способ прогнозирования развития осложнений гастродуоденальных язв

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития осложнений гастродуоденальных язв путем иммунологического исследования клеток слизистой оболочки желудка и/или двенадцатиперстной кишки, отличающийся тем, что определяют экспрессию рецепторов мелатонина МТ-1 и МТ-2 в исследуемых клетках и рассчитывают значение дискриминантной функции по формуле

D=1,127·MT1/MT2-4,005,

где МТ-1 - экспрессия рецепторов мелатонина МТ-1 в исследуемых клетках, %;

МТ-2 - экспрессия рецепторов мелатонина МТ-2 в исследуемых клетках, %,

и при D>0 прогнозируют развитие осложнений, а при D<0 - благоприятное течение заболевания.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к хирургии и гастроэнтерологии, и может быть использовано в прогнозировании развития осложнений гастродуоденальных язв.

В настоящее время раскрыта роль мелатонина в патогенезе многих заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и, в первую очередь, язв желудка и двенадцатиперстной кишки. Перспективными являются исследования по изучению экспрессии на слизистой рецепторов мелатонина МТ-1 и МТ-2, через которые реализуются эффекты мелатонина.

Известен способ прогнозирования развития осложнений гастродуоденальных язв, заключающийся в определении уровня мелатонина в ЕС-клетках слизистых желудка и двенадцатиперстной кишки путем проведения иммуногистохимических исследований с использованием поликлональных кроличьих специфических антител к мелатонину (CIDtech. Res. Inc., титр 1:150). При обострении язвенной болезни зафиксирована существенная гиперплазия мелатонинсодержащих ЕС-клеток, что дает возможность прогнозирования течения патологического процесса (Князькин И.В. Экстрапинеальный мелатонин в процессе старения 14.00.53 - геронтология и гериатрия. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Санкт-Петербург - 2008). Этот способ принят авторами за прототип.

Недостаток прототипа состоит в том, что в группе пациентов с язвенной болезнью в стадии ремиссии уровень гиперплазии мелатонинсодержащих ЕС-клеток возвращается к величинам, аналогичным у пациентов с хроническим гастритом, и по этой причине прогнозировать отдаленные осложнения гастродуоденальных язв не представляется возможным.

Техническим результатом изобретения является разработка более эффективного и специфичного способа прогнозирования хирургических осложнений гастродуоденальных язв.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе прогнозирования развития осложнений гастродуоденальных язв путем иммунологического исследования клеток слизистой оболочки желудка и/или двенадцатиперстной кишки согласно изобретению определяют экспрессию рецепторов мелатонина МТ-1 и МТ-2 в исследуемых клетках и рассчитывают значение дискриминантной функции по формуле:

D=1,127×MT1/MT2-4,005,

где МТ-1 - экспрессия рецепторов мелатонина МТ-1 в исследуемых клетках, %;

МТ-2 - экспрессия рецепторов мелатонина МТ-2 в исследуемых клетках, % и при D>0 прогнозируют развитие осложнений, а при D<0 - благоприятное течение заболевания.

В результате проведенных исследований установлен феномен, заключающийся в различной степени экспрессии рецепторов мелатонина МТ-1 и МТ-2 на клетках слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки у пациентов с различным течением заболевания.

Исследования показали, что соотношение экспрессии рецепторов мелатонина МТ-1/МТ-2 может быть прогностическим фактором развития осложнений гастродуоденальных язв в любой стадии заболевания (р=0,00001). Для определения прогностического значения этого фактора был проведен дискриминантный анализ и составлена формула для вычисления.

По результатам дискриминантного анализа чувствительность способа составила 100%, специфичность - 82%.

Исследование экспрессии рецепторов мелатонина было выполнено 40 пациентам. Исследования проводились у трех групп пациентов:

В группе (n-8) больных без эрозивно-язвенных поражений желудка и двенадцатиперстной кишки соотношение МТ-1/МТ-2 в среднем составило 1,46±0,42. У пациентов с язвой желудка или двенадцатиперстной кишки в момент исследования или в анамнезе (n-16) этот показатель в среднем оказался на уровне 2,04±1,10. В группе с хирургическими осложнениями (кровотечения, перфорации, n-16) в анамнезе средний показатель соотношения МТ-1/МТ-2 повысился до 5,07±1,21.

