способ жидкостной хроматографии в закрытом тонком слое сорбента и устройство для его осуществления

Формула изобретения

1. Способ жидкостной хроматографии в закрытом тонком слое сорбента, включающий разделение пробы на хроматографические зоны отдельных компонентов в восходящем потоке жидкого элюента под действием капиллярных сил, изменение скорости движения элюента путем понижения давления в сорбционном слое перед фронтом элюента и количественное определение содержания разделенных на сорбенте компонентов с использованием видеоденситометрического детектора хроматографических зон на слое сорбента в УФ или видимом свете, отличающийся тем, что хроматографическое разделение проводят на сорбенте, помещенном в капиллярную колонку, а исследуемую пробу наносят на сорбент путем дозирования в поток элюента на входе в колонку.

2. Устройство для жидкостной хроматографии в закрытом тонком слое сорбента, содержащее емкость с жидким элюентом, побудитель расхода элюента с вакуумным насосом и видеоденситометрический детектор хроматографических зон компонентов на слое сорбента в УФ или видимом свете, отличающееся тем, что устройство содержит дозатор для введения исследуемой пробы в поток элюента на входе в колонку, а для герметизации сорбента используют капиллярную колонку, выполненную в виде трубки с внутренним диаметром 0,05-2,0 мм из материала, практически не поглощающего УФ-излучение, например плавленый SiO₂.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано при анализе смесей органических и неорганических веществ методом тонкослойной хроматографии в различных научных и практических областях медицины, биологии, химии, пищевой промышленности, охране окружающей среды и других отраслях народного хозяйства.

Известны различные способы и устройства для анализа химических веществ методом тонкослойной хроматографии, включающие нанесение анализируемой пробы на тонкослойные пластины, содержащие плоский (планарный) слой сорбента, которые затем устанавливают в специальные проявительные камеры для контакта с жидкой подвижной фазой, за счет восходящего потока которой по слою сорбента происходит разделение исходной пробы на отдельные зоны, а количественную интерпретацию полученных хроматографических данных на слое сорбента осуществляют с помощью УФ сканирующих детекторов (денситометров) (Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии. - СПб.: Химиздат, 2005. - 232 с.).

Недостатками известных способов и устройств для их осуществления являются низкая воспроизводимость и достоверность результатов качественного и количественного анализа, связанная с влиянием степени насыщения хроматографической камеры парами подвижной фазой и влиянием параметров окружающей среды, включая влажность воздуха и наличие в нем примесей, способных изменять сорбционные характеристики сорбентов.

Известен также способ капиллярной жидкостной хроматографии с использованием видеоденстометрии (Берёзкин В.Г., Онучак Л.А., Евтюгина Е.Н. Капиллярный вариант хроматографии М.С. Цвета с использованием видеоденстометрии как метода детектирования // Докл. АН., 2008. Т.421 № 2 - C.1-3).

Однако в известном способе отсутствует возможность как дозирования исследуемой пробы непосредственно в поток элюента на входе в капиллярную колонку, так и изменения скорости хроматографического разделения компонентов пробы на слое сорбента.

Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является способ хроматографического разделения смесей веществ в закрытом тонком слое сорбента, состоящий в нанесении разделяемых образцов на свободный от полимерного покрытия сорбционный слой, подаче на сорбционный слой элюента с последующим продвижением фронта элюента вдоль сорбционного слоя, причем после достижения фронтом элюента слоя сорбента, находящегося под полимерным покрытием, обеспечивают понижение давления в сорбционном слое перед фронтом элюента вплоть до момента достижения фронтом длины пробега, необходимой для разделения анализируемой смеси веществ.

Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является устройство для хроматографического разделения смесей веществ в закрытом тонком слое сорбента, содержащее тонкослойную хроматографическую пластину с закрытым тонким слоем сорбента, часть сорбционного слоя, свободную от полимерного покрытия, емкость с элюентом, из которой подают элюент на сорбционный слой, а также побудитель расхода элюента с вакуумным насосом (SU 1457592, G01N 30/90, 27.02.95).

Однако в известном способе и устройстве для его осуществления не обеспечивается достаточная эффективность разделения хроматографических зон на слое сорбента и точность результатов анализа.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является повышение эффективности разделения и точности результатов измерения, а также уменьшение времени анализа.

