде и вводят донор монооксида углерода CORM-2 в конечной концентрации 50 мкМ и последующей экспозиции в течение 24 ч в условиях 5% СО2 и при температуре 37°C.
Описание изобретения к патенту
Группа изобретений относится к области медицины, онкологии и может быть использована для индукции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat.
Заболеваемость и смертность от злокачественных новообразований является одной из наиболее актуальных проблем в современной медицине. В патогенезе опухолевого роста выделяют 3 стадии: стадию трансформации нормальной клетки в опухолевую (стадия инициации); стадию размножения опухолевых клеток (стадия промоции); стадию опухолевой прогрессии. Изучение механизмов опухолевого перерождения привело исследователей к выводу о том, что канцерогенез зависит не только от пролиферативной активности опухолевого клона, но и от его возможностей избегать регулируемую клеточную гибель (Антонеева И.И. Петров С.Б. Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток по мере прогрессирования рака яичников // Онкология. - 2008. - Т.10. № 2. - С.234-237). В результате генетических мутаций снижается способность трансформированных клеток активировать программу апоптоза, что, с одной стороны, способствует прогрессированию опухолевого процесса, а с другой - может стать причиной множественной лекарственной устойчивости (Абраменко И.В., Фильченков А.А., Оценка параметров апоптоза в диагностике онкологических заболеваний, их прогнозе и оптимизации схем терапии // Вопросы онкологии. - 2003. - Т.49. - С.21-30).
В настоящее время предложено множество средств, направленных на активацию апоптоза опухолевых клеток. Для стимулирования апоптоза предлагается обрабатывать опухолевые клетки водно-спиртовым экстрактом болиголова (Патент РФ № 2340349, A61K 36/18, A61K 47/10, А61Р 35/00, 10.12.2008). Проапоптотический эффект данного токсического вещества показан на культуре опухолевых клеток и лимфоцитов, необходимы дальнейшие исследования влияния болиголова на жизнедеятельность нормальных клеток организма.
Авторы патента SG № 174455 (A1) (C12N 15/113, 28.10.2011) предлагают использовать микро РНК 128, участвующую в регуляции генасупрессора опухолей р53. Однако известно, что р53 является наиболее часто инактивированным регулятором апоптоза в опухолевых клетках. Таким образом, недостатком данного подхода в контексте опухолевой трансформации клеток является отсутствие адекватного ответа со стороны мутировавшего р53.
В изобретении AU № 2009322269 (A1) (A61K 31/496; А61Р 35/00; C07D 403/12, 30.06.2011) описано применение веществ, вызывающих ингибирование антиапоптотической функции протеина Bcl-2. Действительно, многие типы опухолей характеризуются повышенной экспрессией данного белка. При этом он является также обязательным компонентам баланса про- и антиапоптотических факторов в нетрансформированных клетках, что существенно ограничивает применение данного подхода. Использование данного подхода ограничено опухолями, характеризующимися повышенной экспрессией Bcl-2.