Предлагаемый способ может быть осуществлен, например, следующим образом.

При помощи полученных в ГНЦ НИИ Особо Чистых Биопрепаратов (г.Санкт-Петербург) первичных специфических антител к МТ-1 и МТ-2 рецепторам [А.Г.Тоноян. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности хирургия "Прогнозирование течения острого панкреатита на основании определения экспрессии рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови (клинико-экспериментальное исследование)" Санкт-Петербург 2009] и коммерческих моноклональных антител с флюоресцентными метками (goat anti rabbit FITC Ig G+M производства Becton Dickinson) выполняют непрямую иммунофлюоресценцию.

Исследуемым материалом являются биоптаты слизистой желудка или двенадцатиперстной кишки, полученные при эндоскопической инцизионной биопсии. Материал транспортируют в жидком азоте с последующим хранением при температуре t=-70°С. Для получения суспензии клеток слизистой оболочки производят механическое измельчение биоптата слизистой до фрагментов величиной d=1 мм с помощью скальпеля в чашке Петри с последующим добавлением буферного раствора в объеме 5 мл и фильтрацией через 35 мм фильтр. Центрифугируют полученную взвесь в течение 10 мин при 2300 об/мин.

Удаляют надосадочную жидкость и перемещают с помощью автоматической пипетки осевшие на дно клетки в две промаркированные пробирки по 100 мкл в каждую.

Добавляют в первую пробирку с образцами клеток 10 мкл полученных ранее специфических антител к МТ-1 рецепторам, во вторую - 10 мкл специфических антител к МТ-2 рецепторам.

Инкубацию образцов производят в темноте при температуре t=+4°С в течение 12 часов.

Центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин с последующей отмывкой.

Окрашивают клетки коммерческими моноклональными антителами с флюоресцентными метками (goat anti rabbit FITC Ig G+M производства Becton Dickinson).

Инкубируют образцы в темноте при температуре t=+4°С в течение 30 мин.

Анализ готовых проб проводят на проточном цитометре EPICS XL/MCL/Beckman Coulter/, с использованием программы System II. Учитывают процент экспрессирующих клеток отдельно по МТ-1 и МТ-2 рецепторам.

По найденным значениям экспрессии рецепторов мелатонина МТ-1 и МТ-2 в исследуемых клетках определяют значение дискриминантной функции D=1,127×MT1/MT2-4,005 и при D>0 прогнозируют развитие осложнений, а при D<0 - благоприятное течение заболевания, без осложнений.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Пациентка Т., 43 лет, язвенного анамнеза нет. При ФГДС от 07.12.06. впервые выявленная язва на передней стенке луковицы двенадцатиперстной кишки 0,5×0,6 см, умеренный гастродуоденит.

Проведено исследование предлагаемым способом.

Экспрессия рецепторов мелатонина МТ-1 в исследуемых клетках - 6,5%, экспрессия рецепторов мелатонина МТ-2 - 4,9%, значение дискриминантной функции D=1,127×6,5/4,9-4,005=-2,51. D<0 - полученные данные позволяют прогнозировать благоприятное течение заболевания. Наблюдение за пациенткой в течение 5 лет подтверждает, что осложнений не было.

Пример 2. Пациент Г., 22 лет, язвенного анамнеза нет. При ФГДС от 09.02.07. впервые выявленная язва на задней стенке луковицы двенадцатиперстной кишки 0,5×0,5 см, умеренный гастродуоденит.

Проведено исследование предлагаемым способом.

Экспрессия рецепторов мелатонина МТ-1 в исследуемых клетках - 9,8%, экспрессия рецепторов мелатонина МТ-2 - 2,1%, значение дискриминантной функции D=1,127×9,8/2,1-4,005=1,25. D>0 - полученные данные позволили прогнозировать развитие осложнений и пациент был отнесен к группе риска. Наблюдение за пациентом в течение 5 лет показали, что у пациента имел место эпизод кровотечения.

Предлагаемый способ является высокоспецифичным и позволяет повысить эффективность прогнозирования развития осложнений гастродуоденальных язв в любой стадии заболевания.