способ создания реагента для определения сахаров в присутствии редуцирующих веществ

Формула изобретения

Способ создания реагента для определения содержания глюкозы глюкозооксидазным методом в присутствии аскорбиновой кислоты, заключающийся в том, что 855 мг кристаллогидрата хлорной меди (CuCl₂·2Н₂О) растворяют в 100 мл дистиллированной воды (концентрация ионов Cu²⁺ в приготовленном растворе 50 ммоль/л), добавляют 1 мл приготовленного раствора к 100 мл стандартного реагента, используемого в глюкозооксидазном методе, отличающийся тем, что в качестве окислителя аскорбиновой кислоты используют раствор хлорной меди в конечной концентрации в глюкозооксидазном реагенте 500 мкмоль/л.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области аналитической химии для определения содержания сахаров в присутствии высоких концентраций редуцирующих веществ, создающих препятствия для корректного определения содержания сахаров методами, основанными на восстанавливающих свойствах сахаров.

Для достижения корректного измерения содержания сахаров в присутствии редуцирующих веществ последние предварительно окисляют солями меди (II) (табл.1). Изобретение может быть использовано для определения содержания сахаров в биологических жидкостях (кровь, моча, спинно-мозговая жидкость и др.), во фруктах, овощах, фруктовых соках, молочных продуктах в присутствии редуцирующих веществ.

Большая часть методов определения сахаров основана на наличии у последних восстанавливающих свойств, обусловленных альдегидной группой - йодометрический метод, метод Бертрана и феррицианидный метод (1). На восстанавливающих свойствах глюкозы основан специфичный ферментативный глюкозооксидазный метод определения ее содержания в крови и других биологических жидкостях (2). Перечисленные методы не позволяют корректно измерять содержания глюкозы в присутствии значительных количеств редуцирующих веществ (>100 мкмоль/л). В частности, использование глюкозооксидазного метода для определения содержания глюкозы в крови (3, 4), моче (5) или в цереброспинальной жидкости (6) в присутствии, редуцирующих веществ приводит к заниженным значениям глюкозы, поскольку вещества, обладающие восстанавливающими свойствами, уменьшают интенсивность развивающейся окраски вследствие восстановления образующегося цветного комплекса. Поэтому существует необходимость в разработке реагента для определения сахаров, который бы позволил корректно измерять содержание сахаров в присутствии значительных количеств редуцирующих веществ.

Известен регент на основе фермента аскорбатоксидазы, специфически окисляющий аскорбиновую кислоту и используемый при определении глюкозы в крови в присутствии значительных количеств аскорбиновой кислоты (3). Реагент добавляют к глюкозоксидазному реагенту в конечной концентрации аскорбаткоксидазы 1000МЕ/л. Однако вследствие высокой стоимости аскорбатоксидазы, на порядок превышающей стоимость глюкозоксидазы, данный реагент не представляется экономически оправданным. Кроме этого, аскорбатоксидаза не может быть использована в неферментативных методах определения сахаров, основанных на восстановительных свойствах последних.

Наиболее близким к предлагаемому реагенту является реагент на основе ацетата ртути (II). Добавление этого реагента в конечной концентрации 3 ммоль/л к образцам крови и мочи позволяет корректно определять содержание глюкозы в образцах глюкозооксидазным методом (4). Главным недостатком этого реагента является слишком высокая окислительная способность катиона Hg²⁺ (редокс-потенциал +0,789), превышающая окислительную способность окислителей, используемых в йодометрическом и феррицианидном методах, методе Бертрана. В частности, редокс-потенциал йода составлет +0,535, а феррицианида +0,36. В силу этого соединения ртути (II) окисляют не только редуцирующие вещества, подобные аскорбиновой кислоте, но и сами сахара, уменьшая тем самым развитие цветной окраски и приводя к заниженным значениям определяемых сахаров. Кроме этого соединения ртути токсичны, представляют опасность для персонала и загрязняют окружающую среду.

Целью изобретения является создание реагента для определения сахаров в присутствии редуцирующих веществ, лишенного указанных недостатков.