В качестве средства, стимулирующего апоптоз, описано применение тритерпеновых гликозидов из голотурий (Патент РФ № 2340349, A61K 36/18, A61K 47/10, А61Р 35/00, 10.12.2008), производных апогоссипола (патент US № 2011111057 (A1), A61K 31/02; A61K 31/05; A61K 31/075; A61K 31/11; A61K 31/122; A61K 31/225; A61K 31/337; A61K 31/353; A61K 31/357; A61K 31/453; A61K 31/65; A61K 33/24; А61Р 35/00; G01N 33/68, 12.05.2011), дексанабиола и его производных (Патент WO № 2011030106 (A1), A61K 31/352; А61Р 35/00, 17.03.2011), антипрогестина Патент YU № Р29903 (А), A61K 31/57; А61Р 35/00; А61Р 43/00; C07J 7/00, 17.08.2006), ингибитора FAK киназы PND-1186 (WO № 2011019943 (A1) МПК А61Р 35/00; C07D 413/02; C07D 413/04, 17.02.2011). Все указанные вещества не являются компонентами нормальной внутриклеточной сигнализации и могут быть токсичны для окружающих тканей. Однако на данный момент времени ассртимент средств для управления апоптозом недостаточен, а область их применения ограничена
В настоящее время предложены различные способы активации апоптоза опухолевых клеток. Так, в качестве индуктора программированной гибели клеток было предложено использование специфических антисмысловых олигонуклеотидов специфичных к мРНК определенных генов, экспрессируемых опухолевыми клетками (Патент РФ № 2240125, A61K 31/7088, 20.11.2004). Показано, что модифицированные антитела-агонисты к DR-5 в сочетании с апоптоз-индуцирующими агентами синергетически индуцируют апоптоз раковых клеток (Патент РФ № 2379056, A61K 39/395, C07K 16/28, А61Р 35/00, 20.01.2010). Данный способ предлагает использование апоптоз-индуцирующих агентов, которые могут приводить к гибели нормальных клеток. Другими исследователями был запатентован способ, позволяющий специфически индуцировать апоптоз клеток, экспрессирующих TLR3-рецептор. Для этого используется агонист TLR3 в сочетании с интерфероном типа I в низкой дозе (Патент РФ № 2401661, A61K 31/713, A61K 38/21, А61Р 35/00, 20.10.2010). К недостаткам данного метода можно отнести ограничение его применения клетками несущими TLR3-рецептор, клоны клеток с другими дифференцировочными признаками будут не чувствительны к описанному воздействию.
Известно использование магнитного поля для селективной индукции апоптоза опухолевых клеток без воздействия на окружающие ткани и без индукции некроза (Патент РФ № 2200596, A61N 2/00, 20.03.2003). Описанный метод может быть использован в случае солидных опухолей с четкой локализацией, существенным минусом данного подхода является технические трудности его применения при опухолях клеток крови.
Заявленный в патенте US № 2011059189 (A1) (A61K 33/00; А61Р 31/12; А61Р 35/00, 10.03.2011) способ усиления апоптоза опухолей за счет воздействия на клетки модифицированного производного силиката натрия Na8.2Si4.4H9.7O17.6 включает, в том числе, увеличение продукции оксида азота, как проапоптотического агента. D.Bayer предложил воздействовать на уровень внутриклеточного оксида азота путем ингибирования ферментов, ответственных за утилизацию NO (Патент US № 2009264398 (A1), A61K 31/337; A61K 31/397; А61Р 35/00; C12Q 1/18, 22.10.2009).
Наиболее близким к предлагаемому является способ индукции апоптоза опухолевых клеток за счет повышения уровня оксида азота ("METHOD FOR INDUCING TUMOR POPTOSIS BY INCREASING NITRIC OXIDE LEVELS" патент US № 2009264398). Автор данного метода предлагает использовать ингибитор фермента NO-диоксигеназы, ответственного за утилизацию NO для увеличению уровня указанного газотрансмиттера в опухолевых клетках. Существенным недостатком данного способа является высокая способность оксида азота к окислению внутриклеточных молекул. Так, известно, что митохондрии содержат большое количество гемсодержащих, а также железо- и серосодержащих белков, с которыми NO (или ONOO-) активно соединяется (Реутов В.П. 2002. Цикл оксида азота в организме млекопитающих и принцип цикличности. Биохимия. 