способ количественного определения специфических иммуноглобулинов g к конъюгату формальдегид - сывороточный человеческий альбумин в сыворотке крови

Формула изобретения

Способ количественного определения специфических иммуноглобулинов G к конъюгату формальдегид - сывороточный человеческий альбумин в сыворотке крови, характеризующийся тем, что производят подготовку опытной и контрольной нитроцеллюлозной подложки, для этого размещают их в различных лунках микропланшеты, причем подготовку опытной подложки осуществляют путем последовательной сорбции на ней сывороточного человеческого альбумина и формальдегида при комнатной температуре в течение 8 ч, а подготовку контрольной подложки осуществляют путем сорбции на ней сывороточного человеческого альбумина, далее производят инкубацию в течение 30 мин опытной и контрольной подложек исследуемой пробой сыворотки, затем после промывки подложек фосфатным буфером добавляют к ним в лунку конъюгированные с пероксидазой хрена моноклональные антитела к Fc-фрагменту иммуноглобулина G человека, вновь производят промывку подложек фосфатным буфером и образовавшийся иммунохимический комплекс специфических иммуноглобулиновых G антител окрашивают добавлением хромогена и проявляют внесением стоп-реагента, затем удаляют из лунок микропланшеты отработанные подложки и регистрируют оптическую плотность в опытном и контрольном образцах, сопоставляют их с оптической плотностью стандартных образцов с известной концентрацией иммуноглобулина G и по разности содержания иммуноглобулина G в опытном и контрольном образцах судят о количестве специфических к тестируемому веществу иммуноглобулинов G в сыворотке крови пациента при выполнении одновременного условия превышения оптической плотности в опытном образце над оптической плотностью контрольного образца не менее чем в 1,5 раза.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к технике лабораторных исследований, в частности к способам проведения иммунологического анализа, и может быть использовано в клинической иммунологии для определения концентрации специфических иммуноглобулинов G в сыворотке крови, благодаря чему диагностируют наличие аутоиммунных реакций, вызванных формальдегидом.

Известен способ диагностики сенсибилизации к водорастворимым промышленным аллергенам (Патент РФ № 2323441), согласно которому определяют уровни аллергенспецифических антител - иммуноглобулинов подклассов IgG1 и IgG4 в сыворотке крови с использованием конкретного аллергена. Рассчитывают коэффициент специфической аллергизации (КоСАЛЛ) по определенной формуле. При КоСАЛЛ меньше 2,5 делают вывод о наличии IgG зависимой сенсибилизации к конкретному промышленному аллергену. Известный способ позволяет повысить точность диагностики наличия сенсибилизации к аллергену и сократить время исследования.

Однако известный способ предназначен для диагностики только сенсибилизации (аллергии) к промышленным гаптенам, в то время как предлагаемый способ дает информацию об образовании антител IgG (суммарный показатель) в ответ на попадание в организм формальдегида, а не только "аллергических" (реагинов), к которым относится только подкласс IgG4.

Также из уровня техники известен способ количественного определения антител, в том числе иммуноглобулинов G, к бенз(а)пирену (статья: Glushkov A.N. et al. [A new immunoassay of human antibodies to chemical carcinogens]. [Article in Russian]. Klin Lab Diagn. 2008 Mar; (3): 42-44) и способ иммуноферментного анализа антител к химическим канцерогенам группы полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) (Патент РФ № 2124731). Указанные методы являются практически тождественными. В частности, согласно способу по патенту, на стенках лунок пластикового планшета адсобируют антиген. Затем инкубируют исследуемую биологическую жидкость с адсорбированным антигеном. Проявляют связавшиеся с антигеном антитела с помощью анти-антител, меченых ферментов. При этом в качестве антигена используют конъюгат фторметилбензантрила уксусной кислоты с человеческим сывороточным альбумином при их массовом соотношении 1:5,4 соответственно, в концентрации 2 мкг/мл.

