способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека а431

Формула изобретения

Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431, включающий измельчение, гомогенизацию кожи в растворе хлористого натрия, ценгрифугирование, термоденатурацию сунернатанта при 75-85°С в течение 10-20 мин, охлаждение смеси до 4°С, центрифугирование денатурированного материала при 5000-15000 g в течение 10-30 мин, обработку охлажденным до -20°С или ниже ацетоном в соотношении 1:6-1:8, отмывку выпавшего осадка охлажденным ацетоном, высушивание при комнатной температуре, растворение осадка в 0,005-0,015 М растворе трис-НСl+0,15 М NaCl, pH 6,0-8,0 и центрифугирование, с последующей хроматографией на колонке с сефадексом G-50 и сбором вещества целевого продукта с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливанием и лиофилизацией, отличающийся тем, что при хроматографии на колонке с сефадексом G-50 одновременно с веществом с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да собирают вещество с молекулярной массой более 15000 Да, рехроматографируют вещество с молекулярной массой более 15000 Да на колонке с сефадексом G-50, после рехроматографии собирают два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да и второе - с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, оба вещества обессоливают и лиофилизируют и вещество с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, полученное после рехроматографии, объединяют с веществом с той же молекулярной массой, полученным после первой хроматографии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, биологии, фармакологии, иммунологии, медицинской биотехнологии и фармацевтической промышленности и может найти применение при получении препаратов для лечения заболеваний кожи, а также средств иммунокоррекции.

Известен способ получения иммунотропных веществ из кожи свиньи (1). Вещества, полученные этим способом, влияют как на В-, так и на Т-системы иммунитета. Помимо этого, они ингибируют пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 (2). Однако этот способ сложен. Активность веществ небольшая.

В качестве прототипа взят наиболее близкий к настоящему изобретению способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека (3), путем измельчения кожи, гомогенизации в растворе хлористого натрия, центрифугирования, термоденатурации, центрифугирования, обработки охлажденным ацетоном, высушивания при комнатной температуре, хроматографии на колонке с сефадексом G-50, обессоливания и лиофилизации. Однако применяя этот метод, получают только вещество с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, влияющее на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека и обладающее иммунотропными свойствами (4). Выход вещества небольшой.

Цель изобретения - получение двух активных веществ: одного с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да и другого с молекулрной массой более 15000 Да, с одновременным существенным увеличением выхода вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да и увеличением активности обоих получаемых веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431.

Эта цель достигается тем, что в способ, взятый в качестве прототипа, на последней стадии вводится этап рехроматографии на том же сефадексе. До стадии рехроматографии этапы методов совпадают: кожу свиньи измельчают, гомогенизируют в растворе хлористого натрия, центрифугируют, подвергают термоденатурации при 75-85°С в течение 10-20 мин, центрифугируют при 5000-15000 g в течение 10-30 мин, обрабатывают охлажденным до -20°С (или ниже) ацетоном в соотношении 1:6-1:8, высушивают осадок при комнатной температуре, растворяют в 0,005-0,015 М растворе трис-HCl+0,15 М NaCl, pH 6,0-8,0; хроматографируют на колонке с сефадексом G-50. Далее вводятся следующие этапы: собирают не одно, а два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да и другое с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливают и лиофилизируют. Затем вводится этап рехроматографии: вещество с молекулярной массой более 15000 Да рехроматографируют на колонке с сефадексом G-50 в 0,005-0,015 М растворе трис-HCl+0,15 М NaCl, pH 6,0-8,0, собирают два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да и второе с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливают и лиофилизируют. Вещество с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, полученное после рехроматографии, объединяют с тем же веществом, полученным после первой хроматографии.

Температура термоденатурации (75-85°С) и время термоденатурации подобраны таким образом, что нужное вещество остается в растворе, в то время как часть неактивного материала денатурирует. Центрифугирование при 5000-15000 g течение 10-30 мин подобрано так, что в течение этого времени денатурированные белки удаляются. При центрифугировании ниже 5000 g и менее 10 мин часть денатурированного неактивного материала остается в супернатанте, что загрязняет препарат. Увеличивать скорость центрифугирования более 15000 g и время более 30 мин не имеет смысла, так как при этих условиях денатурированный материал полностью осаждается. Применение ацетона с температурой выше -20°С приводит к денатурации активного материала. Снижение соотношения супернатант:ацетон ниже 1:6 приводит к потере активного вещества. Увеличение соотношения выше 1:8 приводит к выпадению в осадок неактивного материала. Выбор концентрации буфера (0,005-0,015 М) и его рН (6,0-8,0) обусловлен тем, что в нем не происходит потери активности получаемого вещества, в то же время препарат хорошо разделяется по молекулярным массам на сефадексе G-50. Хлористый натрий до концентрации 0,15 М добавляют к буферу для того, чтобы можно было определять активность веществ в пробах сразу после разделения на сефадексе.

