антимикробное, противовоспалительное и анальгезирующее средство на основе n-4-нитрофенилбензамидина

Формула изобретения

Антимикробное, противовоспалительное и анальгезирующее средство, включающее N-4-нитрофенилбензамидин в качестве активного вещества.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и фармации и касается нового антимикробного, противовоспалительного и анальгезирующего средства на основе производного бензамидина, а именно N-4-нитрофенилбензамидина (C₁₃H₁₁N₃O₂) формулы I:

N-Замещенные бензамидины, среди которых N-4-нитрофенилбензамидин, известны [Masa-aki Kakimoto, Shin-ichi Ogata, Yo-shio Imai // Chemistry Letters. 1984. P.821-824; Panayiotis A.Koutentis, Styliana I.Mirallai // Tetrahedron. 2010. V.66. P.5134-5139; Куваева, Е.В. Амидины. Синтез и строение / Е.В.Куваева, Е.В.Федорова, А.Г.Козьмина, И.П.Яковлев, Ю.В.Клейменова, О.В.Морозова // V deký pokrok na rozmezi tisícileti. - 2010: Materialy VI mezinárodni v deko-praktická conference 27.05.2010-05.06.2010. Praha, 2010. Dil 22. P.66-67].

Вместе с тем токсичность и биологическая активность N-4-нитрофенилбензамидина не изучены, что не позволяет говорить о возможности получения лекарственного средства на его основе.

Известно, что амидины являются биологически активными компонентами средств различного предназначения (ингибиторов фактора свертывания крови, противораковых). Амидиновый фрагмент (обычно в составе гетероцикла) входит в структуру многих лекарственных препаратов, например нафтизина, галазолина, фентоламина, хлордиазепоксида. Анализ литературных источников не позволяет выявить корреляцию между биологическими свойствами и строением молекулы замещенного амидина.

Известна антимикробная активность производных бензамидина общей формулы II:

,

где А - представляет собой линейную или разветвленную алкильную цепь, содержащую от 3 до 9 атомов углерода, а Х - атом кислорода или прямую связь [пат. СССР 1319784, МПК 123/00. Способ получения фармацевтически приемлемых солей производных бензамидина, приор. Dem. 2550192 FR; см. также Pat. 4,720,581 US. Benzamidine derivatives].

Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) солей этих производных бензамидина в отношении Escherichia coli высока и составляет от 4000-16000 мкг/мл, а в отношении Staphylococcus aureus 2000-20000 мкг/мл.

Известна антимикробная активность п-метилсульфонилбензамидина гидрохлорида и п-гуанилметилсульфонилбензамидина гидрохлорида, однако в описании к патенту не приведены значения минимальной ингибирующей концентрации данных соединений [pat. GB 580,884. Improvements in and relating to therapeutically active compounds of the amidine type].

Наиболее близкими по структуре и фармакологическим свойствам к заявляемому средству являются N-галогенамидины общей формулы III (прототип)

,

где Х=Cl (а); I (б),

обладающие антимикробной активностью в отношении Escherichia coli (IIIa - 250-500 мкг/мл; IIIб - 1000-2000 мкг/мл) и Staphylococcus aureus (IIIa - 250 мкг/мл; IIIб - 1000 мкг/мл) [pat. EP 0076430. Compositions having antimicrobial activity].

К недостаткам соединений II, III относится низкая антимикробная активность.

Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала антимикробных, противовоспалительных и анальгезирующих средств, поиск нового, на основе бензамидина, средства, имеющего низкую токсичность, обладающего антимикробной активностью и дополнительно проявляющего противовоспалительные и анальгезирующие свойства, сравнимые с имеющимися у раздельно применяющихся в медицинской практике препаратов, а также значительно более выраженную антимикробную активность, чем у наиболее близкого аналога (прототипа).

Указанная задача достигается созданием антимикробного, противовоспалительного и анальгезирующего средства на основе N-4-нитрофенилбензамидина.

