олигонуклеотидные праймеры для генотипирования b. mallei методом полимеразной цепной реакции

Классы МПК:C12P19/30 нуклеотиды
C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты
C12N1/20 бактерии; питательные среды для них
C12R1/01 бактерии или актиномицеты
Автор(ы):, , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-01-26
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei. Предложенные праймеры комплементарны дифференцирующему фрагменту ВМА10247-А1008 генома возбудителя сапа, обладают активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации и имеют следующую структуру:

5'-CGAACCCACACGAGCCTA-3'-BmVAT9-Ch2s

5'-GCGAAGATTCCGAAGATGC-3'-BmVAT9-Ch2as.

Представленное изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для детекции дифференцирующего фрагмента ДНК ВМА 10247_А1008 возбудителя сапа. 3 ил., 3 пр.

олигонуклеотидные праймеры для генотипирования b. mallei методом   полимеразной цепной реакции, патент № 2474617 олигонуклеотидные праймеры для генотипирования b. mallei методом   полимеразной цепной реакции, патент № 2474617 олигонуклеотидные праймеры для генотипирования b. mallei методом   полимеразной цепной реакции, патент № 2474617

Формула изобретения

Олигонуклеотидные праймеры для генотипирования В. mallei методом полимеразной цепной реакции, обладающие активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющие следующую структуру:

5'-CGAACCCACACGAGCCTA-3'-BmVAT9-Ch2s

5'-GCGAAGATTCCGAAGATGC-3'-BmVAT9-Ch2as

комплементарные дифференцирующему фрагменту генома возбудителя сапа ВМА10247-А1008.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярной эпидемиологии и может быть использовано в медицине для обнаружения дифференцирующего фрагмента ДИК ВМА10247_А1008 в составе схемы генотипирования возбудителя сапа Burkholderia mallei как для практического здравоохранения, службы Роспотребнадзора, так и для научных исследований.

Возбудитель сапа (Burkholderia mallei) - аэробная грамотрицательная неферментирующая бактерия, принадлежащая к роду Burkholderia и относящаяся к потенциальным агентам биотерроризма группы В. Сап - особо опасная зоонозная инфекция. Необходимость исследований, направленных на генотипирование штаммов В.mallei, связана с сохранением угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций, обусловленных возникновением техногенных катастроф, природных катаклизмов и возможных террористических актов с использованием этого возбудителя.

Генотипирование - комплексный анализ уникального для каждого живого организма генотипа на основе изучения его ДНК. Метод генотипирования на основе анализа вариабельных ампликонов (VAT - variable amplicon typing) заключается в серии полимеразных цепных реакций с праймерами, фланкирующими фрагменты уникальных ДНК-мишеней, существующих только у определенных штаммов, что позволяет проводить внутривидовую дифференциацию.

Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления целевых участков ДНК. В основе метода ПНР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных штаммов определенного вида микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генотипирования возбудителя сапа.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для определенных штаммов возбудителя сапа. Праймеры комплиментарны последовательностям ДНК на левой и правой границах дифференцирующего фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микроорганизмов.

Наиболее близким аналогом является схема генотипирования с использованием амплификации дифференцирующих фрагментов для возбудителя мелиоидоза, предложенная Kwanjit Duangsonk с соавторами в 2006 г. [Use of a Variable Amplicon Typing Scheme Reveals Considerable Variation in the Accessory Genomes of Isolates of Burkholderia pseudomallei, Kwanjit Duangsonk, Daniel Gal, Mark Mayo, C. Anthony Hart, Bart J. Currie, and Craig Winstanley]. Для возбудителя сапа подобных исследований ранее не проводилось.

Целью настоящего изобретения является получение олигонуклеотидных праймеров для идентификации дифференцирующего фрагмента генома ВМА10247_А1008 В.mallei методом полимеразной цепной реакции.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для идентификации вариабельного фрагмента ДНК штаммов возбудителя сапа, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:

5'-CGAACCCACACGAGCCTA-3'-BmVAT9-Ch2s

5'-GCGAAGATTCCGAAGATGC-3'-BmVAT9-Ch2as

Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), были подобраны праймеры, обозначенные BMVAT9-CH2S/BMVAT9-CH2AS, комплементарные дифференцирующему фрагменту ВМА10247_А1008 для внутривидового типирования В.mallei. Расчетная длина специфического фрагмента составляет 472 п.н.

Апробация праймеров и зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителя сапа коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для обнаружения дифференцирующего фрагмента ВМА10247_А1008 ДНК возбудителя сапа методом ПЦР.

На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей четырех штаммов возбудителя сапа, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ), для конструирования праймеров был выбран фрагмент вариабельной последовательности ВМА10247_А1008, обнаруженной in silico на второй хромосоме штаммов В.mallei NCTC 10247 и В.mallei NCTC 10229. В составе генома штамма В.mallei SAVP1 и В.mallei АТСС 23344 данного фрагмента обнаружено не было. Данный факт позволил рассматривать участок последовательности ВМА10247_А1008 в качестве дифференцирующего фрагмента, пригодного для генотипирования возбудителя сапа. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, - 472 п.н.

При использовании компьютерных программ была проанализирована структура выбранных пар праймеров (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для внутривидовой дифференциации возбудителя сапа.

В состав реакционных смесей входили комплементарные специфическому фрагменту праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Tag-полимераза. Для предупреждения испарения в процессе амплификации на мультициклере «Терцик» на поверхность смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. Для отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды. Амплификацию продолжительностью 40 циклов проводили в микроцентрифужных пробирках (0,5 мл) на мультициклере «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г. Москва) в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».

Условия проведения реакции: этап предварительной денатурации ДНК при 95°С - 5 мин, затем в течение 40 циклов - денатурация ДНК при 95°С - 10 сек; отжиг праймеров при 60°С - 10 сек; элонгация цепи при 72°С - 10 сек, с финальной полимеризацией в течение 1 мин.