Недостатками указанных известных способов являются следующие:

- при реализации известного способа определяется совокупность антител, в том числе и IgG (в совокупность сывороточных антител входят IgG+IgA+IgM и др.), т.е. этот известный способ лишен селективности в отношении иммуноглобулина G;

- в известном способе возможно определение лишь условных единиц содержания иммуноглобулинов, т.е. относительную величину, использование которой по сравнению с абсолютной величиной увеличивает погрешность результата, т.к. для установления относительной величины применяется, по меньшей мере, два показателя, каждый из которых может привносить свою погрешность;

- при реализации известного способа требуется разведение сыворотки крови раствором овальбумина, что вносит дополнительную неопределенность в точность определения минорных белковых фракций и усложняет способ.

Предлагаемый способ устраняет все указанные недостатки известного способа, а именно:

- обеспечивает селективность за счет возможности определения количества именно иммуноглобулина G к конъюгату формальдегид - сывороточный человеческий альбумин;

- обеспечивает возможность установления количественного содержания специфического иммуноглобулина G в абсолютных единицах - нг/мл;

- обеспечивает точность определения за счет исключения разведения сыворотки крови при реализации способа;

- обеспечивает достоверность определения за счет введения дополнительного критерия, а именно превышение оптической плотности в опытном образце над оптической плотностью контрольного образца не менее чем в 1,5 раза.

Технический результат, достигаемый настоящим изобретением, заключается в создании способа, обеспечивающего определение количественного содержания в абсолютных единицах иммуноглобулина G в сыворотке крови к конъюгату формальдегид - сывороточный человеческий альбумин.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения специфических иммуноглобулинов G к конъюгату формальдегид - сывороточный человеческий альбумин в сыворотке крови, характеризующимся тем, что производят подготовку опытной и контрольной нитроцеллюлозной подложки, для этого размещают их в различных лунках микропланшеты, причем подготовку опытной подложки осуществляют путем последовательной сорбции на ней сывороточного человеческого альбумина и формальдегида при комнатной температуре в течение 8 часов, а подготовку контрольной подложки осуществляют путем сорбции на ней сывороточного человеческого альбумина, далее производят инкубацию в течение 30 минут опытной и контрольной подложек исследуемой пробой сыворотки, затем после промывки подложек фосфатным буфером добавляют к ним в лунку конъюгированные с пероксидазой хрена моноклональные антитела к Fc-фрагменту иммуноглобулина G человека, вновь производят промывку подложек фосфатным буфером и образовавшийся иммунохимический комплекс специфических иммуноглобулиновых G антител окрашивают добавлением хромогена и проявляют внесением стоп-реагента, затем удаляют из лунок микропланшеты отработанные подложки и регистрируют оптическую плотность в опытном и контрольном образцах, сопоставляют их с оптической плотностью стандартных образцов с известной концентрацией иммуноглобулина G и по разности содержания иммуноглобулина G в опытном и контрольном образцах судят о количестве специфических к тестируемому веществу иммуноглобулинов G в сыворотке крови пациента при выполнении одновременного условия превышения оптической плотности в опытном образце над оптической плотностью контрольного образца не менее чем в 1,5 раза.

Указанный технический результат достигается за счет следующего.

Следует отметить, что в назначении предлагаемого способа указано на определение специфичных IgG к конъюгату «формальдегид - сывороточный человеческий альбумин» (СЧА), ввиду того, что формальдегид, вступая в химическую реакцию с альбумином, образует вышеуказанный конъюгат (Patterson R. et.al. Human antibodies against Formaldehyde - Human serum albumin conjugates or Human serum albumin in individuals exposed to Formaldehyde. Int Arch Allergy Appl Immunol. 1986; 79(1): 53-59). Но это формальное указание на назначение. Однако иммуногеном выступает именно формальдегид, который, поступая в организм человека, образует конъюгированную (связанную) форму персистенции в организме. И фактически именно на указанный иммуноген и возникает у организма аллергическая (аутоиммунная) реакция с образованием специфических антител. Если в качестве иммуногена будет выступать не формальдегид, то будут отсутствовать и специфические IgG на формальдегид-альбуминовый комплекс. Поэтому практически заявляемый способ выступает в качестве мерила влияния именно формальдегида на образование антител к конъюгату «формальдегид - сывороточный человеческий альбумин». А конъюгат формальдегид-СЧА является только производным от формальдегида и СЧА, где специфичность его проявляется именно за счет формальдегида.