Изобретение иллюстрируется примерами синтеза и исследования фармакологических свойств.

Пример 1. Методика синтеза N-4-нитрофенилбензамидина

К смеси 46,92 г (0,34 моль) 4-нитроанилина и 34,8 мл (0,34 моль) бензонитрила при перемешивании порциями по мере достижения однородности смеси добавляют 45,39 г (0,34 моль) безводного алюминия хлорида. Смесь быстро нагревают до 180°C и в расплавленном состоянии медленно выливают в 800 мл 1,2%-ного раствора HCl. Общее время процесса составляет не более 30 минут. Далее добавляют 10,0 г активированного угля, полученную суспензию отфильтровывают через фильтр Кизельгура. Фильтрат приливают к 600 мл 15,5%-ного раствора NaOH. Выпавший осадок отфильтровывают и сушат. Полученный продукт не нуждается в дополнительной очистке.

Продукт красно-коричневого цвета, выход 36,3 г, 67% от теоретического из расчета на бензонитрил. Температура плавления 165-167°C. Хроматографическая однородность целевого продукта подтверждалась посредством хроматографирования раствора его в ДМСО в системе этилацетат-гексан 7:4 (R_f =0,81). Состав синтезированного соединения подтвержден элементным анализом. Брутто-формула: C₁₃H₁₁N₃ O₂. Найдено, %: С - 63,77; Н - 4,42%; N - 17,29%; О - 14,52%. Вычислено, %: С - 63,67%; Н - 4,45%; N - 17,19%; О - 14,69%.

Строение синтезированного вещества было доказано физико-химическими методами идентификации органических соединений: ЯМР ¹Н и ¹³С, УФ-, ИК-спектроскопией, масс-спектрометрией, а также двумерным спектром ¹⁵ N-HSQC.

В ИК-спектрах вещества (таблетки KBr) наиболее характеристичными являются области 1620-1610 см ^-1 и 3500-3410 см^-1, где наблюдаются полосы поглощения, соответствующие валентным колебаниям для C=N-связи и NH₂-группы соответственно.

УФ-спектр N-4-нитрофенилбензамидина в 96%-ном этаноле имеет 3 максимума поглощения в области длин волн 207,6; 227,6 и 333,6 нм.

Спектр ЯМР ¹Н полученного соединения в ДМСО-d ₆ характеризуется наличием резонансных сигналов протонов ароматических колец ( 6,76-8,14 м.д. (м, 9Н)), а также уширенного сигнала в области 6,4 м.д. (с, 2Н) NH₂-группы.

Спектр ЯМР ¹³С этого соединения характеризуется сигналами ядер углеродных колец ( 124,5-150,9 м.д.) и сигналом углерода группы -C=N(-N) ( 155,45 м.д.).

Строение полученного вещества подтверждено с помощью масс-спектрометрии. Расчетная молекулярная масса полностью совпала с экспериментально полученной (M ⁺=245).

Структура N-4-нитрофенилбензамидина (соединения I) убедительно доказана с помощью двумерной корреляционной спектроскопии ¹⁵N-HSQC. В спектре виден всего один корреляционный пик между сигналом атома азота ¹⁵N и сигналом связанных с этим атомов протонов в соответствующем спектре ЯМР.

Пример 2. Определение острой токсичности

Острую токсичность синтезированного соединения определяли на нелинейных белых мышах-самцах массой тела 18-20 г. Животных распределяли на равные по численности и массе тела группы по 10 животных в каждой. Суспензии соединения в воде, стабилизированные твином-80, вводили однократно внутрибрюшинно в интервале доз 50 мг/кг-3160 мг/кг. Выживаемость животных определяли, наблюдая через 24 часа и через 48 часов от момента введения исследуемого соединения. Наблюдение за животными осуществляли в течение 72 часов. Регистрировали развитие основных симптомов и время гибели животных.