67 (3): 353-376). Воздействие оксида азота приводит к разобщению окислительного фосфорилирования на уровне цитохром оксидазы, увеличению количества супероксид аниона и к синтезу пероксинитрита при взаимодействии NO с супероксидом. Пероксинитрит ингибирует практически все компоненты электронной транспортной цепи, включая комплекс I (NADH дегидрогеназу), комплекс II (сукцинат дегидрогеназу), комплекс III (цитохром с редуктазу) и комплекс V (АТФ синтазу) путем окисления цистеина, нитрозилирования тирозина и повреждения Fe-S центров белков (Pacher P., Beckman J. S., Liaudet L. 2007. Nitric Oxide and Peroxynitrite in Health and Disease. Physiol. Rev. 87:315-424). Также, показано, что пероксинитрит приводит к открытию пор индуктором апопотоза было выявлено в результате проведения экспериментальных исследований. В настоящее время известно, что внутриклеточные газы необходимы для функционирования практически всех органов и тканей. Монооксид углерода вовлечен в регуляцию тонуса сосудов и ангиогенеза, передачу импульсов в мозге, а также метаболизм ксенобиотиков в печеночной ткани. СО ингибирует про-воспалительные сигнальные пути и способствует индукции анти-инфламаторных и анти-пролиферативных механизмов [20]. В экспериментах с использованием нетрансформированных клеток показано, что СО ингибирует апоптоз. Антиапоптотический потенциал СО был впервые продемонстрирован в экспериментальных условиях при исследовании влияния данного газа на эндотелиальные клетки и -клетки поджелудочной железы. Так, добавление в клеточные культуры экзогенного СО препятствовало TNF-индуцированному апоптозу мышиных фибробластов и эндотелиальных клеток. Подобный антиапоптотический эффект наблюдался в условиях in vitro при гиперэкспрессии гемоксигеназы-1 [21]. Показано, что СО защищает эндотелиальные клетки от TNF-опосредованного апоптоза за счет активации NF- В-зависимых антиапоптотических генов [22]. Однако монооксид углерода имеет проапоптотичексий эффект в отношении опухолевотрансформированных клеток. В экспериментах с использованием Jurkat клеток было показано, что СО усиливает клеточную смерть, активированную Fas/FasL или TRAIL лигандами [23]. На примере эндотелиальных клеток показано, что СО повышает продукцию оксида азота за счет Akt-опосредованного фосфорилирования eNOS, что может приводить к усилению апоптоза [24]. На сегодняшний день существует несколько потенциальных доноров моноксида углерода. CO-RM (СО-высвобождающие молекулы), группа соединений, являющихся донорами моноксида углерода и диссоциирующие с выделением СО в клетках (CORM-1 ([Mn2(СО)10]) и CORM-2 (Ru(CO)3Cl2 димер), CORM-3 и CORM-4). В своей работе мы использовали CORM-2, обладающий не только липофильностью, но и способностью быстро диссоциировать в растворе с образованием моноксида углерода [25].
Способ осуществляют следующим образом
0,5 мкл стокового 20 мМ раствора CORM-2 добавляют к 200 мкл клеточной суспензии опухолевых клеток линии Jurkat плотностью 1*10 6 клеток/мл для получения конечной концентрации 50 мкМ, и далее образцы культивируют в течение 24 ч в 5% СО2 атмосфере при 37°C.
Пример на выполнение способа
Т-лимфобластные клетки человека линии Jurkat (Всероссийский банк клеточных культур. Институт цитологии РАН, С.-Петербург) были культивированы в RPMI-1640 («Invitrogen», США) дополненной в соотношении 9:1 эмбриональной телячьей сывороткой («Gibco Invitrogen», США), 0,3 мг/мл L- глутамином и 100 мкг/мл гентамицином в 5% CO2 атмосфере при 37°C, с оптимальной плотностью 1*106 клеток/мл. Оптимальную жизнеспособность клеток поддерживали пассажами через каждые три дня.
Мононуклеарные клетки выделяют из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования [Натвиг Дж. и соавт., 1980]. Венозную кровь, стабилизированную К 3ЭДТА в соотношении 2:1 наслаивают на градиент плотности Ficoll-Paque ( =1,077 г/см3) («Pharmacia», Швеция) и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин. Кольцо, образованное из смеси мононуклеарных лейкоцитов, собирают пипеткой с раздела фаз. Клетки трижды отмывают средой RPMI-1640, ресуспендируя и центрифугируя каждый раз в течение 10 мин при 1500 об/мин. Для определения жизнеспособности 7 мкл суспензии клеток смешивают со 140 мкл 0,5% трипанового синего («Serva», США), заполняют счетную камеру Горяева. Жизнеспособность клеток оценивают по содержанию «мертвых» клеток, окрашенных в синий цвет. Доля погибших клеток, содержащих краситель, не превышала 5 %. Выделенные на градиенте плотности мононуклеары ресуспендируют в полной питательной среде (90% RPMI-1640, 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Gibco Invitrogen», США), 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина). Для стандартизации количества клеток суспензию мононуклеарных лейкоцитов разбавляют полной питательной средой до получения 1·106 клеток в 1 мл среды.
