комбинированный криопротекторный раствор для замораживания тромбоцитов

Формула изобретения

Комбинированный криопротекторный раствор для замораживания тромбоцитов при низкой (-80°C) температуре, включающий гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину, лимонную кислоту и воду для инъекций, отличающийся тем, что дополнительно содержит диметилацетамид при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина	1,0
диметилацетамид	1,25
лимонная кислота	0,1
вода для инъекций	остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к консервированию клеток крови замораживанием. Комбинированный криопротекторный раствор для замораживания тромбоцитов имеет следующий состав (мас.%):

гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина	1,0
диметилацетамид	1,25
лимонная кислота	0,1
вода для инъекций	до 100 мл
pH	5,5-6,4

Экспериментальные исследования выполнены в лаборатории консервирования крови и тканей Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства».

В качестве прототипа нами была использована работа Е.П.Сведенцова и соавторов «Водный раствор для консервирования тромбоцитов» (1). Существенным недостатком прототипа является наличие в составе хладоограждающего раствора токсичного антиагреганта ЭДТА Na ₂. В предлагаемом криозащитном растворе устранен отмеченный недостаток (исключен ЭДТА Na₂). Оптимальный pH среды для тромбоцитов получают при производстве протектора 1,1-1,6-гексаметилен-3,3,3'3'-тетракис(2-оксиэтил)-бисмочевины согласно новому способу (2), когда в реакционную смесь после синтеза добавляют катионообменную смолу К2 и смесь и выпаривают для снижения pH до 5,6-5,8, получают в растворе чистый протектор с заданной кислотностью среды.

Таким образом, предлагаемый комбинированный криопротекторный раствор для замораживания тромбоцитов содержит следующие ингредиенты, мас.%:

1) гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина (сокращенно ГМБТОЭМ), имеющая наименьшую токсичность из всех современных криопротекторов - ее ЛД₅₀ составляет 15,5±0,6 г/кг массы мыши (Сведенцов Е.П. и соавт., (3)). ГМБТОЭМ является криопротектором преимущественно экзоцеллюлярного действия;

2) криозащитное вещество - диметилацетамид (сокращенно ДМАЦ), является эндоцеллюлярным криопротектором;

3) лимонная кислота

4) вода для инъекций.

Все ингредиенты, входящие в криопротекторный раствор, производят в РФ.

Пример

Пример использования: предложенный раствор, содержащий комбинацию криопротекторов ГМБТОЭМ в концентрации 1% и ДМАЦ - 1,25%, лимонную кислоту - 0,1%; воду для инъекций до 100 мл, имеющий pH 5,5-6,4, смешивают с концентратом тромбоцитов в количественном соотношении 1:1 в полимерном контейнере «Компопласт 300». Перемешивают смесь и выдерживают при комнатной температуре 20 минут.

Замораживают смесь тромбоцитов с раствором комбинированного криопротектора в электроморозильнике на -40°C в 4-х литровой ванне с 96° этиловым спиртом, охлажденным до -28°C, выдерживают в нем 15 минут. После этого «Компопласт» с тромбоцитами переносят в электрический холодильник на -80°C для дальнейшего замораживания и хранения.

Изучено 3 варианта комбинированного криопротекторного раствора для замораживания тромбоцитов, различающихся по концентрации входящих в него ингредиентов. Состав растворов представлен в таблице 1.

Таблица 1
Состав комбинированного криопротекторного раствора для замораживания тромбоцитов
Номер комбинированного криопротекторного раствора	Состав комбинированных криопротекторных растворов
ГМБТОЭМ, %	ДМАЦ, %	Лимонная кислота, %	Вода для инъекций, мл
1	2	2,5	0,25	до 100
2	1	1,25	0,1	до 100
3	1	0,6	0,1	до 100

При смешивании указанных растворов с тромбоцитами донорской крови в соотношении 1:1 конечная концентрация веществ (табл.1), входящих в состав 1, 2, 3 растворов, уменьшалась в 2 раза по сравнению с исходной, pH же среды оставалась в пределах 5,4-6,5, являющейся оптимальной для тромбоцитов.