Расчет среднесмертельной дозы (LD ₅₀) проводили с помощью экспресс-метода В.Б.Прозоровского [Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.И. // Фармакология и токсикология. 1978. № 4. С.497-502] и пробит-анализа по методу Миллера-Тейнтера [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта, 2-е изд., доп. и перераб. Л.: Медгиз, 1963]. Токсичность заявляемой субстанции составляет 2642 мг/кг. Согласно классификации токсичности препаратов соединение 1 относится к классу практически нетоксичных веществ [Измеров И.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов. М.: Медицина, 1977. С.196-197]. Оно более чем в 30 раз менее токсично диклофенака - препарата сравнения по противовоспалительной активности.

Пример 3. Определение антимикробной активности

Минимальные ингибирующие концентрации определяли методом серийных разведений в жидкой питательной среде - мясопептонном бульоне (МПБ) с последующим высевом на агаризованные среды. Исследуемое соединение не растворяется в воде, поэтому в качестве растворителя использовали 20%-ный водный раствор ДМСО, не подавляющий рост ни одной из использованных тест-культур в концентрациях более 1000 мкг/мл. В качестве тест-микроорганизмов были выбраны грамположительные бактерии Staphylococcus aureus штамм Р 209 и грамотрицательные бактерии Escherichia coli ATCC 25922. Штаммы тест-организмов были выбраны в соответствии с рекомендациями ГФ XI [Государственная фармакопея СССР: В 2 вып. Вып.2. М.: Медицина, 1989. С.194]. Микробная нагрузка составляла 1000 клеток/мл. Для достижения соответствующей концентрации микробных клеток готовили суспензию микроорганизмов в физиологическом растворе в соответствии со стандартом мутности 10 ЕД (1 млрд клеток/мл), затем через ряд последовательных разведений получали конечную концентрацию микробных клеток.

В ряд пробирок наливали по 1 мл МПБ для бактерий. В первую пробирку вносили 1 мл раствора исследуемого соединения и проводили последовательные разведения в ряду пробирок (перенося по 1 мл из предыдущей в последующую), после чего в каждую пробирку ряда вносили по 0,1 мл микробной взвеси (104 клеток/мл), пробирки культивировали при 37°C 24 часа.

Из пробирки, где не наблюдали роста культуры (помутнения среды), делали высев в чашки Петри на мясопептонный агар (МПА) для стафилококка и кишечной палочки.

Чашки культивировали при 37°C 24 часа.

Минимальные ингибирующие концентрации N-4-нитрофенилбензамидина для Е. coli и St. aureus составляют по 0,049 мкг/мл, что находится на уровне или ниже широко используемых на практике антибиотиков (аминогликозиды 0,2-3,2 мкг/мл (Е. coli) и 0,1-1,6 мкг/мл (St. aureus)) и фторхинолонов (0,016-0,5 мкг/мл (Е. coli) и 0,06-0,52 мкг/мл (St. aureus)) и значительно ниже, чем у прототипа (250-2000 мкг/мл). Кроме того, препараты серии фторхинолонов последнего поколения малодоступны по цене.

Пример 4. Определение противовоспалительной активности

Противовоспалительную активность исследовали на скрининговой модели - формалиновый отек лапы у крыс.

В опыте использовали белых беспородных крыс-самцов массой 200-240 г в количестве 30 штук. Из них были сформированы 3 группы по 10 особей в каждой. Особям контрольной группы вводили только флогогенный агент. Животные опытной группы получали исследуемый препарат и препарат сравнения, которые вводили внутрибрюшинно за 1 час до создания отека.

Водный 2%-ный раствор формалина вводили субплантарно в количестве 0,1 мл каждому животному.

Исследуемый нативный раствор N-4-нитрофенилбензамидина вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг. Препарат сравнения - диклофенак - вводили в дозе 25 мг/кг.