Для определения жизнеспособности 7 мкл суспензии клеток смешивают с 70 мкл 0,5% трипанового синего («Serva», США) и 70 мкл 0,9% NaCl, а затем заполняют счетную камеру Горяева. Жизнеспособность мононуклеарных лейкоцитов оценивают по содержанию «мертвых» клеток, окрашенных в синий цвет. Доля погибших клеток, содержащих краситель, обычно, не превышает 5%.
Готовят стоковый раствор CORM-2 (Sigma, USA), для этого 1 млг указанного вещества добавляют к 100 мкл DMSO (Sigma, USA) для получения 20 мМ раствора. Для проведения эксперимента клетки линии Jurkat и мононуклеарные лейкоциты в концентрации 1·106 клеток в 1 мл среды переносят в 96-луночные планшеты (по 200 мкл клеточной суспензии в 1 лунке), добавляют 0,5 мкл стокового раствора 20 мМ CORM-2 до получения конечной концентрации 50 мкМ. Экспериментальные образцы культивируют в течение 24 ч в 5% СО2 атмосфере при 37°С.
Для подтверждения активации апоптоза клеток используют тесты - аннексиновый тест, определение содержания белков семейства Bcl-2, тест с оценкой числа клеток со сниженным митохондриальным трансмембранным потенциалом, определение уровня экспрессии генов, кодирующих белки семейства bcl-2.
Предлагаемые условия способа (концентрация, время и температура инкубации способа) основаны на результатах экспериментальных исследований.
Приводим результаты тестов, подтверждающих активацию апоптоза клеток линии Jurkat при использовании CORM-2 в указанной концентрации и экпозиции и температуре.
Аннексиновый тест. Количество апоптотических клеток определяли с помощью проточной цитофлуориметрии (Facs CantoII («Beckman Dickenson», США)) с использованием набора «ANNEXIN V FITC» («Abeam», США). Полученные результаты выражали в процентах (отношение числа клеток, связавших аннексии V и/или пропидий иодид к общему числу клеток).
В Таблице 1 приведены результаты аннексинового теста. Процент клеток, связавших аннексии V, отражает число клеток с апоптотическими изменениями. Пропидий иодид-положительные клетки являются некротизированным (van England). 50 мкМ концентрация CORM-2 вызывала апоптоз опухолевых клеток линии Jurkat и не влияла на жизнедеятельность небласттрансфоримированных клеток (мононуклеарные лейкоциты) (* - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с интактной культурой). Указанная концентрация донора монооксида углерода не вызывала индукция некротического пути гибели клеток.
Оценка числа клеток со сниженным митохондриальным трансмембранным потенциалом.
Количество клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальных мембран ( ) определяли с помощью проточной цитофлуориметрии (Facs CantoII («Beckman Dickenson», США)) с использованием набора «MitoScreen» («BD Pharmigen», США). Полученные результаты выражали в процентах (отношение числа клеток, со сниженным митохондриальным трансмембранным потенциалом к общему числу клеток).
В Таблице 2 приведены результаты, характеризующие состояние митохондриальных мембран после воздействия донора СО (* - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с интактной культурой). Полученные данные свидетельствуют о том, что донор монооксида углерода в концентрации 50 мкМ вызывает падение митохондриального трансмембранного потенциала клеток. Таким образом, был сделан вывод о том, что монооксид углерода вызывает активацию апоптоза за счет индукции митохондриального пути запуска программированной клеточной гибели.