Влияние веществ на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 в культуре определяли флуоресцентным методом. Выращивали линию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 на среде DMEM с сывороткой эмбрионов коров и стандартным набором антибиотиков в стандартных условиях (5). Определение количества клеток в процессе культивирования проводили в камере Горяева по стандартной методике с красителем трипановым синим для одновременного подсчета процента жизнеспособных клеток. Аликвоты суспензии клеток разливали в 24-луночный планшет с покровными стеклами по 300 мкл в лунку. Клетки инкубировали в течение 7 часов для полного прикрепления к поверхности стекла. Лиофилизированные вещества растворяли в среде DMEM и добавляли в лунки с клетками до конечной концентрации 100 мкг/мл. В контрольные образцы добавляли аликвоту среды DMEM без веществ. Инкубировали клетки с фракциями в течение 48 часов. Стекла с клетками дважды отмывали PBS и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 16 часов. Окраску осуществляли йодидом пропидия. Съемку образцов проводили на конфокальном флуоресцентном микроскопе Nikon Eclipse E800. Определяли количество клеток в образцах в программе ImageJ. В контроле проанализировано 4 образца, в каждом опыте - по 2 образца. В каждом образце оценено в среднем около 3 тысяч клеток. Рассчитывали среднее значение количества клеток в опытных пробах и контрольных пробах. Результаты выражали как процент выросших клеток по отношению к контролю по формуле

где А - процент выросших клеток по отношению к контролю;

Ко - средняя арифметическая количества клеток в присутствии вещества (опыт);

Кк - средняя арифметическая количества клеток в отсутствии вещества (контроль).

Для вещества с молекулярной массой более 15000 Да рассчитывали процент ингибирования пролиферации по формуле:

Б=100-А

где Б - процент ингибирования пролиферации;

А - процент выросших клеток по отношению к контролю.

В табл.1 представлено сравнение влияния вещества с молекулярной массой более 15000 Да, полученного по прототипу и заявляемому способу, на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431. Как видно из этих данных, вещество с молекулярной массой более 15000 Да, получаемое по прототипу, ингибирует пролиферацию на 39%, в то время как вещество, получаемое по заявляемому способу, ингибирует пролиферацию на 49%.

Таким образом, заявляемый способ позволяет увеличить активность вещества с молекулярной массой более 15000 Да на 10%.

В табл.2 представлены выход и активность вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, полученного по прототипу и заявляемому способу. Как видно из представленных данных, вес вещества, получаемого по прототипу, составляет 18 мг, в то время как вес вещества, получаемого по заявляемому способу, составляет 26 мг, при этом активность вещества увеличилась на 8%.

Таким образом, введение этапа рехроматографии позволило увеличить выход вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да в 1,4 раза, при этом активность вещества увеличилась на 8%. Суммируя результаты, можно сказать, что заявляемый способ позволяет увеличить выход вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да в 1,4 раза и увеличить активность обоих веществ.

Было определено содержание белка по методу Лоури (6) и биуретовым методом (7), углеводов с антроновым реактивом (8) и РНК по методу Шмидта и Таннгаузера (9) в веществе № 1 (В1) с молекулярной массой более 15 кДа и веществе № 2 (В2) с молекулярной массой от 1,4 до 15 кДа, полученных по прототипу и заявляемому способу. Данные представлены в табл.3 и 4.

Как видно из данных, представленных в табл.3, содержание белка, определенного как методом Лоури, так и биуретовым методом, содержание углеводов и РНК в веществе № 1 с молекулярной массой более 15 кДа, полученном как по прототипу, так и по заявляемому способу, достоверно не отличается между собой (Р<0,95 для всех веществ).

Как видно из данных, представленных в табл.4, содержание белка, определяемого как методом Лоури, так и биуретовым методом, содержание углеводов и РНК в веществе № 2 с молекулярной массой от 1,4 до 15 кДа, полученном как по прототипу, так и по заявляемому способу, достоверно не отличается между собой (Р<0,95 для всех веществ).

Вещества анализировались методом вертикального двуступенчатого электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) по Лэммли (10). После проведения электрофореза гель окрашивался красителем Кумасси голубым R-350 на белок. Данные представлены на рис.1 и рис.2.

Как видно из данных, представленных на рис.1, после ДСН-электрофореза в 6-15% ПААГ и окраски на белок в веществе № 1 с молекулярной массой более 15 кДа, полученном как по прототипу (В1П), так и по заявляемому методу (В1З), выявляется один мажорный белок с молекулярной массой 58 кДа и до 8 минорных белков с м.м. от 20 до 200 кДа.

