иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета

Формула изобретения

Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета, отличающаяся тем, что она содержит специфический антиген штамма «Reo 1 Lang-ДЕП» реовируса типа I, инактивированный 0,08%-ным раствором 1,2-аминоэтилазиридина, представляющий собой специфический белок в концентрации 5-10 мкг/см³, адсорбированный на поверхности полистироловых лунок в карбонатно-бикарбонатном буфере с мертиолятом в конечной концентрации 0,1-0,2 мг/см³, контрольную положительную сыворотку, полученную к антигену реовируса типа I с активностью в ИФА 1:3200-1:6400, контрольную отрицательную сыворотку, конъюгат антивидовой, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий хлористый, хромоген (орто-фенилендиамин), перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии.

Для современного животноводства важное экономическое значение имеют наиболее распространенные вирусные респираторно-кишечные инфекции телят и патология репродуктивных органов взрослого поголовья скота, связанные с бесплодием, ранней эмбриональной смертностью и абортами, снижением молочной продуктивности, понижением репродуктивных функций, задержкой в росте, повышением риска возникновения вторичных бактериальных инфекций и увеличением отхода, особенно среди молодняка.

В развитии этих форм патологий крупного рогатого скота доминирующими являются возбудители вирусной природы, относящиеся к различным таксономическим группам. Среди этой обширной группы вирусов малоизвестными и малоизученными являются реовирусы.

Реовирусы крупного рогатого скота относятся к роду Orthoreovirus семейства Reoviridae. Вирионы - сферические частицы диаметром 75-80 нм, с двумя капсидами: наружным и внутренним. Геном реовирусов состоит из 10 сегментов двухнитевой РНК. Название реовирусы (reo - начальные буквы слов respiratory - enteric - orphans) происходит от того, что они имеют выраженный тропизм к органам дыхания и пищеварения (Sabin A.B., 1959).

Реовирусы довольно устойчивы к физико-химическим воздействиям: не теряют своей инфекционности при нагревании их до 500С в присутствии MgCl2. На холоду пробы могут сохраняться при -200С от 8-10 мес. до 2 лет. При 40С вирус сохраняет свои инфекционные свойства в течение 2 мес. Пятикратное и выше размораживание и оттаивание не оказывает влияния на инфекционность реовирусов (Ритова, В.В., Трофимов Н.М., 1977). Они переносят широкий спектр рН (от 2,2 до 8,0), но полностью инактивируются 70% этиловым спиртом или 3% формалином при 56 0С в течение 30 минут (Stanley N.F., Dorman D.C., Pansford I., 1953).

Впервые о реовирусах, как о патогенных агентах, сообщил Sabin в 1959 году, выделив реовирус типа I от ребенка с симптомакомплексом диареи и носовых истечений. По результатам РВН и РТГА у человека и млекопитающих до сих пор обнаруживалось три родственных серотипа. Прототипным реовирусом типа I стал вирус ECHO-10 (штамм Lang). Реовирусы типов I, II и III выделены от крупного рогатого скота, лошадей, собак, кошек, мышей. По данным гибридизации РНК, вирусы серотипов I и II гомологичны на 70%, а степень гомологии между ними и вирусами серотипа II составляет лишь 10% (Gaillard R.K., Ioklik W.K., 1982). Реовирусной инфекцией поражаются многие виды животных и человек, независимо от возраста. Чаще всего инфекция носит инаппарантный, латентный характер и сопровождается длительным вирусоносительством и вирусовыделением. Реовирусы человека и животных, относящиеся к одному типу, неразличимы серологически и близко родственны по биологическим свойствам. Штаммы реовирусов человека и животных вызывают одинаковые изменения, размножаются в одних и тех же культурах ткани и вызывают аналогичные реакции у естественных хозяев. Возможны заболевания людей при заражении бычьим реовирусом 1-го типа и телят при заражении любым из серотипов вируса человека.

Реовирусную инфекцию крупного рогатого скота впервые регистрировали в США, Бельгии, ФРГ, Франции и других странах. В этих странах выявлен высокий процент серопозитивных животных. Так, например, в ФРГ доказано участие реовирусов в поражении респираторного тракта телят и установлена определенная роль их в патологии плода и новорожденных. При исследовании в РТГА сывороток крови 155 телят и парных сывороток от 62 взрослых животных, полученных из 24 хозяйств с диагнозом «грипп», было показано, что реовирусом крупного рогатого скота I-го типа реагируют 70% исследованных животных, с реовирусом II-го типа - 16% и III-го типа - 5%. В трех из 24 стад крупного рогатого скота серологическим исследованием парных сывороток было подтвежден соучастие реовирусов при остром течении инфекции (Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я. и др. 1998; Wizigmann G., Reinhardt G., 1971).

Серологические исследования в РТГА 194 проб сывороток крови телят, в период острого течения респираторной энзоотии, проведенные в институте вирусологии Венского университета, используя в качестве антигена в РТГА реовируса типа I (штамм Lang), показали, что у 54% обследованного поголовья животных были обнаружены антитела. Причем 39 сывороток реагировали в разведении 1:32, 20 - в разведении 1:64, 12 - в разведении 1:128 и 5 - в разведении 1:256 и выше. Эти данные указывали на то, что доминирующим серотипом является реовирус типа I (Böckmann I., 1976).

Накопилось достаточно убедительных данных, свидетельствующие об этиологической роли реовирусов в патологии респираторно-кишечных инфекций молодняка крупного рогатого скота. Так, Rosen L., Abinanti F.R., Hovis I.F. (1963), при исследовании в США 154-и случаев инфекционного процесса у телят первые 2 года жизни, диагностировали у 109 животных из трех ферм реовирусные инфекции, вызванные всеми тремя типами реовирусов. Из них также преобладал тип I.

