способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе

Формула изобретения

Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе, включающий фиксацию, промывку и обезвоживание, пропитку в камфене, высушивание при комнатной температуре, отличающийся тем, что перед фиксацией образца микроорганизмы культивируют на поверхности стерилизованной ячейки ячейковой упаковки, с перфорациями по всему диаметру ячейки, погруженной в питательную среду, образец с микроорганизмами фиксируют в течение 24 ч в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4°С, промывают в фосфатном буфере 20 мин, в дистиллированной воде 6 мин, поэтапно обезвоживают в 70% 15 мин и по 10 мин в 80%, 96% и 100%-ном этиловом спирте, пропитывают в камфене при t=60°C в течение 20 мин, далее образцы высушивают на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и может быть использовано при проведении научно-исследовательских работ, связанных с изучением пространственной структуры биопленок микроорганизмов и ее внеклеточного полимерного матрикса.

Известны способы подготовки образцов биологических тканей к исследованию методом сканирующей электронной микроскопии путем высушивания с помощью метода перехода критической точки, методом замораживания-высушивания, высушивания в вакууме и путем высушивания на воздухе (Микроскопическая техника: Руководство / под ред. Д.С.Саркисова и Ю.Л.Перова. - М.: Медицина, 1996. - с.247-250).

Однако для осуществления данных методов необходимы специальное дорогостоящее оборудование и реактивы, в противном случае это приводит к грубой деформации структуры образца.

Известен способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе, включающий фиксацию, промывку и обезвоживание. После обезвоживания, не высушивая, образцы переносят в смесь дегидранта и камфена, затем последовательно пропитывают в двух порциях расплавленного камфена при температуре 51-60ºС, после пропитывания камфеном образец высушивают на воздухе (RU 2397472 С1).

Однако известный способ не позволяет исследовать структуру биопленок, образованных прокариотными организмами.

Задачей изобретения является предотвращение деформации клеток и микрорельефа клеточной поверхности бактерий, а также пространственной структуры биопленок микроорганизмов и внеклеточного полимерного матрикса в процессе высушивания для получения изображений методом сканирующей электронной микроскопии.

Указанный технический результат достигается тем, что перед фиксацией образца микроорганизмы культивировали на поверхности стерилизованной ячейки ячейковой упаковки с перфорациями по всему диаметру ячейки, погруженной в питательную среду, образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4ºС, промывали в фосфатном буфере 20 минут, в дистиллированной воде 6 мин, поэтапно обезвоживали в 70% 15 минут и по 10 минут в 80%, 96% и 100% этиловом спирте, пропитывали в камфене (С10Н16) при t=60°C в течение 20 минут, далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре. Изобретение иллюстрируется подробным описанием, примером его практического использования и электронными сканограммами (см. фиг.1), на которых микроорганизмы расположены в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сообществ - биопленок; а - пространственная структура биопленки микроорганизмов, увеличение ×650; б - внеклеточный полимерный матрикс биопленки микроорганизмов, увеличение ×5000; в - форма клеток и клеточной поверхности, увеличение ×8000.

Способ осуществляется следующим образом.

Для подготовки образцов биопленок микроорганизмов перед исследованием методом сканирующей электронной микроскопии микроорганизмы культивируют на поверхности ячейки диаметром 3 мм ячейковой упаковки с перфорациями (проколы сверху вниз) по всему диаметру ячейки. Ячейку погружают в суспензию микроорганизмов в питательной среде. После культивирования бактерий в условиях, соответствующих поставленной задаче, образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4°С. Затем их промывали в фосфатном буфере 20 минут (4 раза по 5 мин), в дистиллированной воде 6 минут (3 раза по 2 мин). Затем обезвоживали поэтапно в 70% 15 минут (3 раза по 5 мин) и по 10 минут в 80% (2 раза по 5 мин), 96% (2 раза по 5 мин), 100% (2 раза по 5 мин) этиловом спирте. Пропитывали в камфене (С10Н16) при t=60°C в течение 20 минут (2 раза по 10 мин). Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре. Затем осуществляли монтаж ячейки на держатель образца для сканирующего электронного микроскопа.

Подготовленные образцы исследуют в сканирующем электронном микроскопе.

Практическое использование способа иллюстрируется следующим примером. Для исследования взяли стерилизованные ячейки ячейковой упаковки, перфорировали по всему диаметру ячейки и погрузили в суспензию микроорганизмов в питательной среде (питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар)). После культивирования бактерий в условиях, соответствующих поставленной задаче, образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4°С. Затем их промывали в фосфатном буфере 4 раза по 5 мин, в дистиллированной воде 3 раза по 2 мин. Затем поэтапно обезвоживали в 70% - 3 раза по 5 мин, в 80% - 2 раза по 5 мин, 96% - 2 раза по 5 мин, 100% - 2 раза по 5 мин этиловом спирте. Пропитывали в камфене (С10Н16) при t=60°C - 2 раза по 10 мин. Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре. После чего осуществляли монтаж ячейки на держатель образца для сканирующего электронного микроскопа.

После напыления серебром в ионном напылителе IB-6 препараты исследовали при помощи сканирующего электронного микроскопа JSM-840 (Япония). В подготовленном образце сохранены: форма клеток, микрорельеф клеточной поверхности, пространственная структура сформировавшейся биопленки и внеклеточного полимерного матрикса (Фиг.1 а, б, в).

Предложенный способ используется в ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А.Илизарова» Минздравсоцразвития России в научно-клинической лаборатории микробиологии и иммунологии. Способ позволил получить изображения как отдельных клеток в процессе развития биопленки, так и пространственной структуры биопленки микроорганизмов без деформации размеров, формы клеток, клеточной поверхности и нарушения связей между клетками.