способ прогнозирования уровня артериального давления у беременных в зависимости от генетического полиморфизма эндотелина 1

Формула изобретения

Способ прогнозирования уровня артериального давления у беременных в зависимости от генетического полиморфизма эндотелина 1, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, анализ полиморфизма методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, отличающийся тем, что проводят анализ полиморфизма K198N гена эндотелина 1 и в случае выявления аллеля 198К полиморфизма K198N ЕТ-1 прогнозируют риск повышения артериального давления у беременных на сроках 37-40 недель.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования уровня артериального давления у беременных в зависимости от генетического полиморфизма эндотелина 1.

Физиологические адаптационные изменения в организме беременной оказывают существенное влияние на ее сердечно-сосудистую систему, которая функционирует с повышенной нагрузкой [1].

Изменения в сердечно-сосудистой системе при беременности обусловлены следующими причинами [2]:

- появление нового круга кровообращения в системе мать - плацента - плод;

- увеличение объема циркулирующей крови (ОЦК);

- возрастание общей массы тела;

- повышение внутрибрюшного давления.

Нормальная беременность протекает с низким артериальным давлением (или нормальным), выраженной вазодилатацией, низким общим периферическим сосудистым сопротивлением, но с увеличением объема плазмы и сердечного выброса, высоким почечным кровотоком и высокой активностью ренина плазмы [3].

Повышение артериального давления при беременности обусловлено изменениями гемодинамики и функции почек, противоположными тем, которые имеются при нормальной беременности, то есть объем плазмы снижен, а объем внеклеточной жидкости не изменен, ударный выброс снижен, общее периферическое сосудистое сопротивление увеличено, кровотоки в матке и почках снижены, активность ренина плазмы уменьшена [4]. Большую роль в этих изменениях играет дисбаланс между продукцией вазоконстрикторов, обладающих агрегатным действием, и синтезом вазодилататоров-антиагрегантов [3, 5].

Повышение артериального давления во время беременности представляет немалую опасность не только для организма матери, по и для плода. Под действием повышенного артериального давления изменяется структура кровеносных сосудов организма женщины, что в свою очередь приводит к нарушению кровоснабжения тканей и органов плода и организма женщины [1, 6].

К настоящему времени накоплено множество сведений, указывающих, что в развитии изменений уровня артериального давления наследственные факторы могут играть значительную роль [7]. Согласно экспериментальным и клиническим данным, важную роль в этих процессах играют так называемые гены - кандидаты «сосудистых реакций», так или иначе участвующие в регуляции артериального давления [8, 9-13].

Из уровня техники известен способ диагностики артериальной гипертензии, вызванной беременностью, включающий использование фотоплетизмографического датчика артериальной пульсации и проведение ишемической пробы (заявка: 2005112689/14, 26.04.2005).

Недостаток - способ может быть использован только при наступлении беременности, поэтому невозможно использовать его для прогнозирования артериальной гипертензии, вызванной беременностью.

Известен способ «Количественный диагностический анализ гипертензии» по патенту РФ № 2287160, включающий:

1) диагностику in vitro генетически обусловленной предрасположенности к гипертонии в выделенном из организма пациента образце путем выявления коррелирующих с гипертонией однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в экзоне 8 (С Т) гена hsgk1 и в интроне 6 (Т С) гена hsgk1;

2) создание диагностических наборов, содержащих специфические реактивы для обнаружения обоих типов SNP.

Недостаток этого метода в том, что он предназначен только для выявления генетической предрасположенности к гипертензии, в то время как гипертония у беременных - это совершенно другое патологическое состояние по сравнению с эссенциальной гипертензией. Повышение уровня артериального давления у беременных полностью проходит после завершения беременности, тогда как эссенциальная гипертония, сформировавшись у пациента, затем сохраняется у него в течение всей жизни.

Известен способ прогнозирования риска стойкого повышения артериального давления на протяжении беременности у женщин с гипертонической болезнью по патенту RU № 2410020, согласно которому исследуют показатели скорости распространения пульсовой волны по артериям мышечного типа (СПВм) и интегральный модуль упругости артериального русла (Ео) в начале периода гестации до 20 недели. Недостатком является то, что прогнозирование осуществляется непосредственно у беременных женщин, уже страдающих гипертонической болезнью.

