способ оценки пригодности нативной донорской роговицы для кератотрансплантации

Формула изобретения

Способ оценки пригодности донорской роговицы для пересадки, включающий ПЦР-диагностику инфекционных агентов, отличающийся тем, что дополнительно в ткани донорской роговицы определяют ДНК вирусов группы герпеса ВПГ1, 2, ВЭБ, ВГЧ-6, 7 и при наличии ДНК хотя бы одного вируса оценивают донорскую роговицу, как непригодную для пересадки.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для оценки пригодности донорской роговицы для проведения сквозной кератопластики.

В настоящее время благодаря совершенствованию микрохирургической техники и методик, разработке новых лекарственных препаратов кератопластика стала рядовой операцией. Несмотря на это отдаленные результаты пересадки роговицы остаются по-прежнему неблагоприятными - отторжение кератотрансплантата происходит у 5-70% пациентов (J.C.Hill. High risk corneal grafting. // Br.J.Ophthalmol. - 2002. - Vol.86. - № 9. - P.945).

Одной из кардинальных проблем в пересадке роговицы было и остается получение качественного донорского материала. Огромное значение имела разработанная в 1930-е годы академиком В.П.Филатовым методика консервации донорской трупной роговицы. Работы офтальмологов McCarey и Kaufman позволили создать в 1974 г. среду «МК», которая дала возможность обеспечить надежную консервацию роговицы до 96 часов. В клиниках России при СКП часто применяется так называемый «свежий» неконсервированный донорский материал (до 24 часов после смерти донора), что во многом обусловлено нехваткой банков роговиц, но в то же время «свежий» материал имеет неоспоримое преимущество перед консервированным в виде жизнеспособных клеток эпителия и эндотелия роговицы. Существуют принятые во всем мире противопоказания для использования донорских роговиц (смерть донора от инфекционных заболеваний, злокачественных новообразований, от неизвестной причины и др.). Качество донорского материала определяется с помощью биомикроскопии и роговичной эндотелиальной микроскопии. Для предотвращения трансмиссионного инфицирования реципиента кровь донора проверяют на наличие ВИЧ - инфекции, гепатитов В и С, сифилиса (Борзенок С.А. Медико-технологические и методологические основы эффективной деятельности глазных тканевых банков России в обеспечении операций по сквозной трансплантации роговицы: диссертация (доктора медицинских наук: 14.00.08; Москва, 2008. - 266 с). Данный способ принят за ближайший аналог. Однако сам донорский материал на наличие каких-либо инфекций не исследуют.

Таким образом, известные способы оценки пригодности трансплантата при СКП не учитывают возможной инфицированности донорского материала.

Задачей изобретения является разработка нового подхода в оценке донорского материала для проведения кератопластики.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является отбор пригодного материала для сквозной кератопластики.

Технический результат достигается за счет исследования фрагментов роговицы донора с выявлением ДНК вирусов группы герпеса: ВПГ1, 2, - ВЭБ, ВГЧ6, 7.

Способ осуществляют следующим образом. Из фрагментов нативной донорской роговицы, полученной перед проведением СКП, выделяют ДНК, например, с использованием набора NucleoSpin^® (Macherey-Nagel, Германия). Роговицу лизируют в буфере (200 мкл) с протеиназой К - термостатирование 1,5 часа при 55°С и затем 20 мин при 95°С. Затем центрифугирование 5 мин при 12,5 тыс об/мин. Определение вирусной ДНК в образцах проводят методом гнездовой ПНР.

Показателем эффективности выделения ДНК служат результаты определения человеческого гена GAPDH методом реал-тайм ПЦР, что позволяет контролировать возможное ингибирование реакции, правильность забора клинической пробы, эффективность выделения ДНК на стадии пробоподготовки. Реакцию проводят например, в термоциклере ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия), гнездовую ПЦР на герпесвирусы проводят, в частности, в термоциклере Терцик (ДНК-технология, Россия). Программы первого и второго этапов гнездовой ПЦР одинаковы. В каждой постановке присутствовали контрольные положительные и отрицательные образцы. Анализ продуктов амплификации проводят электрофорезом в 1,5% агарозном геле с EtBr.

Результаты оценивают следующим образом: наличие ДНК вируса группы герпеса (ВПГ1, 2, ВЭБ, ВГЧ6, 7) в роговице донора свидетельствует о непригодности донорского материала для кератопластики.

Ретроспективно нами были исследованы фрагменты донорских роговиц (43 образца). Все доноры были обследованы с помощью ПЦР и серодиагностики на ВИЧ и HBV/HCV (пробы крови) - все отрицательные. Кроме того было проведено определение вирусной ДНК (ВПГ1, 2, ВЭБ, ВГЧ6, 7) в образцах донорских роговиц. Исследование на ЦМВ, проведенное нами ранее, показало отсутствие данного вируса в тканях роговицы. Использовали метод гнездовой ПЦР NucleoSpin ^® Blood L (Macherey-Nagel, Германия). ПЦР - положительными оказались 27,9% донорских роговиц. При этом превалировало выявление изолированных вирусных ДНК. Оценка влияния инфицированности донорского материала на исход кератопластики была проведена при сроках наблюдения реципиентов от 1 до 24 месяцев после СКП. Результаты представлены в таблице № 1.