Размораживание производили через 1-21 сутки в 20-литровой водяной ванне при +38°C в течение 40-45 с при активном покачивании контейнера. Отогревали до +2°C.

Определяли морфологическую сохранность размороженных тромбоцитов (подсчет количества клеток в камере Горяева), их функциональную активность (адгезия к стеклу, индуцированная агрегация, реакция на гипотонический шок) (таблица 2). Данные указываются в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.

Таблица 2
Сохранность морфологических и функциональных показателей тромбоцитов, размороженных после криоконсервирования при -80°C с различными комбинированными криопротекторными растворами (в % к аналогичным показателям нативных тромбоцитов)
Номер комбинированного криопротекторного раствора	Состав раствора	Количество тромбоцитов	адгезия	АДФ	адреналин	РГШ
1	2% ГМБТОЭМ + 2,5% ДМАЦ	86,6±9,8 (n=6)	63,6±13,3 (n=3)	53,8±19,1 (n=7)	32,6±14,2 (n=4)	88,1±7,0 (n=4)
2	1% ГМБТОЭМ + 1,25% ДМАЦ	93,0±5,4 (n=6)	63,5±6,1 (n=3)	67,3±10,9 (n=5)	77,8±8,9 (n=6)	84,5±6,4 (n=3)
3	1% ГМБТОЭМ + 0,6% ДМАЦ	79,2±2,5 (n=4)	30,1±5,1 (n=4)	2,5±1,0 (n=4)	6,8±1,9 (n=4)	50,2±6,4 (n=4)

Получены положительные результаты после замораживания - отогрева тромбоцитов, особенно с растворами № 2 и № 1. Обращает внимание большое количество морфологически сохранных клеток (93,0% и 86,6%) и выраженная функциональная полноценность тромбоцитов, размороженных после криоконсервирования с комбинированными криопротекторными растворами № 2 и № 1 (адгезия к стеклу, соответственно 63,5%, 63,6%, индуцированная агрегация с АДФ 67,3% и 53,8%, а также с адреналином 77,8% и 32,6%).

Растворы № 1 и № 2 обеспечили высокие показатели реакции на гипотонический шок (соответственно 84,5±6,4% и 88,1±7,0%, статистически не различаются) у размороженных тромбоцитов, являющиеся ведущим тестом у них перед введением в сосудистое русло.

Учитывая, что химическая нагрузка на организм при использовании комбинированного криопротекторного раствора № 1 будет в 2 раза (когда используется криопротектор ГМБТОЭМ) и в 2,5 раза (когда используется ДМАЦ) больше, чем при применении комбинированного раствора № 2, то предпочтение следует отдать данному хладоограждающему раствору.

Исследование его на острую токсичность по методике ГФ XII выявило его 100% переносимость и отсутствие побочных реакций.

Разработанный нами комбинированный криопротекторный раствор ( № 2) прозрачен, без запаха, имеет pH 5,5-6,4. Он легко смешивается с концентратом тромбоцитов, обеспечивает морфологическую и функциональную сохранность при положительной температуре и высокий процент физиологически полноценных тромбоцитов после замораживания до -80°C и оттаивания. Положительные свойства разработанного криопротекторного раствора дают возможность применять его для консервирования замораживанием тромбоцитов при -80°C в лечебных учреждениях и учреждениях службы крови, располагающих указанным холодильным оборудованием.

Литература

1. Сведенцов Е.П., Селезнева О.М., Симкин Д.С, Новосадов В.М. Водный раствор для консервирования тромбоцитов. Патент № 1561227 (Роспатент). Регистр 12.04.93.

2. Баскин З.Л., Мурин А.В., Новикова М.Д., Торопов А.Н., Шабалин Д.А., Сведенцов Е.П. Способ получения 1,1-1,6-гексаметилен-3,3,3',3'-тетракис(2-оксиэтил)-бисмочевины. Патент № 2376284 от 31.03.2008. Бюл. № 35. Опубл. 20.12.2009.

3. Сведенцов Е.П. Получение и криоконсервирование костного мозга для клинического применения. Автореферат дисс. доктора медицинских наук, Ленинград. 1987, 45 (20) (гриф ДСП отменен в 2009 г).