Поставленная цель достигается использованием в качестве реагента солей меди (II), например хлорной меди (CuCl₂), в конечной концентрации 500 мкмоль/л. Предлагаемый реагент позволяет корректно измерять содержание сахаров в различных образцах за счет окисления редуцирующих веществ ионами Cu²⁺. Редокс-потенциал ионов Сu ²⁺ (+0,19) относительно невелик, и поэтому ионы Сu ²⁺ не окисляют сахара при нейтральных и кислых значениях реакции среды. Соединения меди (II) недорогие и значительно менее токсичные, чем соединения ртути (II).

Предлагаемый реагент используют для определения сахаров в присутствии редуцирующих веществ следующим образом. Реагент приготавливают путем растворения 855 мг кристаллогидрата хлорной меди (CuCl₂·2H ₂O) в 100 мл дистиллированной воды (концентрация ионов Cu²⁺ в реагенте 50 ммоль/л). К содержащему сахара образцу (фруктовые соки, экстракты из фруктов и овощей, биологические жидкости) добавляют предлагаемый реагент, соблюдая соотношения объемов реагента и образца 1:100 (конечная концентрация ионов Сu²⁺ в анализируемом образце 500 мкмоль/л). При определении содержания сахаров (глюкозы) в биологических жидкостях к 100 мл стандартного реагента, используемого в глюкозооксидазном методе, добавляют 1 мл предлагаемого реагента. Далее проводят определение содержания сахаров согласно принятым методам.

Пример 1.

Больной сахарным диабетом принимает по 2 г аскорбиновой кислоты ежедневно в утренние часы. У больного из пальца забирают капиллярную кровь для определения глюкозы глюкозооксидазным методом. Для приготовления заявленного в изобретении реагента в 100 мл дистиллировакнной воды растворяют 855 мг кристаллогидрата хлорной меди (CuCl₂·2H₂O) в 100 мл дистиллированной воды (концентрация ионов Cu²⁺ в реагенте 50 ммоль/л). 1 мл приготовленного реагента добавляют к 100 мл стандартного реагента, используемого в глюкозооксидазном методе (концентрация СuCl₂ в модифицированной глюкозооксидазном реагенте составляет 500 мкмоль/л). Проводят определение содержание глюкозы с помощью стандартного и предлагаемого реагентов. Результаты представлены в таблице.

Таблица
Реагент	Стандартный	Предлагаемый
Содержание глюкозы в плазме крови (моль/л)	5,8	6,5

Результаты свидетельствуют, что при использовании стандартного реагента величина определяемой глюкозы составляет 5,8 ммоль/л и укладывается в границы нормальных значений глюкозы крови (3,5-6,1 ммоль/л). Истинное же содержание глюкозы (6,5 ммоль/л), измеренное с помощью предлагаемого реагента, на 12% больше и выходит за пределы нормальных значений, свидетельствуя, что у больного имеет место гипергликемия, что требует ее коррекции лекарственными средствами.

Литература

1. Межгосударственный стандарт. ГОСТ 3628-78. Молочные продукты. Методы определения сахара, http://www.gosthelp.ru/gost/gost32390.html.

2. Балаховский И.С. // Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. (В.В.Меньшиков - ред.). - М.: Медицина, 1987. С.232.

3. Leary N.O., Pembroke A. and Duggan P.F. Improving Accuracy of Glucose Oxidase Procedure for Glucose Determinations on Discrete Analysers // Clinical Chemistry. 1992. Vol.38, № 2, P.298-302.

4. White-Stevens R.H. Interference by ascorbic acid in test systems involving peroxidase. I. Reversible indicators and the effects of copper, iron, and mercury // Clinical Chemistry. 1982. Vol.28, № 4, P.678-788.

5. Nagel D, Seiler D, Hohenberger EF, Ziegler М. Investigations of ascorbic acid interference in urine test strips // Clinical Laboratory. 2006. Vol.52, № 3-46. P.149-153.

6. Maguire G.A. and Price C.P. Evidence for interference by ascorbate in the measurement of cerebrospinal fluid glucose by a kinetic glucose oxidase peroxidase procedure // Clinical Chemistry. 1983. Vol.29. № 10, P.1810-1812.