Указанная задача решается за счет того, что в способе жидкостной хроматографии в закрытом тонком слое сорбента, который включает разделение пробы на хроматографические зоны отдельных компонентов в всходящем потоке жидкого элюента под действием капиллярных сил, изменение скорости движения элюента по слою сорбента путем понижения давления в сорбционном слое перед фронтом элюента и количественное определение содержания разделенных на сорбенте компонентов с использованием видеоденситометрического детектора хроматографических зон на слое сорбента в УФ или видимом свете, хроматографическое разделение проводят на сорбенте, помещенном в капиллярную колонку, а исследуемую пробу дозируют в поток элюента на входе в колонку.

Эта задача решается также за счет того, что в устройстве для жидкостной хроматографии в закрытом тонком слое сорбента, содержащем емкость с жидким элюентом, побудитель расхода элюента с вакуумным насосом и видеоденситометрический детектор хромотографических зон компонентов, разделенных на слое сорбента в УФ или видимом свете, причем устройство содержит специальный дозатор для ввода пробы в поток элюента на входе в колонку, а для герметизации сорбента используют капиллярную колонку, выполненную, в виде трубки с внутренним диаметром 0,05-2,0 мм из материала, практически не поглощающего УФ-излучение и видимый свет, например плавленого SiO₂.

При решении поставленной задачи создается технический результат, заключающийся в уменьшении диффузионного размытия хроматографических зон сорбатов на слое сорбента, повышении точности (правильности и прецизионности) измерения и уменьшении времени анализа.

Этот результат достигается за счет проведения хроматографического разделения на сорбенте, помещенном в капиллярную колонку, выполненную из плавленого кварца (SiO ₂) или стекла, что обеспечивает получение как визуальной хроматограммы на слое сорбента, так и распечатанной с помощью сканирующего видеоденситометрического детектора. При этом размывание хроматографических зон сорбатов происходит только в одном направлении (по направлению движения жидкого элюента в капиллярной колонке), что значительно увеличивает эффективность хроматографического разделения и точность результатов анализа.

Уменьшение времени анализа достигается за счет использования побудителя расхода элюента в виде вакуумного насоса на выходе капиллярной колонки.

Кроме того, при решении поставленной задачи повышается прецизионность измерения (сходимость в условиях повторяемости) за счет уменьшения влияния состава газовой фазы на хромотографические характеристики сорбента (влажность, содержание примесей и др.) путем использования вакуумного побудителя расхода элюента и дозирования исследуемой пробы в поток жидкого элюента на входе в колонку.

Это позволяет сделать вывод, что заявляемые изобретения связаны между собой единым изобретательским смыслом.

Пример конкретного выполнения способа и устройство для его осуществления

На фиг.1 схематически изображено устройство для жидкостной хроматографии в закрытом тонком слое сорбента.

Устройство содержит капиллярную колонку с сорбентом 1, емкость 2 с жидким элюентом, вакуумный насос (побудитель расхода элюента) 3 на выходе колонки, дозатор 4 для ввода исследуемой пробы в поток элюента на входе в колонку.

Предлагаемое устройство работает следующим образом.

Дозатор 4 погружают в емкость 2 с жидким элюентом. После того как фронт элюента под действием капиллярных сил достигнет слоя сорбента на входе колонки, микрошприцем вводят в дозатор 4 исследуемую пробу, которая хроматографируется в потоке элюента при воздействии вакуумного насоса 3, создающего разряжение перед движущимся фронтом элюента.

После завершения процесса хроматографирования (элюент поднялся по слою сорбента на требуемую высоту) капиллярную колонку 1 переносят в видеоденситометрический детектор для получения хроматограммы с пиками анализируемых компонентов для оценки эффективности и точности измерения хроматографических величин.

Экспериментальная оценка выполнения предлагаемого и известного способов жидкостной хроматографии в закрытом тонком слое сорбента проводилась на сорбенте Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ с диаметром зерна d_p=5-7 мкм.

Объектами исследования были красители (бриллиантовый зеленый, родамин С, эритрозин) и витамин В₁₂. Для разделения красителей использовали жидкий элюент ацетонитрил и хлороформ в соотношении 1:1. Для хроматографирования водорастворимых витаминов в качестве элюента использовали ацетонитрил - 1%-ный водный раствор H ₂SO₄ состава 4:1 по объему.