По данным Rosen L.(1962), Böckmann I., (1976), реовирусы способны обусловливать пневмоэнтериты у телят в первые 3 месяца жизни, проявляющиеся клинически диареей, ринитом, лихорадкой и пневмонией, в то же время у взрослых животных реовирусная инфекция протекает латентно и сопровождается снижением удоев у молочных коров. При обследовании скота в штате Мэриленд (США) почти каждый теленок к годовалому возрасту был инфицирован одним из серотипов бычьего реовируса (Rosen L.(1964). На основании проведенных исследований Dawson P.S. (1966) пришел к выводу, что клинически выраженная форма течения наблюдалась редко, однако соучастие реовирусов было установлено в 29 случаев из 111 регистрированных энзоотии респираторных инфекций телят.

Следует заметить, что при экспериментальном заражении телят-гнотобионтов всеми тремя серотипами наблюдалась лихорадка, кашель, истечения из носовой полости, а гистологически была обнаружена интерстициальная пневмония (Lamont P.H. et al., 1968).

Несмотря на слабую изученность реовирусной инфекции, имеются сообщения о введении реовирусного антигена в качестве компонента в поливалентную инактивированную вакцину, состоящую из вируса ПГ-3, адено- и реовирусов (Сульбо Ж., Петермани X. и др., 1973). Вакцину предлагают использовать для телят с 6-8- недельного возраста, а при отсутствии молозивных антител иммунизируют животных в недельном возрасте. Продолжительность иммунитета - около года (Perreau P., 1973).

Следует также заметить, что авторами заявляемого изобретения в условиях лаборатории вирусологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» разработана «Ассоциированная вакцина против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота». Вакцина предназначена для специфической профилактики респираторно-кишечных инфекций молодняка и патологий репродуктивных органов взрослого поголовья скота.

Обобщая приведенный материал, следует констатировать, что в естественных условиях у крупного рогатого скота реовирусная инфекция с ярким клиническим признаком проявляется не всегда и реовирусы, в основном, участвуют в формировании острых смешанных вирусных респираторно-кишечных инфекций телят, особенно в присутствии стрессовых факторов.

Известно, что реовирусам свойственна выраженная антигенная активность: в ответ на реовирусную инфекцию появляются нейтрализующие антитела и антитела, подавляющие реакцию гемагглютинации. Все реовирусы млекопитающих обладают гемагглютинирующим свойствами по отношению к эритроцитам человека. Температурные условия при постановке РГА не влияют на титр гемагглютинина, так же как и рН в пределах от 6,0 до 8,0.

По данным зарубежных исследователей ретроспективный диагноз на реовирусную инфекцию устанавливают путем исследований парных сывороток, взятых с интервалом 3-4 недели, путем исследований их в РТГА с реовирусом типа I. Повышение титров антигемагглютининов во вторых пробах в 4 и более раза считается диагностическим. При латентной реовирусной инфекции в стаде процент животных, имеющих антитела, колеблется от 40 до 80% (Brudaker M.M., 1964; Moreno-Lopez I. 1979; Wizigmann G., Reinhardt G., 1971).

Из литературных источников известно, что, лабораторная диагностика реовирусной инфекции крупного рогатого скота осуществляется путем выделения вируса в культуре клеток и полученные результаты должны быть подтверждены обнаружением прироста антигемагглютининов или вируснейтрализующих антител в период реконвалесценции по сравнению с сыворотками крови, взятыми в острой стадии болезни.

Для выделения возбудителя используют, главным образом, фекалии, носовые и конъюнктивальные смывы, кровь, легкие и лимфатические узлы. Материал обрабатывают по общепринятой методике, подготавливая для заражения культур клеток. Выделенный цитопатогенный агент проверяют на наличие гемагглютинирующей активности по отношению к эритроцитам человека и, если таковая имеется, идентифицируют в РТГА, используя эталонные сыворотки трех серотипов реовируса. Часто серологически диагностируют смешанные инфекции: ПГ-3, ВД-БС, реовирусная инфекция и хламидиоз (Thomas L., Collins A., 1974).

Однако до настоящего времени в Российской Федерации какие-либо исследования по изучению роли реовирусов в патологии крупного рогатого скота не проводились, многие аспекты этой болезни, в частности, источники и пути передачи, вирусоносительство и вирусовыделение у естественно инфицированного крупного рогатого скота не изучены, а также широта и степень распространения реовирусной инфекции оставались вне поля зрения ветеринарной службы страны. Очевидно, что решение таких вопросов, как особенности эпизоотологии болезни и постинфекционного иммунитета, задачи, связанные с разработкой методов и средств лабораторной диагностики и, специфической профилактики реовирусной инфекции крупного рогатого скота, требует серьезного внимания.

С учетом этого положения, с целью выявления степени распространения реовирусной инфекции среди поголовья крупного рогатого скота в регионе Среднего Поволжья, нами был осуществлен серомониторинг в отношении данной инфекции путем исследования в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) 1031 сыворотки крови, полученной из 16 хозяйств 6 районов Республики Татарстан, в которых имели место респираторно-кишечные заболевания телят и нарушение функций репродуктивных органов маточного поголовья. В качестве антигена использовали концентрированный ультрацентрифугированием инактивированный реовирус типа I штамм «Reo 1 Lang», полученный на культуре клеток Vero, с гемагглютинирующей активностью 1:512-1:1024. Из результатов проведенных исследований представленых в таблице 1 следует, что наиболее высокие титры антител в пределах 1:160-1:320 обнаруживаются как у глубокостельных коров и телок случного возраста, так и у телят. Эти данные указывают на активность реовирусной инфекции у обследованного поголовья скота. Следовательно, обобщение и анализ полученных результатов показал, что достаточно высокий процент выявления положительных реакций в диагностических титрах (1:40 и выше) у взрослого поголовья (58,9%) и у телят до трехмесячного возраста (31,5%) свидетельствует о фактах циркуляции реовируса типа I среди обследованного поголовья скота в 16 хозяйствах 6 районов Татарстана и о перспективности дальнейших широкомасштабных исследований этой неизученной в РФ вирусной инфекции.

