средство, обладающее ранозаживляющей активностью

Формула изобретения

Применение гипаконитина в качестве средства, обладающего ранозаживляющей активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям.

Известно большое количество средств, обладающих ранозаживляющей активностью: метилурапил, солкосерил, облепиховое масло, натрия нуклеинат и др. [1, 2].

Недостатком данных средств является зачастую их низкая эффективность [2].

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих выраженной ранозаживляющей активностью.

Поставленная задача достигается применением гипаконитина в качестве средства, обладающего ранозаживляющей активностью.

Новым в предлагаемом изобретении является использование гипаконитина в качестве средства, обладающего ранозаживляющей активностью.

Используемое оригинальное средство гипаконитина разработано и получено ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (г. Томск) совместно с Национальным исследовательским Иркутским Государственным Техническим Университетом (г. Иркутск) и представляло собой 0,00025% водный раствор данного алкалоида. Гипаконитин извлекался из травы растений семейства лютиковых в виде свободных оснований экстракцией стандартным методом [3].

Важная роль в регенерации тканей принадлежит резидентным прогениторным, в том числе стволовым (СК), клеткам [4, 5]. При этом существует фармакологическая стратегия регенеративной медицины, заключающаяся в стимуляции эндогенных родоначальных элементов [5]. Причем активация последних может являться следствием как прямого воздействия фармакологических агентов на прогениторные элементы, так и результатом стимуляции клеток микроокружения тканей, опосредованно определяющей ускоренное течение репаративных процессов [5, 6].

Ранее авторами было показано ускорение заживления ран кожи комплексными экстрактами и алкалоидной фракцией живокости высокой [7]. При этом максимальный ранозаживляющий эффект наблюдался при использовании суммы алкалоидов, среди которых доминирующим является элатин [8]. В то же время с помощью метода тонкослойной хроматографии в алкалоидной фракции было установлено содержание других алкалоидов, в том числе гипаконитина. Гипаконитин (C₃₃H₄₅NO₁₀),

представляет собой гетероциклическое азотсодержащее органическое соединение растительного происхождения. Чаще всего его извлекают из растений рода Аконит, хотя он встречается и в других растениях [7, 9]. Известно, что гипоаконитин, как и некоторые другие алкалоиды аконитиновой группы, обладает анальгетической активностью [10]. При этом способность гипаконитина стимулировать процессы регенерации, в том числе заживления ран, в литературе не описана. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения гипоаконитина с достижением нового технического результата, заключающегося в стимуляции заживления ран, для специалиста не является очевидным.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе. Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на 86 беспородных мышах-самцах. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005).

Пример 1

Ранозаживляющую активность предлагаемого средства и механизмы его действия изучали на модели плоскостной кожной раны [11]. На депилированном участке спины у мышей под легким эфирным наркозом вырезали лоскут кожи размером 10×10 мм. Для моделирования более длительного заживления струп с экспериментальной раны регулярно (через сутки) снимали.

Предлагаемое средство получали из травы аконита байкольского и живокости высокой. Надземная часть растений, собранная в период цветения в Иркутской области, измельчалась до размера частиц менее 5 мм, обрабатывалась раствором карбоната натрия и подвергалась непрерывной экстракции хлороформом в течение 5 суток. Хлороформный экстракт упаривали до небольшого объема и тщательно экстрагировали 5% серной кислотой. Кислотную вытяжку подщелачивали карбонатом натрия до рН 9-10 и экстрагировали сначала эфиром. Эфирный экстракт упаривали досуха, растворяли в небольшом количестве эфира и хроматографировали на дезактивированной окиси алюминия в системе гексан-ацетон (90 50%). При этом гипаконитин, дополнительно очищенный перекристаллизацией из смеси тех же растворителей, элюировался после мезаконитина. Вещество растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации 0,00025%.

Полученное средство применяли наружно, начиная с первого дня после моделирования раны, ежедневно в течение всего периода заживления. Раствор наносили в объеме 30 мкл. В качестве средств сравнения использовали гель «Солкосерил» (Ай Си Эн Швейцария АГ, Швейцария) и «Облепиховое масло» (ОАО Нижфарм, Россия), которые применяли по той же схеме и в эквивалентном количестве, что и раствор гипаконитина.