Как видно из данных, представленных на рис.2, после ДСН-электрофореза в 6-20% ПААГ и окраски на белок в веществе № 2 с молекулярной массой от 1,4 до 15 кДа, полученном как по прототипу (В2П), так и по заявляемому методу (В2З), выявляются пять мажорных белков с м.м. 6,9; 8,4; 11; 12 и 61 кДа и до 7 минорных белков с м.м. от 14 до 130 кДа.

Таким образом, можно заключить, что вещества № 1 с молекулярной массой более 15 кДа, полученные как по прототипу, так и по заявляемому способу, не отличаются между собой по содержанию белка, углеводов, РНК и по данным ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле. Однако, как следует из результатов изобретения, вещество № 1, полученное по заявляемому способу, ингибирует пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 на 49%, что на 10% больше по сравнению с прототипом.

Вещества № 2 с молекулярной массой от 1,4 до 15 кДа, полученные как по прототипу, так и по заявляемому способу, также не отличаются между собой по содержанию белка, углеводов, РНК и по данным ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле. Однако, как следует из результатов изобретения, под действием вещества № 2, полученного по заявляемому способу, процент выросших клеток составляет 178%, что на 8% больше по сравнению с прототипом. Кроме того, выход вещества № 2 составляет 26 мг. Это в 1,4 раза больше по сравнению с прототипом.

Пример 1 (прототип)

Кожу свиньи измельчают ножницами и гомогенизируют в 0,14 М растворе NaCl pH 7,0 при 4°С (1094 Homogenizer, Tecator, Sweden). На 120 г кожи берут 720 мл 0,14 М раствора NaCl (соотношение вес кожи:объем раствора - 1:6). Гомогенат центрифугируют при 2500g в течение 30 мин при 4°С (центрифуга J-6M/E, ротор 4.2, Beckman, Великобритания). Осадок отбрасывают, а супернатант в объеме 710 мл подвергают термоденатурации при 75°С в течение 20 мин на водяной бане при постоянном перемешивании, смесь охлаждают до 4°С. Денатурированный материал осаждают центрифугированием при 10000g в течение 20 мин при +4°С (центрифуга J2-21М, ротор JA-14, Beckman, США), а супернатант в объме 700 мл прикапывают к ацетону, охлажденному до -20°С. Выпавший осадок отмывают ацетоном путем центрифугирования при 2500g в течение 15 мин при 4°С и высушивают под тягой при комнатной температуре. В результате получают 300 мг порошка (300±30 мг), который растворяют в 30 мл 0,01 М раствора трис-HCl буфера + 0,15 М NaCl рН 8,0 при комнатной температуре. Нерастворимую часть удаляют центрифугированием при 4000g в течение 30 мин при 4°С, а супернатант наносят на колонку 2,5×80 см с Сефадексом G-50, уравновешенную тем же буфером. Собирают два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да, а другое с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливают и лиофилизируют.

Вещество с молекулярной массой более 15000 Да ингибирует пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 на 39% (табл.1). Выход вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да составляет 18 мг, процент выросших клеток составляет 170% (табл.2).

Пример 2 (по предлагаемому методу)

Кожу свиньи измельчают ножницами и и гомогенизируют в 0,14 М растворе NaCl рН 7,0 при 4°С (1094 Homogenizer, Tecator, Sweden). На 120 г кожи берут 720 мл 0,14 М раствора NaCl (соотношение вес кожи:объем раствора - 1:6). Гомогенат центрифугируют при 2500g в течение 30 мин при 4°С (центрифуга J-6M/E, ротор 4.2, Beckman, Великобритания). Осадок отбрасывают, а супернатант в объеме 710 мл подвергают термоденатурации при 75°С в течение 20 мин на водяной бане при постоянном перемешивании, смесь охлаждают до 4°С. Денатурированный материал осаждают центрифугированием при 10000g в течение 20 мин при +4°С (центрифуга J2-21М, ротор JA-14, Beckman, США), а супернатант в объеме 700 мл прикапывают к ацетону, охлажденному до -20°С. Выпавший осадок отмывают ацетоном путем центрифугирования при 2500g в течение 15 мин при 4°С и высушивают под тягой при комнатной температуре. В результате получают 300 мг порошка (300±30 мг), который растворяют в 30 мл 0,01 М раствора трис-HCl буфера +0,15 М NaCl pH 8,0 при комнатной температуре. Нерастворимую часть удаляют центрифугированием при 4000g в течение 30 мин при 4°С, а супернатант наносят на колонку 2,5×80 см с Сефадексом G-50, уравновешенную тем же буфером. Собирают два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да, а другое с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливают и лиофилизируют.