В настоящее время ветеринарная служба РФ не располагает современными методами и средствами лабораторной диагностики, в том числе и какими-либо наборами для серологического мониторинга в отношении этой малоизвестной реовирусной инфекции крупного рогатого скота, способной поражать многих видов животных и человека, независимо от возраста и участвующая в формировании чаще всего смешанных инфекций. Поэтому проблема создания иммуноферментной тест-системы стала весьма актуальной.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаки, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Из выявленных аналогов - прототипа определили реакцию торможения гемагглютинации по Rosen L. 1962, как наиболее близкого по совокупности признаков по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой тест-системы ИФА, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Во всех зарубежных странах серологическую диагностику реовирусной инфекции крупного рогатого скота и идентификацию выделенных штаммов реовирусов осуществляют по реакции торможения гемагглютинации, используя преимущественно антиген штамма «Reo 1 Lang» реовируса типа I. При помощи реакции торможения гемагглютинации практически во всех случаях естественной и экспериментальной реовирусной инфекции животных и человека удается выявить 4-х кратное или более высокое нарастание титра гомологичных антител в парных сыворотках крови

Известным решением, принятым за прототип, заявляемого метода серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета иммуноферментной тест-системой, является реакция торможения гемагглютинации (Rosen L., 1969; - Diagnostic procedures for viral and Rickettsial infections, c.285-291: Москва «Медицина», 1974 перевод с англ.).

Сущность РТГА заключается в нейтрализации гемагглютинирующих свойств вируса специфическими антителами, содержащимися в сыворотке крови, в результате чего склеивания (агглютинации) эритроцитов не происходит и они оседают на дно, образуя плотный осадок в виде пуговки

Компоненты реакции:

- антиген реовируса;

- 0,5% взвесь эритроцитов О группы человека;

- 25% взвесь каолина;

- контрольная положительная сыворотка;

- контрольная отрицательная сыворотка.

РТГА проводят микрометодом по методике описанной Rosen L. (1972) против 4 гемагглютинирующих единиц антигена реовируса. Перед постановкой РТГА сыворотки разводят 1:5, прогревают в водяной бане (для удаления термолабильных гемагглютининов) при +58°С в течение 30 минут, обрабатывают равным объемом 25% взвеси каолина в течение 20 минут. Надосадок, после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут, используют в реакции торможения гемагглютинации.

Недостатками прототипа - известного метода серологической диагностики реовирусной инфекции, являются:

- влияние неспецифических ингибиторов гемагглютинации, для устранения которых требуется предварительная обработка сывороток;

- сравнительно невысокая чувствительность реакции, что затрудняет выявление низких концентраций антител;

- нестабильность ингредиентов реакции, главным образом нативных эритроцитов, срок хранения которых непродолжителен (3-4 дня);

- трудоемкость и длительность данного метода, требующего для постановки одного рабочего дня, что ограничивает возможность одновременного исследования большого количества образцов сывороток крови;

- частые расхождения результатов РТГА при обследовании одних и тех сывороток в разных лабораториях из-за различий в процедуре постановки и учета реакции.

Указанные недостатки прототипа устраняются предлагаемым изобретением.

Совершенно очевидно, что современная диагностическая служба должна опираться на такие высокоспецифичные и чувствительные методы диагностики, которые позволяли бы получать воспроизводимые, достоверные и максимально качественные результаты в пределах метода, не требующих сложного инструментального оснащения, обеспеченные стандартными реагентами и признанные пригодными для проведения широкомасштабных исследований в условиях практических ветеринарных лабораторий. Этим требованиям в значительной степени отвечает твердофазный иммуноферментный анализ.

Целью изобретения является разработка иммуноферментной тест-системы как наиболее чувствительного и достоверного метода, предназначенного для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета.

Указанная цель достигается тем, что заявляемая тест-система содержит специфический антиген реовируса типа I штамма «Reo 1 Lang-ДЕП», инактивированный 0,08%-ным раствором 1,2-аминоэтилазиридина, представляющий собой специфический белок в концентрации 5-10 мкг/см³, адсорбированный на поверхности полистироловых лунок в карбонатно-бикарбонатном буфере с мертиолятом в конечной концентрации 0,1-0,2 мг/см ³, контрольную положительную сыворотку, полученную к антигену реовируса типа I с активностью в ИФА 1:3200-1:6400, контрольную отрицательную сыворотку, конъюгат антивидовой, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий хлористый, хромоген (орто-фенилендиамин), перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа. Основное преимущество предлагаемого изобретения состоит в том, что в качестве антигена используется штамм «Reo 1 Lang-ДЕП», относящийся к первому серотипу, который активно циркулирует среди поголовья скота во всех странах мира, в том числе и на территории РФ.

Согласно «Инструкции по применению тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител», один комплект тест-системы рассчитан для проведения на одном планшете одновременного анализа 46 исследуемых проб сывороток крови в одном разведении (в двух повторах) и 2 контрольных сывороток (в двух повторах) или 20 исследуемых проб сывороток крови (в четырех разведениях) и 2 контрольных сывороток (в четырех разведениях). Одна тест-система рассчитана на исследование 230 проб сывороток крови в одном разведении и 100 проб в четырех разведениях.

Следовательно, заявляемое изобретение обладает существенными отличиями и характеризуется новой совокупностью признаков, позволяющей получить более высокий ожидаемый эффект, в отличие с тем результатом, который был получен при использовании метода серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота - прототипа.