При оценке исходов кератопластики было отмечено следующее: при отсутствии ДНК вирусов группы герпеса в донорском материале - благоприятный исход СКП (прозрачное приживление трансплантата) наблюдалось в 77,4% случаев (срок наблюдения до 18 месяцев), тогда как при выявлении вирусной ДНК в 91,6% отмечено развитие болезни трансплантата (р=0,02). Сроки появления признаков развития болезни трансплантата от 3 до 6 месяцев. Полученные данные позволяют заключить, что наличие ДНК вирусов группы герпеса (ВПГ1, 2, ВЭБ, ВГЧ6, 7) в донорском материале может провоцировать развитие послеоперационных осложнений при кератопластике (болезнь трансплантата). При этом высокий риск (100%) неблагоприятного исхода СКП не зависит от того, какой именно из названных вирусов группы герпеса присутствовал в пересаженной роговице.

Пример 1. Больной В. 1945 г.р., диагноз - OS - язва роговицы герпетической этиологии; OD - здоров. Соматически здоров. Проведена операция на OS - сквозная субтотальная кератопластика. Донором служил мужчина 45 лет, причина смерти - обширное внутримозговое кровоизлияние. Ретроспективно: ПЦР-исследование выявило наличие ДНК ВПГ1, 2 в донорском материале (роговице). В раннем послеоперационном периоде отмечена замедленная эпителизация трансплантата, через 14 дней развилась эрозия трансплантата, поставлена лечебная МКЛ. Через 1 месяц от момента оперативного вмешательства улучшения нет, произведена трансплантация амниотической мембраны с фиксацией МКЛ, спустя 7 дней положительной динамики не отмечено - добавлена противовирусная терапия (местно). Через два месяца после операции выявлены эпителиопатия, отек, эктазия трансплантата. Исходя из этих наблюдений, можно сказать, что наличие ДНК вируса ВПГ1, 2 в донорской роговице привело к развитию осложнений как в раннем, так и в позднем послеоперационном периоде - развитию болезни трансплантата.

Пример 2. Больной Д. 1968 г.р., диагноз: OS - посттравматическое бельмо роговицы. OD - здоров. Соматически здоров. Проведена операция на OS - тотальная сквозная кератопластика. Донором служил мужчина (51 год), причина смерти - внутримозговое кровоизлияние, цереброваскулярная болезнь. Ретроспективно ПЦР-исследование выявило наличие ДНК ВЭБ в донорском материале (роговице). В послеоперационном периоде через 2,5 месяца после СКП развилась эрозия трансплантата, неоваскуляризация. Эти данные подтвердили наше предположение об отрицательном влиянии инфицированной ВЭБ донорской роговицы на процесс ее приживления.

Пример 3. Больной Д, 1963 г.р., диагноз: OD - ЭЭД роговицы, трофическая язва роговицы; OS - Здоров. Соматически здоров. Проведена операция на OD - субтотальная сквозная кератопластика. Донором явилась женщина 39 лет, причина смерти - автотравма. Ретроспективно ПЦР-исследование выявило наличие ДНК ВГЧ-6 в донорском материале (роговице). В послеоперационном периоде (2 месяца) развилась обширная эрозия трансплантата, выраженный отек лоскута. Приведенный выше пример доказывает причастность наличия ДНК ВГЧ-6 в донорской роговице к развитию болезни трансплантата.

Пример 4. Больной С. 1951 г.р., OD - перфорация язвы роговицы; OS - здоров. Соматически здоров. Проведена операция на OD - субтотальная сквозная кератопластика нативной донорской роговицей. Донором служил мужчина 47 лет, причина смерти - обширный инфаркт миокарда. Ретроспективно ПЦР - исследование удаленного фрагмента роговицы донора выявило наличие ДНК вируса ВГЧ-7. Ранний послеоперационный период проходил без осложнений, однако, через 6 месяцев с момента операции развилась эрозия с последующим помутнением трансплантата. Данный клинический случай подтверждает, что наличие ДНК ВГЧ-7 в донорской роговице способствовал неблагоприятному исходу СКП - болезни трансплантата.

Пример 5. Больной Г., 1949 г.р., диагноз: OD - поствоспалительное бельмо роговицы, OS - поствоспалительное оперированное бельмо роговицы. Операция на OD - субтотальная сквозная кератопластика; донор - мужчина 42 лет, причина смерти - субдуральная гематома, отек мозга. Ретроспективно ПЦР - исследование не выявило наличие ДНК вирусов группы герпеса в донорском материале (роговице). Послеоперационный период без осложнений. Спустя 18 месяцев после кератопластики трансплантат прозрачен, поверхность флюоресцеином не окрашивается. Полученные данные подтверждают, что наиболее благоприятный исход СКП, полное приживление прозрачного трансплантата возможно лишь в случае отсутствия ДНК вирусов группы герпеса в донорской роговице.

Таким образом, полученный способ позволяет оценить пригодность донорского материала (роговицы), основываясь на данных ПЦР-диагностики вирусной ДНК.

Таблица № 1
исходы		ПЦР - исследование донорских роговиц (43) Всего проведено 172 ПЦР
N=43	ПЦР - отр	ПЦР ВПГ1, 2	ВЭБ	ВГЧ-6	ВГЧ-7
	N=31	N=1	N=2	N=5	N=4
	31/43 72%	1/43 2,3%	2/43 4,6%	5/43 11,6%	4/43 9,3%
Благоприятный исход (25/43)	24/31			1/5
N=25	77,4%%	20%
58%
Неблагоприятный исход (всего) (18/43) 41,8%	7	1	2	4	4
7/31	1/1 100%	2/2 100%	4/5 80%	4/4 100%
N=18	22,5%