Известен способ прогнозирования развития гипертонической болезни по генетическим факторам риска (пат сиг RU № 2287158), наиболее близкий к заявленному и выбранный за прототип. По прототипу способ заключается в выделении ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК амплификации фрагментов генов PON1 и СЕТР, в пределах которых локализованы полиморфные нуклеотидные замены, проведении анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ампликонов и при выявлении генотипов PON BB и СЕТР II прогнозируют риск развития гипертонической болезни.

Недостатком является то, что этот способ не может быть использован для прогнозирования уровня артериального давления у беременных.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа прогнозирования уровня артериального давления у беременных по генетическим факторам риска в зависимости от генетического полиморфизма эндотелина 1.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки изменения артериального давления у беременных, позволяющих в короткие сроки и до наступления беременности определить вероятность изменения артериального давления в сторону его повышения к концу беременности или его выраженную динамику при возникновении беременности и в связи с этим применять определенную тактику ведения женщины во время всего срока гестации.

Задача решается при помощи молекулярно-генетического типирования гена эндотелина 1 путем определения генетического полиморфизма, связанного с заменой в 5-м экзоне гена нуклеотида гуанин на тимин в положении 90 и приводящего к замене аминокислоты лизина (К) на аспарагин (N) в 198 кодоне полипептида, кодируемого данным геном (K198N ЕТ-1). В соответствии с поставленной задачей был разработан способ оценки уровня артериального давления у беременных в зависимости от генетического полиморфизма эндотелина 1, включающий:

1) выделение ДНК из периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции;

2) анализ полиморфизма K198N гена эндотелина 1;

3) прогнозирование риска повышения артериального давления у беременных в случае выявления носительства аллеля 198К гена эндотелина 1 (ЕТ-1).

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известен способ определения уровня артериального давления у беременных по наличию аллелей и генотипов гена эндотелина 1.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови беременных в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащею 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl ₂, 10 мМ трис-НСl (рH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут.

После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рH 8,0) и 75 мМ NaCl, pесуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.

Анализ полиморфизма K198N гена ЕТ-1 (K198N ЕТ-1) проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров и специфических зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза полиморфного локуса эндотелина 1 выполняется в 25 мкл общего объема смеси, включающей 67 мМ трис-НСl (рH 8,8), 2,5 мМ MgCl₂, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль зонда с флуоресцентной меткой, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. Температурные режимы ПЦР и последовательности праймеров и зондов приведены в таблице 1.

Структура праймеров и зондов, температурный протокол амплифицированного фрагмента локуса K198N ЕТ-1

Таблица 1
Ген, полиморфизм	Последовательность праймеров и зондов	Температурный протокол
	F:5'-AGGTCGGAGACCATGAGAAAC-3'	1. 95°C
	R:5'-AATGTGCTCGGTTGTGGGT-3'	2. 40 циклов:
ЕТ-1 K198N	5'-FAM-CTGAAАGGCAAGCCCTCCAGAG-RTQ1-3'	1 мин - 61°С (real-time)
	5'-ROX-CTGAAAGGCАAТCCCTCCAGAG-BHQ2-3'	15 сек - 95°С

Предлагаемое изобретение характеризуется следующими графическими материалами:

Фиг.1. График «Дискриминация аллелей по локусу 198 KN ЕТ-1 для беременных» (где - гомозиготы по аллелю 198К, - гомозиготы по аллелю 198N, - гетерозиготы 198KN, - отрицательный контроль).

При проведении ПЦР в амплификаторе IQ5 с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществляется методом TaqMan зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда, представленном на фигуре 1. Зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует «дикому» аллелю 198К, зонд с красителем ROX - мутантному аллелю 198N.

На фигуре 1 две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: по одной для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием уровня относительной флюоресценции (RFU) для одного флуорофора (аллель 198К на оси х) относительно RFU для другого флуорофора (аллель 198N на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей. Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (198KN). Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю 198N (RFU аллеля 198N отложены по оси у). Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю 198К (RFU аллеля 198К отложены по оси х). Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).

Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, используется критерий ², наблюдаемая гетерозиготность, ожидаемая гетерозиготность, индекс фиксации Райта. Ассоциации аллелей и генотипов ДНК-маркера с предрасположенностью к развитию гипертензии оцениваются с помощью непараметрического метода Манна-Уитни.

В качестве конкретного примера приведен анализ взаимосвязей полиморфного маркера K198N гена ЕТ-1 с показателями артериального давления у 587 беременных на сроках 37-40 недель (систолическое (САД), диастолическое (ДАД), пульсовое (ПД) и среднее (АДср) артериальное давление) и их динамикой, связанной с возникновением беременности (для этого были рассчитаны показатели изменения систолического артериального давления - САД, изменения диастолического артериального давления - ДАД и изменения среднего артериального давления - АД ср). Так как распределение анализируемых показателей, оцененное с помощью критерия Шапиро-Уилка, не соответствует закону нормального распределения (р<0,05), для описания показателей АД применялась медиана (Me) и интерквартильный размах (Q25-Q75), а при сравнении индивидуумов с разными генотипами по этим показателям использовался непараметрический метод - критерий Манна-Уитни.

При проведении анализа в данном исследовании группа гетерозигот объединяется с той группой гомозигот, у которой отсутствуют отличия значений медиан и интерквартильных интервалов от гетерозиготных носителей или они были минимальные, что позволяет, увеличивая объем одной из сравниваемых групп, снизить вероятность ошибки второго рода, т.е. ошибки, связанной с получением ложноотрицательных результатов (при небольшом объеме выборок). Во-вторых, изначально нивелируя проблему множественных сравнений, снижается вероятность ошибки первого рода, т.е. ошибки, связанной с получением ложноположительных результатов.

При изучении ассоциаций полиморфизма K198N гена эндотелииа 1 с показателями артериального давления у женщин в конце беременности установлено, что женщины, имеющие в генотипе аллель 198К (генотипы 198КК и 198KN), характеризуются большими значениями показателей систолического и диастолического артериального давления (медианы 135,0 мм рт.ст. и 85,0 мм рт.ст., соответственно) по сравнению с индивидуумами с генотипом 198NN (115,0 мм рт.ст., р=0,001 и 70,0 мм рт.ст., р=0,001, соответственно) (табл.2).

Ассоциации K198N полиморфизма гена эндотелина 1 с показателями АД у женщин в конце беременности. Me (Q25-Q75)

Таблица 2
Показатели	Генотипы	р
198KK+198KN (n=572)	198NN (n=15)
САД, мм рт.ст.	135,0 (120,0-145,0)	115,0 (110,0-130,0)	0,001
ДАД, мм рт.ст	85,0 (75,0-90,0)	70,0 (70,0-80,0)	0,001
ПД, мм рт.ст	50,0 (40,0-55,0)	40,0 (40,0-50,0)	0,03
АД ср., мм рт.ст.	103,3 (88,3-110,0)	86,7 (83,3-96,7)	0,0007
АД ср., мм рт.ст.	13,3 (5,0-23,3)	5,0 (0,0-16,7)	0,006
САД, мм рт.ст.	20,0 (10,0-30,0)	5,0 (0,0-20,0)	0,004
ДАД, мм рт.ст.	10,0 (0,0-20,0)	5,0 (0,0-15,0)	0,02

У женщин с генотипами 198КК и 198KN медианы показателей пульсового давления и среднего артериального давления равны 50,0 и 103,3 мм рт.ст., что больше аналогичных значений среди беременных, имеющих генотип 198NN (40,0 мм рт.ст., р=0,03 и 86,7 мм рт.ст., р=0,0007, соответственно). Также индивидуумы с генотипами 198КК и 198KN отличаются большей динамикой показателей артериального давления к концу беременности: медианы изменения систолического, диастолического и среднего артериального давления составляют у них 20,0 мм рт.ст., 10,0 мм рт.ст. и 13,3 мм рт.ст., соответственно, у женщин с генотипом 198NN - по 5,0 мм рт.ст. (р=0,004-0,01).

В исследованных группах женщин до беременности не выявлено значимых ассоциаций полиморфного маркера 198KN ЕТ-1 с показателями артериального давления (табл.3).