Таким образом, не вызывает сомнения факт идентичности антител к формальдегиду и антител к комплексу формальдегид + альбумин, поскольку последний олицетворяет гаптенную (иммуногенную) форму персистенции формальдегида в организме.

Благодаря тому, что при осуществлении заявляемого способа берут две нитроцеллюлозные подложки: опытную (содержащую тестируемое вещество: конъюгат формальдегид - сывороточный человеческий альбумин) и контрольную (не содержащую тестируемое вещество), обеспечивается установление точной концентрации специфических IgG антител за счет отсечения неспецифических, присоединившихся к контрольной подложке.

Нанесение на них сывороточного человеческого альбумина (далее СЧА) позволяет обеспечить диагностикум субстратом для конъюгации формальдегида.

Причем последовательность добавления в лунку с опытной подложкой сначала СЧА, а потом тестируемого вещества является важным признаком предлагаемого способа, т.к. только такая последовательность обеспечит необходимое пространственное расположение антигенных эпитопов для конъюгации на них специфических IgG и позволит достигнуть высокой точности и достоверности.

Использование в качестве режима сорбции выдержки в течение 8 часов обеспечивает полноту конъюгации.

Проведение 30-минутной инкубации опытной и контрольной подложек одной исследуемой пробой сыворотки (а не двумя, как в известных способах) позволяет обеспечить равнозначные условия в отношении обоих подложек, что обеспечивает точность измерения.

Кроме того, использование в предлагаемом способе неразведенной сыворотки позволяет избежать дополнительной погрешности при определении.

Добавление в каждую лунку после вышеуказанной инкубации конъюгированных с пероксидазой хрена моноклональных антител к Fc-фрагменту иммуноглобулина G человека позволяет идентифицировать IgG антитела к формальдегиду, связавшиеся с диагностикумом, что обеспечивает специфичность данного способа.

Благодаря тому, что в качестве материала, содержащего тестируемое вещество, используют нитроцеллюлозную подложку, например бумажный диск, обеспечивается простота способа, а также оригинальность подхода по определению специфических IgG (путем связывания белка и формирования белково-полисахаридного сэндвича), что обеспечивает точность определения.

При проведении иммуноферментного анализа достоверные показатели количества IgG в сыворотке крови, причем в виде абсолютных величин в единицах нг/мл, были получены только при выполнении одновременного условия превышения оптической плотности в опытном образце над оптической плотностью контрольного образца не менее чем в 1,5 раза. То есть показатель количественного содержания IgG соответствовал действительности только при наличии еще и этого признака. Выбор этого численного значения «не менее чем в 1,5 раза» обусловлен наличием феномена неспецифического связывания балластного белка, поэтому индекс превышения оптической плотности раствора опытной пробы над контрольной должен быть значительным, превышающим «нормальную» хаотичность этого процесса.

Предлагаемый способ был испытан в клинических условиях.

Пример конкретного осуществления предлагаемого способа.

В процессе испытаний была исследована кровь у 6 пациентов. После отбора крови из вены стандартным методом центрифугирования была получена сыворотка, которая в последующем подверглась исследованиям.