Технико-экономическая эффективность:

- безопасность (используется инактивированный антиген);

- удобство работы (автоматизация промежуточных стадий реакций);

- использование прибора - спектрофотометра «Bio-Rad Model 680», с помощью которого за несколько секунд можно измерить поглощение света в 96 лунках планшета и получить объективные показатели оптической плотности исследуемых проб сыворотки крови, что позволяет значительно увеличить число проводимых анализов и упростить методическую процедуру выполнения ИФА.

Диагностические параметры и показатели качества разработанной тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета соответствуют требованиям стандартов МЭБ (Руководство по диагностике и производству вакцин, издание МЭБ, 2004, с.21-29).

В состав предлагаемой тест-системы ИФА входят:

1. Полистироловые 96 луночные микропланшеты для иммуноферментного анализа, адсорбированные очищенным антигеном реовируса типа I, штамм «Reo 1 Lang-ДЕП», в концентрации 5-10 мкг/см ³ - 5 шт.

2. Контрольная положительная сыворотка, лиофилизированная (К⁺), объем 0,5 см³, рабочее разведение 1:400, титр в ИФА 1:3200-1:6400-2 амп. № 1

3. Контрольная отрицательная сыворотка, лиофилизированная (К^-), объем 1 см³, рабочее разведение 1:400-2 фл. № 2

4. Адсорбционный 0,01М карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (0,01 М КББ рН 9.6), содержащий мертиолят в конечной концентрации 0,1-0,2 мг/см³.

5. 10-кратный концентрат фосфатно-буферного раствора с Твином-20 для промывки планшетов (ФБР-Т), 100 см³ - 2 фл. № 3

6. Буфер для разведения конъюгата (БРК), объем 10 см³ - 1 фл. № 4

7. Антитела диагностические против иммуноглобулинов G (IgG) крупного - рогатого скота, меченые пероксидазой хрена (Конъюгат), объем 0,2 см³ - 1 амп. № 5

8. Фостфатно-цитратный буфер (ФЦБ), объем 10 см³ - 5 фл. № 6

9. Хромоген, орто-фенилендиамин (ОФД), 4 мг - 5 фл. № 7

10. Перекись водорода (H₂O ₂) 3% р-р, объем 10 см³ - 1 фл. № 8

11. 1М Серная кислота (Стоп-реагент), объем 50 см³- 1фл. № 9

Приготовление компонентов набора.

1. Приготовление рабочих буферов

1.1. Адсорбционный 0,01М карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (КББ рН 9,6), содержащий мертиолят в конечной концентрации 0,1-0,2 мг/см ³, предназначен для растворения и сорбции антигена в лунке планшетов. Из маточного раствора берут 5 см³, добавляют еще 95 см³ дист. воды и 10-20 мг мертиолята. Этот раствор используют в реакции (0,01 М КББ рН 9.6).

1.2. Фосфатно-буферный раствор с Твином-20 предназначен для разведения контрольных, исследуемых сывороток и промывки панелей. Содержимое флакона с 10-кратным концентратом фосфатно-буферного раствора с Твином-20 доводят дистиллированной водой до 1000 см³ . Рабочий раствор буфера представляет собой прозрачный раствор с рН 7,2-7,4.

1.3. Буфер для разведения конъюгата, представляет собой прозрачный фосфатно-буферный раствор без Твина с рН 7,2-7,4

1.4. Рабочий хромоген-субстратный раствор. Раствор готовят непосредственно перед использованием. Для этого 4 мг ОФД растворяют в 10 см³ фосфатно-цитратного буфера и добавляют 0,14 см³ 3% раствора перекиси водорода. Раствор должен быть прозрачным и иметь светло-желтый цвет.

2. Приготовление антигена

В заявляемой тест-системе ИФА, предназначенной для выявления и количественного определения антител к реовирусу крупного рогатого скота, специфический антиген готовят используя реовирус штамм «Reo 1 Lang».

Штамм «Reo 1 Lang» реовируса, был получен в 1979 году профессором Гаффаровым Х.З. из ЦВЛ МСХ Великобритании и принятый заявителем в качестве производственного, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняет свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации, в нативном виде и после инактивации, отличаются высокой продуктивностью в чувствительных биологических системах культивирования, признан пригодным для изготовления высокочувствительных и специфичных диагностикумов.

Реовирус - РНК-содержащий вирус. Вирионы - сферические частицы диаметром 75-80 нм, с двумя капсидами: наружным и внутренним. Геном реовирусов состоит из 10 сегментов двухнитевой РНК. Штамм «Reo 1 Lang-ДЕП» реовируса, устойчив к эфиру, 1%-ной перекиси водорода, 1%-ному фенолу, 3%-ному формальдегиду, стабилен в широком интервале значений рН от 2,2 до 8,0, инактивируются 70% этиловым спиртом или 3% формалином при 56 0С в течение 30 минут. Вирус агглютинирует эритроциты человека 0-группы. В естественных условиях к вирусу восприимчив крупный рогатый скота.

Штамм «Reo 1 Lang-ДЕП» реовируса типа I крупного рогатого скота депонирован в лаборатории музей штаммов микроорганизмов особо опасных болезней (ООБ) ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 9 декабря 2009 года, регистрационный номер 2. Местом хранения штамма определена «Лаборатория музей штаммов микроорганизмов ООБ ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 420075, г. Казань, Научный городок-2.

Реовирус репродуцируют в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (Vero) и/или в перевиваемой культуре клеток почек поросенка (РК-15), реовируссодержащий материал подвергают трехкратному замораживанию и размораживанию с последующим осветлением путем низкоскоростного центрифугирования (3000 об/мин) в течение 30 минут, инактивируют 0,08%-ным раствором 1,2-аминоэтилазиридина. С целью концентрирования антигена супернатант отбирают и подвергают дальнейшему центрифугированию при 30000 об/мин в течение 1 ч. Концентрированный антиген очищают ультрацентрифугированием при 30000 об/мин в течение 2 ч на 10-20-30% градиенте плотности сахарозы.