Определение содержания белков семейства Bcl-2
Содержание белков bcl-2, bcl-xl и bad определяли методом вестерн-блот. Равное количество цельноклеточных лизатов подвергали электрофорезу в 10% SDS полиакриламидном геле, затем осуществляли перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану. Далее мембрану блокировали 1% желатином, трижды промывали TTBS (20 мМ/л Tris HCl, рН 7,6,137 мМ/л NaCl, и 0,05% Tween 20). Затем мембрану инкубировали с первичными антителами (anti-Bcl-XL («Sigma», США), anti-Bad («Biosource», США), anti-Bcl-2 («Biosource», США)) в течение часа. Трижды промывали TTBS и добавляли вторичные антитела с пероксидазной меткой («Biosource», США). Для визуализации результатов исследования использовали хемилюминесцентный метод («NOVEX ECL Chemiluminescent Substrate Reagent kit», Invitrogen, США). Количественное содержание белков определяли путем подсчета интенсивности бенда на рентгеновской пленке с помощью программы TotalLab v.2.01. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали белок глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу («Chemicon», США), выражая содержание исследуемых протеинов как отношение сигнала определяемого белка к сигналу белка глицеро-3-фосфат-дегидрогеназы в исследуемых образцах. На Фиг.1 показано изменение содержания белков семейства Bcl-2 при воздействии на клетки донора монооксида углерода.
Таким образом, проапоптотический эффект донора внутриклеточного газового трансмиттера СО опосредован дисбалансом в системе белков семейства Bcl-2 (повышением содержания проапоптотического белка Bad и снижением содержания антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xl).
Определение уровня экспрессии генов, кодирующих белки семейства bcl-2
Уровень экспрессии генов bcl-2, bcl-xl и bad определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real-Time PCR). Суммарную РНК выделяли из клеток с использованием набора реагентов «QIAmp RNeasy mini Kit» (QIAGEN, Германия). Процедуру обратной транскрипции проводили с использованием случайных гексапраймеров и MMuLV-обратной транскриптазы («Promega», США). Амплификацию кДНК исследуемых генов, а также анализ продуктов амплификации в режиме реального времени проводили на приборе Mini Opticon («BioRad», США) с использованием реакционной смеси с интеркалирующим красителем SYBR Green I («Molecular Probe», США). В качестве референсного гена использовали ген b-actine. Результаты выражали в условных единицах (отношение числа циклов амплификации исследуемого гена к количеству циклов амплификации референсного гена).
В Таблице 3 приведены результаты оценки экспрессии мРНК генов, кодирующих белки регуляторы апоптоза семейства bcl-2 (* - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с интактной культурой).
Таким образом, индуцированное монооксидом углерода снижение содержания белков Bcl-2 и Bcl-xl происходит за счет снижения экспрессии мРНК соответствующих генов.
Статистический анализ результатов
Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения SPSS V.11.0 (SPSS, Chicago, USA). Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.
Таким образом, донор монооксида углерода вызывает апоптоз клеток линии Jurkat, за счет изменения экспрессии и содержания белков, регулирующих целостность митохондриальных мембран. Использование донора монооксида углерода является физиологичным для управления апоптозом в рамках организме в случае создания лекарственных веществ на основании данного подхода.
Таблица 1 | ||||
Число клеток линии Jurkat с некротическими признаками после 24 ч инкубации, % | Число клеток линии Jurkat с апоптотическими признаками после 24 ч инкубации, % | Число мононуклеарных лейкоцитов с некротическими признаками после 24 ч инкубации, % | Число мононуклеарных лейкоцитов с апоптотичес-кими признаками после 24 ч инкубации, % | |
Интактные клетки | 0 (0-0,15) | 1,05 (0-1,55) | 0,45 (0,35-0,75) | 28,50 (24,85-29,3) |
Клетки после воздействия 50 мкМ CORM-2 | 2,10 (1,7-2,35) | 9,60 (8,9-10,1)* | 7,00 (3,25-9,5)* | 36,50 (32,7-41,3) |
Таблица 2 | |
Количество клеток со сниженным митохондриальным трансмембранным потенциалом,% | |
Интактные клетки линии Jurkat | 1,1 (0,7-1,2) |
Клетки линии Jurkat после воздействия мМ CORM-2 | 16,4 (15,9-18,5)* |
Таблица 3 | |||
Экспрессия мРНК гена bcl-2, усл.д. | Экспрессия мРНК гена bcl-xl, усл.ед. | Экспрессия мРНК гена bad, усл.ед. | |
Интактные клетки линии Jurkat | 5,84 (5,35-6,12) | 9,92 (9,76-13,33) | 3,1 (2,47-3,19) |
Клетки линии Jurkat после воздействия 50 мкМ CORM-2 | 2,9 (1,51-4,78)* | 3,36 (2,92-3,99)* | 1,24 (0,75-1,64)* |
Источники информации
1. Антонеева И.И., Петров С.Б. Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток по мере прогрессирования рака яичников // Онкология. - 2008. - Т.10. № 2. - С.234-237
2. Абраменко И.В., Фильченков А.А., Оценка параметров апоптоза в диагностике онкологических заболеваний, их прогнозе и оптимизации схем терапии // Вопросы онкологии. - 2003. - Т.49. - С.21-30
3. Патент РФ № 2340349 Опубликовано: 10.12.2008
4. Патент SG № 174455 Опубликовано: 28.10.2011.