Для этого в лунки стандартной микропланшеты для иммуноферментного анализа, стрипы которой были изготовлены из полистирола, вносили опытную и контрольную нитроцеллюлозные подложки, представляющие из себя диск фильтровальной бумаги (диаметром 5,5 мм из фильтра обеззоленного "белая лента" ТУ 6-09-1678-86). Затем проводили подготовку опытной и контрольной подложек, для чего в лунку с опытной подложкой последовательно вносили 50 мкл 5%-ного раствора сывороточного человеческого альбумина (СЧА) и 50 мкл 0,025%-ного раствора формальдегида, а в лунку с контрольной подложкой - 50 мкл 5%-ного раствора СЧА.

Указанная подготовка с целью сорбции проводилась 8 часов при комнатной температуре. Результаты экспериментального подбора времени инкубации по формированию сорбента для определения IgG к конъюгату формальдегида - СЧА позволили установить оптимальное время экспозиции, равное 8 часам (опытные данные приведены в таблице 1).

Таблица 1
Содержание специфического IgG к конъюгату формальдегида с СЧА в зависимости от времени инкубации по формированию сорбента (нг/мл)
Время инкубации	2 часа	4 часа	8 часов	10 часов	12 часов	24 часа
Антитела IgG к конъюгату формальдегида с СЧА	0,68	1,31	2,21	1,95	1,89	1,63

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что инкубации в течение 2 и 4 часов недостаточно для полного связывания составляющих сорбентного комплекса, что в результате проявляется сниженным выходом специфических антител. В то же время инкубация, превышающая 8-часовую экспозицию, приводит к снижению стабильности сорбентного комплекса и потере результирующего количества специфических антител. Таким образом, указанный режим реализации предлагаемого способа является неожиданным и неочевидным.

Затем лунки промывались три раза фосфатным буфером (0,02 М раствором KH₂PO₄ и Na₂HPO₄ с pH 7,6) для удаления с его поверхности не связавшегося формальдегида. После сорбции антигенов к иммобилизованному на подложках конъюгату формальдегид - сывороточный человеческий альбумин в лунки (с опытной и контрольной подложками) вносили образец исследуемой пробы сыворотки в количестве 50 мкл. Во время инкубации происходило связывание Fab-фрагментов специфических антител человека с антигенными комплексами, сорбированными на нитроцеллюлозной подложке. По завершении 30-минутной экспозиции и промывки лунок фосфатным буфером на втором этапе иммуноферментного анализа для образования классического «сэндвича» в опытный и контрольный образец одновременно вносили 50 мкл конъюгированных с пероксидазой хрена моноклональных антител к Fc-фрагменту IgG человека. Во время часовой инкубации опытного образца при комнатной температуре происходило конкурентное связывание специфических антител к конъюгату формальдегида с СЧА со специфическими участками вариабельных доменов Fab-фрагментов моноклональных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. После промывки лунок фосфатным буфером и проявления окраски посредством добавления хромогенного субстрата, например, тетраметилбензидин, и стоп-реагента, например 1 Н раствор серной кислоты, проводили удаление отработанных подложек и осуществляли фотометрическое измерение и регистрацию оптической плотности в опытном и контрольном образцах. Затем сопоставляли их с оптической плотностью стандартных образцов с известной концентрацией иммуноглобулина G к белку куриного яйца. Для получения таких стандартных образцов параллельно изготовлялись калибровочные диски, на которые конъюгировались образцы с известным содержанием человеческих антител IgG к белку куриного яйца. Использовались стандартные образцы IgG, конъюгат, хромогенный субстрат и стоп-реагент из набора реагентов для определения общего IgG (см. "Инструкцию по применению набора реагентов IgG общий - ИФА-БЕСТ" А 8662, ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск, Россия). Данные, полученные в ходе испытаний, приведены в таблице.