Анализ продуктов ПЦР осуществляли с помощью электрофореза в 3% агарозном геле, сравнивая их подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса (рис.1). Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждалась ее положением по отношению к контрольным маркерным фрагментам (леддер 100 п.н. ДНК, ООО «Интерлабсервис», Москва) и ДНК-стандарту (ДНК, выделенная из В.mallei Ц-5 в концентрации 1×105 м.к./мл).

Пример 3. Использование олигонуклеотидных праймеров BMVAT9-CH2S/BMVAT9-CH2AS в составе схемы дифференциации штаммов возбудителя сапа на музейных штаммах коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Специфичность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток, выращенных на плотных питательных средах в 4 мл 0,15 М NaCl в концентрации, соответствующей 1×109 м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-85 П). Обеззараживание материала проводили в соответствии с МУ 1.3.1794-03 и МУ 3.5.5.1034-01.

Обеззараживание исследуемых проб производили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур буркхольдерий осуществляли с помощью метода нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоционата (R.Boom et al. - 1990 г). Постановку реакции ПЦР осуществляли, как описано в примере 2.

При тестировании коллекции культур В.mallei Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров продукт амплификации синтезировался с ДНК следующих штаммов возбудителя сапа: В.mallei Ц-4, В.mallei Ц-5, В.mallei 11, В.mallei V-120, В.mallei 8, В.mallei P-1, В.mallei 10230, В.mallei Иванович, В.mallei 5584, В.mallei Z-12 и В.mallei Будапешт. Со штаммами В.mallei Муксувар, В.mallei Загреб и В.mallei Bogor в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат (рис.2).

На основе анализа вариабельных ампликонов нами разработана схема генотипирования возбудителя сапа, состоящая из 9 реакций амплификации. Сочетание положительных и отрицательных результатов ПЦР формирует VAT-паттерны, уникальные для каждого штамма возбудителя сапа (рис.3А).

Таким образом, с использованием разработанных праймеров BMVAT9-CH2S/BMVAT9-CH2AS в составе схемы внутривидовой дифференциации возбудителя сапа методом VAT удалось разделить 18 исследуемых штаммов В.mallei на 15 типов (рис.3).

Класс C12P19/30 нуклеотиды

набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк аденовируса серотипов 3,4,7,14,21 методом гибридизационно-флуоресцентной полимеразной цепной реакции -  патент 2511043 (10.04.2014)
способ видовой днк-дифференциации на разных стадиях жизненного цикла гельминтов-возбудителей церкариального дерматита человека -  патент 2509156 (10.03.2014)
способ молекулярно-генетического типирования штаммов bordetella pertussis -  патент 2495132 (10.10.2013)
набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для видоспецифичной экспресс-идентификации вируса эбола-заир методом полимеразной цепной реакции -  патент 2487942 (20.07.2013)
набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для видоспецифичной экспресс-идентификации вируса эбола-судан методом полимеразной цепной реакции -  патент 2487167 (10.07.2013)
синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus в заквасочных культурах, используемых при производстве кисломолочных продуктов -  патент 2481400 (10.05.2013)
олигонуклеотидные праймеры для генотипирования b.mallei методом полимеразной цепной реакции -  патент 2478715 (10.04.2013)
олигонуклеотидные праймеры для генотипирования b.mallei методом полимеразной цепной реакции -  патент 2478714 (10.04.2013)
олигонуклеотидные праймеры bmvat7-ch2s/bmvat7-ch2as для обнаружения фрагмента дифференциации вмаа0871 штаммов возбудителя сапа -  патент 2478713 (10.04.2013)
олигонуклеотидные праймеры для генотипирования b. mallei методом полимеразной цепной реакции -  патент 2474619 (10.02.2013)

Класс C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты

способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека -  патент 2528870 (20.09.2014)
способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа веijing в режиме реального времени -  патент 2528866 (20.09.2014)
способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы -  патент 2528748 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа в (3, 13 и 16 серотипы) методом от-пцр -  патент 2528745 (20.09.2014)
способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1 -  патент 2528743 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления генотипов для идентификации личности с помощью системы микросателлитных днк-маркеров y-хромосомы -  патент 2528742 (20.09.2014)
способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления -  патент 2528247 (10.09.2014)
биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител -  патент 2528099 (10.09.2014)
набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования its1-5.8s-its2 сосудистых растений -  патент 2528063 (10.09.2014)

Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них

способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам -  патент 2529711 (27.09.2014)
бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба -  патент 2529364 (27.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528874 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528873 (20.09.2014)
штамм lactobacillus fermentum, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов -  патент 2528862 (20.09.2014)
изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным -  патент 2528859 (20.09.2014)
способ получения миллерита с использованием сульфатредуцирующих бактерий -  патент 2528777 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528744 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528740 (20.09.2014)
питательная среда для культивирования легионелл -  патент 2528101 (10.09.2014)

Класс C12R1/01 бактерии или актиномицеты

бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба -  патент 2529364 (27.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528874 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528873 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528744 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528740 (20.09.2014)
питательная среда плотная для культивирования возбудителя листериоза -  патент 2525637 (20.08.2014)
иммобилизованный биокатализатор для микробной биотрансформации стероидных соединений -  патент 2524434 (27.07.2014)
способ получения замороженного бактериального концентрата на основе симбиоза пробиотических бактерий -  патент 2524432 (27.07.2014)
штамм gluconacetobacter sucrofermentans -продуцент бактериальной целлюлозы -  патент 2523606 (20.07.2014)
штамм бактерий exiguobacterium mexicanum - деструктор нефти и нефтепродуктов -  патент 2523584 (20.07.2014)
Наверх