Критериями стимулирующего регенерацию действия служили средний диаметр раны и результаты гистологического исследования биоптатов кожи мышей, полученных на 15-е сутки из края раневого дефекта. Биопсийные образцы раневого дефекта кожи окрашивали гематоксилин-эозином. В каждом препарате оценивали: рельеф регенерата кожи, степень и характер инфильтрации, наличие и выраженность отека, количество новообразованных сосудов, волосяных фолликулов и потовых желез. Изучали такие патоморфологические процессы, как акантоз, гиперкератоз, дискератоз [12]. На 3-и и 5-е сут методом клонирования определяли содержание мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф) в раневой поверхности [13], а также методом колониеобразования в тест-системе изучали продукцию гуморальных факторов стромальными клетками кожи (колониеобразующую активность супернатантов адгезирующих клеток с раневой поверхности в отношении КОЕ-Ф костного мозга) [13]. Кроме того, определяли прямое влияние гипаконитина на КОЕ-Ф. Для этого его вносили в культуру миелокариоцитов в концентрации 100 нМоль/мл, после чего на 7-е сут подсчитывали количество колоний [13]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.

В ходе эксперимента заживление ран у контрольных животных отмечалось к 18 сут опыта. Использование гипаконитина способствовало значительному ускорению процессов регенерации. Заживление дефекта при использовании предлагаемого средства наблюдалось к 14 сут опыта, в то время как при применении средств сравнения таковое отмечалось лишь к 16 сут. При этом в опытной группе (гипаконитин) имело место наиболее выраженное снижение размера ран (табл.1).

При гистологическом исследовании процессов, протекающих в области раневого дефекта кожи мышей, показал, что в контрольной группе имело место формирование неполноценного регенерата. В подавляющем большинстве случаев поверхностный эпителий наблюдался не на всем протяжении, встречались небольшие участки отслойки эпидермиса от дермы с наличием субэпидермальных щелей, отмечалось резкое утолщение эпителиального пласта с нечеткой дифференцировкой слоев и увеличение количества базального, зернистого и рогового слоев. Внутриэпителиально обнаруживались нейтрофильные лейкоциты с формированием микроабсцессов, наблюдались слабовыраженные явления акантоза, гипер- и дискератоза. Подлежащая ткань была представлена созревающими грануляциями с умеренной гистиоцитарно-лейкоцитарной инфильтрацией, явлением отека и очагами кровоизлияний в верхних слоях дермы. Во всех образцах в прилежащей к зоне дефекта ткани отмечается малое количество волосяных фолликулов и потовых желез. Регенерат кожи у животных контрольной группы характеризовался умеренным воспалением, что привело к усиленной пролиферации эпителия, для которой характерны атипические разрастания и изменения эпителия в виде акантоза, гипер- и дискератоза. Изучение гистоструктуры раневого дефекта в группе животных, получавших терапию гипаконитином, показало формирование полноценного соединительнотканного рубца, покрытого эпителием. В остальных образцах (группы сравнения) эпителиальный слой был резко неравномерный, с утолщением в зоне дефекта за счет клеток базального слоя. Подлежащая ткань - грануляционная, местами с очаговой умеренной нейтрофильной инфильтрацией. В области, прилежащей к дефекту, во всех образцах ткани отмечалось умеренное количество волосяных фолликулов и потовых желез. При этом количество животных, у которых произошла полная эпителизация при использовании предлагаемого средства было достоверно выше, чем в контроле (табл.2).

Исследование механизмов регенеративной активности данного средства выявило ряд уникальных феноменов. Применение алкалоида сопровождалось существенным увеличением числа КОЕ-Ф в раневой поверхности (табл.3) и ускорением их дифференцировки (табл.4). При этом выявленные изменения наблюдались на фоне возрастания продукции ростовых факторов стромальными клетками кожи (табл.5). В то же время отмечалось и прямое действие данного алкалоида на прогениторные клетки. Его внесение в культуру миелокариоцитов сопровождалось значительным увеличением выхода в метилцеллюлозной среде числа КОЕ-Ф (табл.6). При этом средства сравнения на данные параметры влияния не оказывали (табл.3-6).

В целом полученные результаты свидетельствуют о наличии способности у гипаконитина значительно стимулировать процессы заживления ран. Механизмами действия алкалоида является активация резидентных мезенхимальных клеток-предшественников, связанная как с его прямым влиянием на прогениторные клетки, так и с опосредованным повышением выработки ростовых факторов стромальными клетками кожи действием.