Пример 1. В заявляемой тест-системе антиген реовируса готовят следующим образом: реовирус репродуцируют в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (Vero) и/или в перевиваемой культуре клеток почек поросенка (РК-15) до накопления вируса в титре 1:32-1:128 ГАЕ. Для заражения реовирусом отбирают матрасы с полным монослоем клеток Vero и/или РК-15, удаляют ростовую среду, вносят в каждый матрас по 5 см вирусного материала. Инкубируют в термостате в течение часа. После этого, не удаляя вирусный материал, вносят поддерживающую среду в объеме 150-200 см и культуру помещают в термостат. Характерность цитопатогенного действия реовируса на культуру клеток Vero и/или РК-15 (зернистость, округление и разрушение клеток) контролируют путем микроскопии матров в течение 72-96 часов после заражения, трижды замораживают при -20°С, затем с каждого матраса отбирают пробы по 5 см ³ для посева на стерильность и определения титра в РГА.

Затем реовируссодержащий материал подвергают трехкратному замораживанию и размораживанию с последующим осветлением путем низкоскоростного центрифугирования (3000 об/мин) в течение 30 минут. Инактивируют вирус 0,08%-ным раствором 1,2-аминоэтилазиридина. С целью концентрирования антигена супернатант отбирают и подвергают центрифугированию при 30000 об/мин в течение 2 ч. Концентрированный антиген очищают ультрацентрифугированием при 30000 об/мин в течение 2 ч на 10-20-30% градиенте плотности сахарозы.

Осадок ресуспендируют в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6-9,8), содержащем мертиолят в конечной концентрации 0,1-0,2 мг/см ³ и используют в качестве антигена реовируса для сенсибилизации лунок полистироловых планшет. Оценку степени очистки и концентрирования антигена устанавливают по гемагглютинирующей активности, определяемой в РГА, и по показателям оптической плотности белка вирусного антигена на спектрофотометре СФ-46 ЛОМО при длинах волн 235 и 280 нм с поправкой на разведение в кювете по следующей формуле:

По формуле:

где

-ОП₂₃₅; ОП ₂₈₀ - оптическая плотность при длине волны 235 и 280 нм, соответственно;

- 30 - разведение исследуемого образца в кювете (1:30).

По результатам шахматного титрования антигена и контрольных сывороток устанавливают в ИФА оптимальную рабочую концентрацию реовирусного антигена, которая в данном случае равняется 5-10 мкг/см³.

3. Приготовление контрольных сывороток

Изготовление контрольной положительной типоспецифической сыворотки против штамма «Reo 1 Lang-ДЕП» реовируса типа I осуществляют путем гипериммунизации клинического здорового молодняка крупного рогатого скота 6-8-месячного возраста, концентрированной, очищенной и инактивированной вирусной суспензией с гемагглютинирующей активностью не ниже 1:256-1:512.

Через 14-16 дней после последнего введения вируса у животных из яремной вены берут пробы крови, получают сыворотку и ставят реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) и ИФА.

Сыворотку с антигемагглютинирующим титром в РТГА не ниже 1:1280 и в ИФА - 1:3200-1:6400 расфасовывают в ампулы по 0,5 мл и лиофилизируют.

Пример 2. Изготовление контрольной положительной типоспецифической сыворотки против штамма «Reo 1 Lang-ДЕП» реовируса типа I осуществляют путем гипериммунизации клинического здорового молодняка крупного рогатого скота 6-8-месячного возраста, концентрированной, очищенной и инактивированной вирусной суспензией с гемагглютинирующей активностью не ниже 1:256-1:512.

До начала иммунизации животных из яремной вены берут кровь и сыворотку проверяют на наличие антигемагглютининов к реовирусу крупного рогатого скота. В случаях отсутствия в них специфических антител, животные считаются пригодными для гипериммунизации.

Для получения иммунных сывороток используют вирусный антиген, депонированный в неполном адъюванте Фрейнда, которого готовят путем тщательного смешивания 15 см ³ вазелинового масла и 5 см³ обезвоженного ланолина. Полученную смесь подвергают дробной стерилизации в водяной бане 3 дня подряд по 60 минут. Смесь антигена с адъювантом (в равном объеме) подогревают в водяной бане до +37°С, тщательно перемешивают и вводят подкожно в дозе по 2 см³. В последующем гипериммунизацию животных проводят путем трехкратного внутривенного введения инактивированной культуральной вирусной суспензии, очищенной от клеток, в возрастающих дозах 10 см³, 20 см и 30 см³ соответственно с интервалом между введениями 14-16 суток.

С целью предупреждения анафилактической реакции, начиная со второго цикла иммунизации, животному вводят по 2 см³ вируса подкожно за 40 минут до введения основной дозы вируса.

Через 14-16 дней после последнего введения вируса у животных из яремной вены берут пробы крови, получают сыворотку и ставят реакцию торможения гемагглютинации.

Производственное крововзятие допускается при наличии антител в сыворотке крови продуцента к реовирусу крупного рогатого скота не ниже 1:1280-1:2560 в РТГА. Первое крововзятие от продуцентов по объему не должно превышать 0,6 литра крови на 100 кг массы животного, а в последующем - 1,6 литра на 100 кг массы.

Кровь из яремной вены в стерильные цилиндры, смоченные физиологическим раствором, ставят в термальную комнату на 30-40 минут при температуре +37-38°С, после чего сыворотки обводят и цилиндры оставляют на 18 часов при температуре +4-6°С для отстаивания сыворотки. Затем сыворотку отбирают, добавляют мертиолят в соотношении 1:10000, определяют титр антител в РТГА и ИФА с гомологичным антигеном.

Сыворотка с антигемагглютинирующим титром в РТГА не ниже 1:1280 и в ИФА - 1:3200-1:6400 расфасовывают в ампулы по 0,5 см³ и лиофилизируют.