Затем вещество с молекулярной массой более 15000 Да растворяют в 30 мл 0,01 М раствора трис-HCl буфера +0,15 М NaCl pH 8,0 при комнатной температуре и наносят на колонку 2,5×80 см с Сефадексом G-50, уравновешенную тем же буфером. Собирают два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да, а другое с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливают и лиофилизируют. Вещество с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да объединяют с веществом с той же молекулярной массой, полученным после первой хроматографии.

Вещество с молекулярной массой более 15000 Да ингибирует пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 на 49%. Это на 10% больше по сравнению с прототипом (табл.1). Выход вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да составляет 26 мг. Это в 1,4 раза больше по сравнению с прототипом. Процент выросших клеток составляет 178%, это на 8% больше по сравнению с прототипом (табл.2).

Таблица 1
Влияние вещества с молекулярной массой более 15000 Да на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431
	% выросших клеток (М±m)	% ингибирования пролиферации
Прототип	61±5,1	39
Заявляемый метод	51±4,2	49
М - средняя арифметическая; m - стандартная ошибка средней арифметической

Таблица 2
Выход вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да и его влияние на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431
	Вес вещества в мг (М±m)	% выросших клеток (M±m)
Прототип	18±4,2	170±4,2
Заявляемый метод	26±7,4	178±5,5
M - средняя арифметическая; m - стандартная ошибка средней арифметической

Таблица 3
Процентное содержание белка, углеводов и РНК в веществе № 1 (В1) с молекулярной массой более 15 кДа, полученном по прототипу и заявляемому способу (М±m)
	% (М±m)
Прототип	Заявляемый способ
Белок (метод Лоури)	91±2,9	93±4,1
Белок (биуретовый метод)	87±7,3	89±6,8
Углеводы	0,74±0,30	0,81±0,42
РНК	2,0±0,4	2,2±0,5
М - средняя арифметическая; m - стандартная ошибка средней арифметической

Таблица 4
Процентное содержание белка, углеводов и РНК в веществе № 2 (В2) с молекулярной массой от 1,4 до 15 кДа, полученном по прототипу и заявляемому способу (М±m)
	% (М±m)
Прототип	Заявляемый способ
Белок (метод Лоури)	51±3,2	53±5,3
Белок (биуретовый метод)	56±6,0	55±7,2
Углеводы	8,0±1,4	8,3±1,7
РНК	5,4±1,0	5,1±1,8
М - средняя арифметическая; m - стандартная ошибка средней арифметической

Литература

1. Белова О.В., Арион В.Я., Зимина И.В., Сысоева О.Б., Луканидина Т.А. Способ получения иммунотропных веществ из кожи свиньи. Патент № 2203070. Зарегистрирован 27.04.2003 г. БИ № 12, 2003.

2. Белова О.В., Арион В.Я., Орлова В.Ф., Лопухин Ю.М., Капитанов А.Б., Короткова М.Н., Бондарева Е.В. Иммунотропные препараты из кожи влияют на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы А431. Иммунопатология аллергол. инфектол. 2003, № 1, с.28-32.

3. Арион В.Я., Белова О.В., Орлова В.Ф., Капитанов А.Б., Лопухин Ю.М. Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека. Патент № 2038087. Зарегистрирован 27.06.1995. БИ № 18. С.24, 1995.

4. Арион В.Я., Белова О.В., Луканидина Т.А., Сысоева О.Б.,. Дворцова В.В., Бреусов Ю.Н. Иммунологические свойства препаратов из кожи. // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2000. - Т.129. - № 2. - С.194-197.

5. Beretta GL, Gatti L, Tinelli S, Corna E, Colangelo D, Zunino F, Perego P. Cellular pharmacology of cisplatin in relation to the expression of human copper transporter CTR1 in different pairs of cisplatin-sensitive and -resistant cells. Biochem Pharmacol. 2004 Jul 15; 68(2):283-91.

6. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951. - Vol.193. - P.265-275.

7. Gornall A.C., Bardawill C.J., David M.M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J. Biol. Chem. - 1949. - Vol.177. - P.751-766.

8. Seifter S. A method for the detection of carbo-hydrates by the anthrone reagent. Arch. Biochem. 1950. - Vol.25. - P.191-193.

9. Schmidt G., Tannhauser S.J. A method for the detection of desoxyribonucleic acid, ribonucleic acid and phosphoproteins in animal tissues. J. Biol. Chem. 1945. - Vol.161. - P.83-89.

10. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; Vol.227: 680-5.