Таблица 1
Динамика среднего диаметра ран, в см (Х±т)
Сроки исследования/сутки	Контроль	Гипаконитин	Солкосерил	Облепиховое масло
1	1,09±0,01	1,12±0,02	1,06±0,03	1,03±0,02
3	0,98±0,02	0,94±0,03	1,0±0,02	0,92±0,04
5	0,9±0,02	0,79±0,02*	0,78±0,03*	0,9±0,03
7	0,76±0,03	0,61±0,04	0,73±0,02	0,67±0,02*
9	0,57±0,02	0,52±0,03	0,51±0,01*	0,54±0,03
12	0,28±0,03	0,17±0,02*	0,21±0,01*	0,2±0,01*
13	0,20±0,02	0,06±0,01*	0,14±0,01*	0,16±0,02
14	0,1±0,03	0,0±0,0	0,07±0,01	0,06±0,02
16	0,06±0,03	0,0±0,0	0,0±0,0	0,0±0,0
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Таблица 2
Доля животных с полной эпителизацией места дефекта кожи, в % (Х±m)
Контроль	Гипаконитин	Солкосерил	Облепиховое масло
4,6±0,9	91,2±5,47*	56,4±10,3*	51,7±9,4*
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Таблица 3
Содержание мезенхимальных клеток-предшественников в раневой поверхности, на 2,5×105 нуклеаров, (Х±m)
Сроки исследования/сутки	Контроль	Гипаконитин	Солкосерил	Облепиховое масло
3	0,67±0,21	2,83±0,31*	0,7±0,3	0,65±0,19
5	1,17±0,3	3,0±0,37*	1,0±0,22	0,92±0,43
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Таблица 4
Индекс дифференцировки клеток-предшественников (отношение кластреробразующих единиц фибробластов к колониеобразующим единицам фибробластов) в раневой поверхности, в усл. ед., (Х±m)
Сроки исследования/сутки	Контроль	Гипаконитин	Солкосерил	Облепиховое масло
3	1,33±0,21	1,82±0,2	1,34±0,19	1,42±0,37
5	1,42±0,27	2,4±0,26*	1,36±0,22	1,41±0,16
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Таблица 5
Колониестимулирующая активность супернатантов стромальных клеток кожи, в усл. Ед. ×105, (Х±m)
Сроки исследования/сутки	Контроль	Гипаконитин	Солкосерил	Облепиховое масло
3	8,08±0,57	13,25±0,88*	11,3±2,42	7,65±0,78
5	0,17±0,11	2,75±0,28*	1,0±0,57	0,19±0,03
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Таблица 6
Число КОЕ-Ф в культуре клеток костного мозга при добавлении стимуляторов регенерации, на 2,5×105 миелокариоцитов, (Х±m)
Контроль	Гипаконитин	Солкосерил	Облепиховое масло
12,25±0,85	17,6±0,33*	13,7±0,64	10,32±0,79
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Литература

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. - М.: OO «Изд-во Новая Волна», 2008. - 1206 с.

2. Котельников В.П. Раны и их лечение. - М.: Знание. 1991. - 123 с.

3. Погодаева Н.Н., Жапова Ц., Верещагин А.Л., Горшков А.Г., Семенов А.А. / Изучение алкалоидного состава некоторых видов сибирских аконитов // Раст. ресурсы, вып.2, 2000 г., с.79-84.

4. Бабаева А.Г. Регенерация: факты и перспективы. - М.: Изд-во РАМН, 2009. - 336 с.

5. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические свойства и перспективы использования. - Томск: ООО «Печатная мануфактура», 2011. - 149 с.

6. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы // Наука в России. - М.: Наука, 2009. - Том. 169. - № 1. - С.4-8.

7. Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н., Нагорняк Ю.Г., Перова А.В., Андреева Т.И., Рослякова Е.П., Суслов Н.И. Механизмы влияния комплексных и выделенных веществ на репаративную активность тканей в эксперименте // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т.72, № 3. - С.40-43.

8. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия: Учебник 3-е изд. М.: Медицина, 2002.

9. Осадчий С.А., Ганбаатар Ж., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Алкалоиды сибирских видов живокости и аконита и их превращения // Материалы Первой Международной конференции "Химия и биологическая активность азотистых гетероциклов и алкалоидов" (том 1) Москва, 9-12 октября 2001 г.

10. Алефиров А.Н. Борец за жизнь. Аконит / А.Н.Алефиров. - СПб.: ИД «Весь», 2002. - 192 с.

11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство "Медицина"», 2005. - 832 с.

12. Микроскопическая техника / Под ред. Д.С.Саркисова. М., 1996.

13. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992.