4. Приготовление отрицательной контрольной сыворотки

Крупный рогатый скот выдерживают в карантине в течение 2 месяцев, и исследуют сыворотки крови в ИФА. У клинически здоровых неиммунизированных животных, не содержащих при исследовании в ИФА специфических антител к реовирусу первого серотипа, проводят стерильное взятие крови из яремной вены из расчета 600 см³ крови на 100 кг массы животного. Кровь выдерживают 30 мин в термостате при +37°С, затем обводят и отстаивают при 4°С. Отстоявшуюся сыворотку сливают во флаконы в стерильных условиях, расфасовывают во флаконы по 1 см³ и лиофилизируют.

Пример 3. Стандартизация основных условий проведения исследований, заявляемой тест-системой ИФА

Влияние концентрации антигена реовируса крупного рогатого скота на результаты ИФА исследуют при содержании его 30, 15, 5, 10, 3, мкг/см³ . Результаты исследований показали, что максимальное значение коэффициента специфичности отмечается при адсорбции антигена реовируса КРС в концентрации 5-10 мкг/см³. Использование других его концентраций приводит к снижению специфичности реакции.

При разработке иммуноферментных наборов, в которых для исследования используется одно разведение исследуемой сыворотки, важным является подбор условий сорбции иммунной сыворотки на сенсибилизированном антигеном планшете. Для этого в иммобилизированные антигеном лунки планшета вносят контрольные сыворотки в разведениях от 1:100 до 1:12800. Конъюгат используют в рабочем разведении 1:5000, которое определяют в предварительных экспериментах методом «шахматного» титрования.

Оптимальной концентрацией антигена и рабочими разведениями компонентов иммуноферментной тест-системы считают их конечные значения, обеспечивающие в лунках с положительной контрольной сывороткой ОП490 составляло не менее 0,7, а в лунках с отрицательным - не более 0,2. Данным условиям отвечают следующие параметры реакции: концентрация антигена - 5-10 мкг/см³, разведения контрольных сывороток - 1:400 и рабочее разведение конъюгата 1:5000. Оптимальным временем для адсорбции антигена была 18-ти часовая его инкубация при +4±1°С, для сывороток это время составляет 2 ч при +37±1°С.

Пример 4. Определение позитивно-негативного порога тест-системы ИФА.

Для учета и интерпретации результатов, полученных тест-системой ИФА, определен позитивно-негативный порог тест-системы, который находится в диапазоне <16% - 25%. В дальнейшем все пробы, значение Ксв. для которых было меньше ПНП, считали отрицательными, а пробы со значением Ксв. равным или превышающим этот показатель положительными.

Пример 5.

Чувствительность и специфичность тест-системы определяли на основании корреляции результатов исследований сывороток крови в РТГА и ИФА (таблица 2).

Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к РТГА составила 111:115×100%=96,5%; диагностическая специфичность 68:73×100%=93,1%; совпадаемость результатов двух методов 179:188×100%=95,2%.

В тоже время, при исследовании сывороток крови в ИФА и РТГА, полученных от заведомо негативных (клинически здоровые контрольные животные из благополучного по данному заболеванию хозяйства, n=90) и заведомо позитивных (подопытные животные, привитые «Ассоциированной вакциной против парво-, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной», n=90) коров, наблюдалась 100%-я совпадаемость результатов. В первом случае, все результаты исследований были отрицательными, во втором - положительными.

Воспроизводимость тест-системы ИФА определяли в 5-и повторностях как в рамках одной планшеты (набора ИФА), так и между разными наборами ИФА одной серии и наборами разных серий. Величина коэффициента вариации значений Ксв. при исследовании положительных проб (n=15) тест-системой ИФА разных серий не превышала 6,3%, а при исследовании отрицательных (n=13) - 7,4%, что соответствует рекомендуемым параметрам и не превышает 10%. При этом коэффициент корреляции результатов при исследовании положительных проб составил 0,9, а при исследовании отрицательных - 0,95.

Пример 6. Иллюстрация применения тест-системы ИФА

6.1. Подготовка биологического материала для исследования. Для анализа используют сыворотку крови крупного рогатого скота. Если анализ проводят в течение 24 ч после отбора, образцы биоматериала хранят при температуре +4°С. При более длительном хранении образцы замораживают при температуре -20°С. Перед исследованием замороженные образцы быстро (в течение 5-10 мин) нагревают в водяной бане при температуре +37°С. В случае выпадения осадка эритроцитов или белка пробы обязательно осветляют центрифугированием 10 мин при 2000g. Многократное замораживание и оттаивание образцов не допускается. Не использовать объединенные сыворотки от разных животных. Гемолизированные и проросшие сыворотки исследованию не подлежат.

6.2. Подготовка биологических компонентов тест-системы ИФА.

Контрольные отрицательную и положительную сыворотки (амп. или фл.) № 1 и № 2 растворяют в ФБР-Т и разводят 1:400.

Содержимое ампулы № 5 с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом перед употреблением разводят необходимое количество в 5000 раз, например к 0,01 см ³ конъюгата добавляют 50 см³ БРК.

6.3. Все исходные компоненты набора стабильны до истечения срока годности.

6.4. Проведение иммуноферментного анализа.

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводят в непрямом твердофазном варианте с использованием компонентов, входящих в тест-систему ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета.

Перед началом работы планшет двукратно промывают рабочим раствором ФБР-Т в объеме 0,15 см³ на лунку.

При исследовании в одном разведении исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:400 фосфатно-буферным раствором с твином (ФБР-Т) № 4. Например, к 3,99 см³ ФБР-Т добавляют 0,01 см³ исследуемой сыворотки.

В лунки E12-F12 вносят по 0,1 см³ К+ в рабочем разведении 1:400.