5. Патент AU 2009322269 Опубликовано: 30.06.2011
6. Патент РФ № 2340349, Опубликовано: 10.12.2008
7. Патент US № 2011111057 Опубликовано: 12.05.2011
8. Патент WO № 2011030106 Опубликовано: 17.03.2011
9. Патент YUP № 29903 Опубликовано 17.08.2006
10. Патент WO № 2011019943 Опубликовано: 17.02.2011
11. Патент РФ № 2240125, Опубликовано: 20.11.2004
12. Патент РФ № 2379056, Опубликовано: 20.01.2010
13. Патент РФ № 2401661, Опубликовано: 20.10.2010
14. Патент РФ № 2200596, Опубликовано: 20.03.2003
15. Патент US № 2011059189 Опубликовано: 10.03.2011
16. Патент US № 2009264398 Опубликовано: 22.10.2009 (прототип)
17. Реутов В.П. Цикл оксида азота в организме млекопитающих и принцип цикличности / Биохимия. - 2002. - Т.67. - № 3. - С.353-376.
18. Pacher P., Beckman J.S., Liaudet L. Nitric Oxide and Peroxynitrite in Health and Disease / Physiol. Rev. - 2007. - Vol.87. - P.315-424.
19. Vieira H.L., Belzac A.S., Haouzi D. The adenine nucleotide translocator: a target of nitric oxide, peroxynitrite, 4-hydroxynonenal / Oncogene. - 2001. - Vol.20. - P.4305-4316.
20. Wang R. Two s company, three s a crowd: can H2S be the third endogenous gaseous transmitter? / FASEB J. - 2002. - Vol.16. - P.1792-1798.
21. Inguaggiato P., Gonzalez-Michaca L., Croatt A.J., Haggard J.J., Alam J., Nath K.A. Cellular overexpression of heme oxygenase-1 up-regulates p21 and confers resistance to apoptosis / Kidney Int. - 2001. - Vol.60. - P.2181-2191
22. Zuckerbraun В.S., Billiar Т.R. Carbon monoxide protects against liver failure through nitric oxide-induced heme oxygenase 1 / J. Exp. Med. - 2003. - Vol.198. - P.1707-1716.
23. Song R., Zhou Z., Kim P.K., Shapiro R.A., Liu F., Ferran C., Choi A.M., Otterbein L.E. Carbon monoxide promotes Fas/CD95-induced apoptosis in Jurkat cells / J Biol Chem. - 2004. - Vol.279. - P.44327-44334.
24. Fujimoto H., Ohno M., Ayabe S., Kobayashi H., IshizakaN., Kimura H., Yoshida K., Nagai R. Carbon monoxide protects against cardiac ischemia-reperfusion injury in vivo via МАРK and Akt-eNOS pathways / Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2004. - Vol.24. - P.1848-1853
25. Hidaka A, Azuma YT, Nakajima H, Takeuchi T. Nitric oxide and carbon monoxide act as inhibitory neurotransmitters in the longitudinal muscle of C57BL/6J mouse distal colon // J Pharmacol Sci. - 2010. - Vol.112. - P.231-241.
Класс A61K47/00 Лекарственные препараты, отличающиеся используемыми неактивными ингредиентами, например носителями, инертными добавками
Класс A61P35/00 Противоопухолевые средства
Класс A61P43/00 Лекарственные средства для специфических целей, не указанные в группах 1/00