На каждом животном исполнялись экспериментальные процедуры в следующей последовательности:

- внутрибрюшинное введение исследуемого образца: в остром опыте однократно за 1 час до введения флогогенного вещества;

- измерение объема стопы правой задней лапы животного (исходные данные);

- субплантарное введение формалина (0,1 мл 2%-ного раствора) в правую заднюю лапу животного через один час после последнего введения исследуемого образца;

- измерение объема стопы правой задней лапы крысы через определенные промежутки времени после введения флогогенного агента (1 и 24 часа).

Измерение объема лапы проводили при помощи стеклянного онкометра по объему вытесненной воды после погружения лапы в специальный резервуар.

Полученные от каждого животного результаты усредняли в пределах группы и рассчитывали процент угнетения воспаления в опытной группе относительно контрольной. Результаты измерений объема лапы крысы сведены в таблицу 1.

Внутрибрюшинное однократное превентивное введение N-4-нитрофенилбензамидина способствует сдерживанию развития воспалительной реакции спустя сутки на 64,8%, что находится на уровне широко используемого на практике диклофенака при значительно меньшей токсичности заявляемого средства.

Пример 5. Определение анальгезирующей активности N-4-нитрофенилбензамидина

Для экспериментальной оценки анальгезирующей активности N-4-нитрофенилбензамидина использовали модель генерации уксуснокислых «корчей» у мышей-самцов. Судороги у животных вызывали при помощи внутрибрюшинного введения 3%-ного раствора уксусной кислоты. Эксперимент проводили на белых нелинейных мышах-самцах массой тела 15-22 г по 10 в группе. Суспензию исследуемого соединения внодили внутрибрюшинно и через 40 минут внутрибрюшинно вводили 0,2 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты, наблюдали за животными 20 минут. В ходе эксперимента регистрировали время начала судорог и количество судорог за временной интервал. Препаратом сравнения являлся метамизол натрия (100 мг/кг). Результаты испытаний приведены в таблице 2.

Однократное внутрибрюшинное введение N-4-нитрофенилбензамидина снижает проявление судорог на 64,9% в сравнении с контролем при том, что снижение числа судорог на 50% считается хорошим результатом.

Таким образом, заявляемое средство является малотоксичным, проявляет значительно большую антимикробную активность, чем прототип, и сравнимо по эффективности с используемыми на практике взятыми отдельно противомикробными, противовоспалительными или анальгезирующими препаратами.

N-4-нитрофенилбензамидин может быть использован для синтеза новых биологически активных соединений и в медицине в качестве активного компонента антимикробного, противовоспалительного и анальгезирующего средства в эффективной дозе.

Таблица 1
Оценка противовоспалительной активности N-4-нитрофенилбензамидина
Соединение	До введения флогогенного агента	Через 1 час	Через 24 часа
	1,4	1,9	1,9
	1,4	1,6	1,4
	1,0	1,5	1,6
	1,6	1,8	1,7
	1,3	1,6	1,5
Диклофенак	1,4	1,8	1,4
	1,5	1,6	1,6
	1,4	1,7	1,8
	1,3	1,7	1,5
	1,5	1,6	1,6
	Ср. 1,38	Ср. 1,68	Ср. 1,6
	1,3	1,6	1,4
	1,2	1,6	1,6
	1,1	1,3	1,2
	1,5	1,7	1,7
N-4-Нитрофенилбензамидин	1,1	1,6	1,4
1,2	1,6	1,5
	1,1	1,5	1,4
	1,1	1,3	1,4
	1,4	1,6	1,5
	1,4	1,8	1,5
	Ср. 1,24	Ср. 1,56	Ср. 1,46

Таблица 2
Оценка анальгезирующей активности N-4-нитрофенилбензамидина
Соединение	Доза (мг/кг)	Время начала судорог, мин	Число судорог, наблюдаемых в течение 20 мин	% числа судорог к контролю	Эффективность, %
Контроль	-	3,9	37	100	-
Метамизол
натрия	100	7,55	5	13,5	86,5
N-4-нитрофенилбензамидин
264	7,8	13	35,1	64,9