В лунки G12-H12 вносят по 0,1 см³ К- в рабочем разведении 1:400.

В остальные лунки планшета вносят по 0,1 см³ исследуемой пробы (ИП) сыворотки в разведении 1:400 (по две лунки на каждый образец сыворотки) по схеме 1.

При исследовании в 4-х разведениях исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:800.

Например, к 7,99 см³ ФБР-Т добавляют 0,01 см³ исследуемой сыворотки.

Предварительно во все лунки планшета вносят по 0,1 см³ ФБР-Т. В лунку A11 вносят по 0,1 см³ К+ в рабочем разведении 1:800.

В лунку А12 вносят по 0,1 см³ К- в рабочем разведении 1:800.

В остальные лунки вертикального ряда планшета (А1-А10) вносят по 0,1 см³ исследуемой сыворотки в разведении 1:800 и проводят последовательные двукратные разведения в четырех лунках по схеме 2.

- Закрывают планшет крышкой и инкубируют 2 ч при температуре 37°С.

- Планшет 3 раза промывают буфером ФБР-Т (по 0,15 см³ на лунку), раствор удаляют встряхиванием, с последующим постукиванием по фильтровальной бумаге до полного удаления остатков раствора со стенок и дна лунок планшета.

- В каждую лунку добавляют по 0,1 см³ рабочего раствора конъюгата.

- Планшет закрывают крышкой и инкубируют 1 ч при 37°С.

- Планшет 3 раза промывают буфером ФБР-Т.

- Вносят в каждую лунку по 0,1 см³ рабочего хромоген-субстратного раствора.

- Планшет инкубируют в темноте 5-15 мин при комнатной температуре.

- Останавливают реакцию добавлением 0,1 см³ стоп-реагента (1М H ₂SO₄).

- После остановки реакции оптическую плотность субстратной смеси измеряют на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 490 нм (ОП₄₉₀ ).

Пример 7. Учет и интерпретация результатов.

При спектрофотометрическом учете результатов исследований сывороток крови в одном разведении производят следующие расчеты:

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП₄₉₀) для проб К+(ОП₄₉₀К+ _ср);

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП₄₉₀) для проб К- (ОП₄₉₀К-_ср);

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП ₄₉₀) для каждой испытуемой пробы ИП (ОП₄₉₀ИП _ср);

- Вычисляют коэффициент связывания (Ксв) конъюгата сывороточными антителами по формуле:

, где

Пробу считали отрицательной, если величина Ксв менее 16%.

Если величина Ксв более 25% пробу считают положительной.

Выявленные результаты исследований сывороток в этом диапазоне (от 16% до <25%) считают сомнительными, и анализ следует повторить.

При учете результатов исследований сывороток крови в четырех разведениях производят расчет коэффициента специфичности, который равен отношению оптической плотности продукта реакции в лунках с контрольной положительной (ОП₄₉₀ К+) или исследуемой сывороткой (ОП₄₉₀ИП) к оптической плотности контрольной отрицательной сыворотки (ОП₄₉₀ К-). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности не ниже 2,1 и отрицательной, если ниже 2,1.

Обнаружение положительных проб сывороток крови в одном разведении при эпизоотологическом обследовании животных, ранее не вакцинированных против реовирусной инфекции крупного рогатого скота, свидетельствует о циркуляции в стаде возбудителя болезни.

Выявление динамики роста специфических антител в парных пробах сывороток, при исследовании образцов в четырех разведениях, позволяет диагностировать реовирусную инфекцию у исследованного поголовья.

По результатам титрования сывороток в четырех разведениях определяют напряженность иммунитета у вакцинированных животных через 2-3 недели после второй вакцинации путем деления количества проб с титром антител 1:400 и выше у вакцинированных телят 10-20 дневного возраста, а у глубокостельных коров и телок случного возраста с титром антител 1:800 и выше к общему количеству исследованных сывороток и выражают в процентах.

Проведенный нами, с использованием заявляемой тест-системой ИФА, серомониторинг в отношении реовирусной инфекции в 35 хозяйствах Республики Татарстан, Республики Башкортостан и Саратовской области отчетливо демонстрирует, что из 1378 проб сывороток крови крупного рогатого скота специфические антитела к реовирусу типа I в ИФА у 638 (46,2%) животных (таблица 3). Полученные результаты указывают на факт циркуляции этого возбудителя среди обследованного поголовья скота.

Таким образом, предлагаемая тест-система позволяем а спровадить широкомасштабные исследования малоизученной и малоизвестной в РФ реовирусной инфекции крупного рогатого скота и осуществлять оценку эффективности вакцинопрофилактики.

Источники информации

1. Ритова, В.В., Трофимов Н.М. Реовирусы и их роль в инфекционной патологии человека и животных // Вопросы вирусологии. - 1977. - 2. - С.134-141.

2. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В., - Вирусные болезни животных. / Москва, ВНИТИБП. - 1998. - С.18-19

3. Сульбо Ж., Петермани X., Терр Ж., Брюн А., Шапюи Г., Тивро М. // В сб. «Резюме докл. 2-го Межд. симп. ВАВМИ и спец. зар. бол». Варна. - 1973. - 23 с.

4. Abinanti, F.R.:Vet.Bull32., - 1962. - 150 p.

5. Böckmann, J. Serologische erhebungen über die verbreitung von reovirusinfektionen im österreichischen mastkälberstrapel. / Wien. tierärztl. mschr. - 1976. - 63. - P. 358-360.

6. Brubaker, M.M., West, В., Ellis Human blood group influence on reovirus hemagglutinatination litres. / Proc. soc. exp. boil. (N.Y.). - 1964. - 115. - P.1118-1120.