Распечатку хроматограммы на слое сорбента получали с использованием видеоденситометрического детектора «Сорбфил» производства ЗАО «Сорбполимер», г.Краснодар.

Из полученных хроматограмм (выборка из n 5 анализов) рассчитывали следующие хроматографические характеристики сорбатов:

1. Число теоретических тарелок, N

где l_i - расстояние, пройденное сорбатом от начала анализа до максимума пика, - ширина хроматографического пика у основания.

2. Фактор задержки, R_f

где L - расстояние, пройденное элюентом от начала анализа.

3. Разрешение двух пиков 1 и 2, R_s

4. Концентрацию анализируемых веществ, измеренную методом внутренней нормализации,

где - единичное измерение концентрации i-го компонента в выборке;

N - общее число пиков на хроматограмме.

5. Правильность измерения,

где C_i(ист) - истинная концентрация i-го компонента в градуировочной смеси; - измеренная концентрация.

6. Прецизионность измерения в виде относительной случайной составляющей погрешности измерения, S_r

Хроматографическое разделение известным способом проводили на ТСХ пластине Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ с диаметром зерна сорбента d_p=5-7 мкм. Анализируемую пробу объемом около 2 мкл наносили на свободный от полимерного покрытия сорбционный слой. Затем ТСХ пластину устанавливали в хроматографическую камеру с элюентом. После того как фронт элюента достигает слоя до сорбента, находящегося под полимерным покрытием, которое герметизирует тонкий слой сорбента, включают побудитель расхода с вакуумным насосом. Элюент принудительно под некоторым разряжением движется по слою сорбента и происходит разделение смеси на отдельные хроматографические зоны на слое сорбента. Затем ТСХ пластину помещают в денситометр «Сорбфил» и получают распечатанную хроматограмму.

Хроматографическое разделение предлагаемым способом проводили на сорбенте, помещенном в кварцевый капилляр с внутренним с внутренним диаметром d_c=0,53 мм. Длина капилляра не превышала 60 мм.

Анализируемую пробу объемом около 2 мкл дозировали в поток жидкого элюента на входе в колонку.

Результаты экспериментов представлены в таблицах 1 и 2 «Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов».

Таблица 1
Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов
№ п/п	Разделяемые аналиты	Известный способ	Предлагаемый способ
Rs	R f	N	Rs	R f	N
1	Бриллиантовый зеленый	Rs(1-2) 4,1	0,08±0,01	225	Rs(1-2) 3,8	0,08±0,03	108
2	Родамин С	0,42±0,02	2100	0,48±0,03	1005
Rs(2-3) 7,4	Rs(2-3) 6,1
3	Эритрозин	0,95±0,01	3053	0,94±0,03	1461

Таблица 2
Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов
№ п/п	Сорбаты	Ci(ист) мг/мл	Известный способ	Предлагаемый способ
мг/мл	, %	S 2, %	Время анализа, мин	мг/мл	, %	S 2, %	Время анализа, мин
1	Родамин С	6,0	6,2	3,3	3,4	15,2 6	6,1	1,7	1,8	10,17
2	Витамин B12	200	185	7,5	3,5	5,96	193	3,5	3,2	3,97

Как видно из приведенных в таблицах данных в предлагаемом способе по сравнению с известным значительно увеличивается эффективность разделения. Например, для красителей число теоретических тарелок N увеличивается почти в 2 раза. Точность предлагаемого способа выше известного. Так, правильность измерения концентрации родамина С и витамина B₁₂ увеличилась в 2 раза, а прецизионность измерения родамина С улучшилась в 1,8 раза.

Использование предлагаемого способа жидкостной хроматографии в закрытом тонком слое сорбента и устройства для его осуществления позволяет:

1. Проводить определение действующих веществ в готовых лекарственных препаратах вследствие большей воспроизводимости фактора задержки R_f, экспрессности, миниатюризации хроматографической системы и простоты выполнения эксперемента.

2. Упростить эксплуатацию хроматографического устройства за счет использования дозирования пробы в поток элюента на входе в колонку.

3. Значительно уменьшить количество жидкого элюента, необходимого для анализа.

4. Улучшить метрологические характеристики хроматографического анализа.