Ассоциации K198N полиморфизма гена эндотелина 1 с показателями АД у женщин вне беременности. Me (Q25-Q75)

Таблица 3
Показатели	Генотипы	р
198KK+198KN (n=572)	198NN (n=15)
САД, мм рт.ст.	110,0 (110,0-120,0)	110,0 (100,0-120,0)	0,26
ДАД, мм рт.ст	70,0 (70,0-80,0)	70,0 (60,0-70,0)	0,18
ПД, мм рт.ст	40,0 (40,0-45,0)	40,0 (40,0-40,0)	0,63
АД ср., мм рт.ст.	83,3 (83,3-90,0)	81,7 (76,7-86,7)	0,09

Таким образом, подтверждено, что беременные, имеющие в генотипе аллель 198К гена эндотелина 1, характеризуются большими показателями артериального давления на сроках беременности 37-40 недель и выраженной динамикой артериального давления к концу беременности по сравнению с женщинами с генотипом 198NN, у которых наблюдаются меньшие показатели АД на 38-40 неделях гестации и менее выраженная динамика АД в конце беременности.

Приведенные примеры подтверждают, что поставленная задача - разработка способа прогнозирования уровня артериального давления у беременных в зависимости от генетического полиморфизма эндотелина 1 решена. На основе выявления у женщины аллеля 198К полиморфизма K198N ЕТ-1 можно предсказать у них выраженную динамику артериального давления при развитии беременности и большие показатели артериального давления к концу гестации на сроках 37-40 педель.

Литература

1. Кошелева Н.Г., Бузурукова П.С., Вошева Т.Н., Кроль Т.М. Особенности центральной гемодинамики у женщин с нормальным и патологическим течением беременности // Акушерские и женские болезни. - 2002, № 2. - С.38-42.

2. Кулаков В.И., Сидорова В.С. Руководство по акушерству. - М.: Медицина, 2006. - 574 с.

3. Окороков А.Н. Диагностика болезней внутренних органов: Т. 7. Диагностика болезней сердца и сосудов. - М.: Мед. лит., 2003. - 416 с.

4. Макаров О.В., Николаев Н.Н., Волкова Е.В. Артериальная гипертензия у беременных. Только ли гестоз? - М.: Гэотар-Медиа, 2006. - 176 с.

5. Адашева Т.В., Демичева О.Ю. Артериальная гипертония беременных: патогенез, классификация, подходы к лечению // Лечащий врач. - 2004, № 2. - С.43-47.

6. Савельева Г.М. Акушерство. - М.: Медицина, 2000. - 160 с.

7. Торшин И.Ю., Громова О.А. Сосудистые заболевания сердца, мозга и молекулярные гены. Часть 3: роль молекулярных генов в вазоконстрикции, вазодилятации, обмене электролитов и в васкулярном ремоделировании // Трудный пациент. - 2008. - т.6, № 5-6. - С.8-11.

8. Минушкина Л.О. Генетические факторы при гипертонической болезни: связь с особенностями течения, развитием осложнений, эффективностью терапии: Автореф. дисс. к.м.н. - Москва, 2008. - 48 с.

9. Adámková V., Hubá ek J.A., Pistulková H. Genetic determination of an endothelial function and the size of the heart sections in juvenile hypertensives //.J. Appl. Biomed. - 2006, № 4. - P.59-65.

10. Iwai С., Akita H., Kanazawa К. et al. Arg389Gly polymorphism of the human betal-adrenergic receptor in patients with nonfatal acute myocardial infarction // Am Heart J. - 2003. - v. 1, № 146. - Р.106-109.

11. Koyama R.G., Drager L.F., Lorenzi-Filho G. et al. Reciprocal interactions of obstructive sleep apnea and hypertension associated with ACE I/D polymorphism in males // Sleep Med. - 2009, № 10(10). - P.1107-1111.

12. Min-Ho Shin, Eun-Kyung Chung, Hee-Nam Kim et al. Alpha-adducin Gly460Trp and Essential Hypertension in Korea // J Korean Med Sci. - 2004. - № 19. - P.812-814.

13. Sun X.J., Hou X.F., Liu S.R., et al. Associations between CYP11B2 gene - 344T/C polymorphism and essential hypertension in the Han nationality in Shandong province // Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. - 2004. - v.5, № 21. - P.502-504.