7. Lamont, P.H., Darbyshire, J.H., u. Dawson, P.S.:J. Comp. Path. 78. - 1968. - 23 p.

8. Moreno-Lopez, J. A serosurvey of viruses during outbreaks of acute respiratory and /or enteritic disease in Swedish cattle. / Zbl.vet.med Reihe В. - 1979. - 26. - 8. - Р.634-640.

9. Perreau P. «Res. Ved. Veter», 1973. - 149. - № 9. - P.1147-1162

10. Rosen, L. Reoviruses in animals other than man. / Ann. N.Y. acad. sci. - 1962. - 101. - P.461-465.

11. Rosen L. Diagnostic procedures for viral and Rickettsial infections, Москва: «Медицина». - 1974 перевод с англ. - С.285-291.

12. Rosen, L., Abinanti, F.R, u. Hovis, J.F. // Amer. J. Hyg. 77. - 1963. - P.38.

13. Sabin, A.B. Reoviruses. / Science. - 1959. - 130. - P.1387.

14. Wizigmann, G., Reinhardt G. Untersuchungen über Reovirus-Infektionen beim Rind in der Bundesrepublik Deutschlan // Zbl. vet, med. - 1971. - 18 - P.564.

15. Gaillard R.K., loklik W.K. Quantitation of the relatedness of the genjmes of reoviruses serotype 1, 2 and 3 at the gene level. // Virology., 1982. - P.123. - 152.

16. Stanley N.F., Dorman D.C., Pansford I., 1953 - Aust.I. exp. «Biol. med Sci» 1953. - V.31. - P.149-159.

17. Sharpe A.H., Fields B.N., - Pathogenesis of reovirus infection. In: The Reoviridae, ed by W.K. loklik, Plenum, New. York. - 1983. - P.229-285.

18. Thomas L., Collins A., - Veter. Rec., 1974. - 94. - № 22. - Р.506-509.

Таблица 1
Результаты серологического обследования поголовья крупного рогатого скота к антигену реовируса типа I
Название региона	Возрастная группа	n	Титры антител в РТГА	Всего положительных
1:40	1:80	1:160	1:320 и выше	число	процент
Арский р-н РТ	коровы	60	8	9	2	0	19	31
телята	30	1	0	1	0	2	6
Атнинский р-н РТ	коровы	120	18	12	6	22	58	48
телята	60	5	6	5	13	29	48
Апастовский р-н РТ	коровы	385	93	31	6	5	135	35
телята	-	-	-	-	-	-	-
Балтасинский р-н РТ	коровы	135	24	23	12	5	64	47
телята	45	8	9	5	1	23	51
Камскоустьинский р-н РТ	коровы	12	2	0	5	1	8	67
телята	44	7	4	2	1	14	31
Кайбицкий р-н РТ	коровы	110	5	10	9	3	27	25
телята	30	7	1	0	0	8	27
Респ. Башкортостан	коровы	40	2	12	0	12	26	65
телята	10	1	4	2	1	8	80

Таблица 2
Сравнительная оценка результатов в ИФА и РТГА.
Результаты ИФА, количество проб:	Результат РТГА, количество проб:
положительных (n=115)	отрицательных (n=73)
положительных	111	5
отрицательных	4	68

Таблица 3
Показатели уровня специфических антител к антигену реовируса типа I - в сыворотках крови обследованного поголовья крупного рогатого скота
№ п/п	Название хозяйств	Кол-во проб	Из них серопозитивных в ИФА
Кол-во	%
1	2	3	6	7
Арский район РТ
1	ООО «Ак Барс-Агро»	90	43	47,7
Атнинский район РТ
2	СХПК ПЗ «им. Ленина»	90	36	40,0
3	ООО «Тукаевский»	90	41	45,5
Балтасинский район РТ
4	ООО «Смаиль»	5	2	40,0
5	ООО «Игенче»	95	35	33,3
6	ООО «Труд»	15	5	33,3
7	ООО «Сосна»	45	20	44,4
8	ООО «Маяк»	55	15	27,3
Кайбицкий район РТ
9	ООО «Кубня»	140	54	38,6
Нурлатский район РТ
10	КФХ «Сулейманова»	13	3	23,0
Новошешминский район РТ
11	А/Ф «Татарстан»отд. «Тубылгы Тау»	21	5	23,8
12	А/Ф «Кулон»	20	5	25,0
13	А/Ф «Татарстан» отд. «Азеево»	20	15	75,0
Камскоустьинский район РТ
14	ООО «Сюкеево»	56	35	62,5
Рыбнослободский район РТ
15	ООО «Слободское»	26	4	15,4
Апастовский район РТ
16	ООО СХП «им. Рахимова»	30	15	50,0
17	ООО СХП «Гран»	30	13	43,3
18	ООО СХП «Ибрагимов и К»	30	11	36,6
19	ООО СХП «Алга» д.Тумаево	30	18	60,0
20	МТФ «Утямышево»	28	21	75,0
21	ООО СХП «Енали д.Ст.Юмралы	32	20	62,5
22	МТФ «Азбаба»	25	13	52,0
23	ООО СХП «Енали» д.Ср.Балтай	25	15	60,0
24	ООО СХП «Енали» д.Девлекеево	30	16	53,3
25	ООО СХП «Табар»	45	30	66,6
26	МТФ «Б.Кокузи»	30	22	73,3
27	000 СХП «Алга» д.Шугай	50	38	76,0
Верхнеуслонский район РТ
28	«Красный Восток - Агро»	52	14	26,9
Тетюшский район РТ
29	ООО «Маяк»	15	7	46,6
Мамадышский район РТ
30	А/Ф «Таканыш»	20	3	15,0
Саратовская область РФ
31	ЗАО Племзавод «Тудовой»	26	10	38,4
32	ООО «Сергеевское»	45	5	11,1
Республика Башкортостан
33	им. Ленина	15	15	100,0
34	им. Марселя Хузина	30	25	83,3
35	Актай	9	9	100,0
	Всего проб	1378	638	46,2