По разности содержания иммуноглобулина G в опытном и контрольном образцах судят о количестве специфических к тестируемому веществу иммуноглобулинов G в сыворотке крови пациента (при наличии в пробе сыворотки крови пациента специфических к конъюгату формальдегид - СЧА IgG, значение оптической плотности в опытном образце превысит аналогичное значение в контрольном образце, т.к. в «сэндвиче» больше конъюгированных антител, нашедших специфические рецепторы). Причем эту величину принимают за достоверную при выполнении одновременно условия превышения оптической плотности в опытном образце над оптической плотностью контрольного образца не менее чем в 1,5 раза.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что результаты определения IgG к конъюгату формальдегид - СЧА предлагаемым способом коррелируют с положительными результатами химического анализа крови на содержание формальдегида, что доказывается данными, приведенными в последней колонке таблицы. В этой колонке указана кратность превышения содержания формальдегида в крови пациента над референтным, что логично соотносится у данных пациентов с высоким уровнем специфических IgG антител к конъюгату формальдегид - СЧА, определяемым заявляемым способом.

Введение критерия 1,5 при оценке превышения оптической плотности контрольного образца над опытным позволяет не только определять количественное значение специфического IgG, но и качественно характеризовать состояние пациента, как наличие повышенного антителообразования к конкретному промышленному химическому соединению - формальдегиду.

Примеры, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о наличии специфического антителообразования к формальдегиду у пациентов под номерами 2, 5 и 6 установленного по критерию 1,5 превышения оптической плотности (ODопыт.) опытной пробы (иммуносорбент, конъюгированный с формальдегидом) над соответствующей оптической плотностью контроля (ODконтр.) (неконъюгированный иммуносорбент). Полученный результат подтверждается одновременным обнаружением формальдегида в пробе крови пациентов под номером 2, 5 и 6 в концентрации, превышающей референтную (допустимую).

Предлагаемый способ позволяет, благодаря использованию иммуносорбентного диагностикума, конъюгированного с исследуемым веществом формальдегидом, проводить идентификацию специфичных антител к комплексу «белок-антиген» in vitro (ИФА), а введение критерия 1,5 при оценке превышения оптической плотности опытного образца над контрольным позволяет не только определять количественное значение специфического IgG, но и качественно характеризовать состояние пациента, как состояние повышенной чувствительности иммунной системы пациента к формальдегиду.

Для доказательства того, что предлагаемый способ является точным и достоверным, было проведено углубленное иммунологическое обследование пациентов под номерами 2, 5 и 6. Этим пациентам была выполнена иммунограмма, в результате чего было выявлено иммунодефицитное состояние. Наличие у пациентов диагноза «иммунодефицитное состояние» соотносится с известными сведениями о преимущественном негативном воздействии формальдегида на здоровье. Таким образом, состояние здоровья пациентов 2, 5 и 6 характеризуется симптоматикой, характерной для повышенной экспрессии специфических IgG антител к формальдегиду.

Предлагаемый способ предназначен для диагностики не только сенсибилизации (аллергии) к промышленным антигенам, но и позволяет идентифицировать образование основных сывороточных иммуноглобулинов - IgG антител в ответ на попадание в организм формальдегида, а не только "аллергических" (реагинов), что существенно расширяет диагностические возможности способа.

Таким образом, обеспечивая точность и достоверность, предлагаемый способ может найти широкое применение в лабораторной практике.

Таблица 2
Оценка содержания специфического IgG к конъюгату формальдегид - СЧА у детей с различным содержанием формальдегида в крови
Контингент, диагноз	IgG к конъюгату формальдегид - СЧА (заявляемый способ), нг/мл	Отношение оптической плотности опытного образца к оптической плотности контрольного образца в отношении формальдегида ODопыт./ODконтр.*	Кратность превышения референтного уровня содержания формальдегида в крови пациента
1. Пациент, 12 лет Иммунодефицитное состояние	2.22	1.8	1.4
2.Пациент, 5 лет Атоп. дерматит	2.47	2.1	1.8
3. Пациент, 8 лет Дискинезия желчевыводящих путей	1.18	0.8	0.7
4. Пациент, 5 лет Вегетососудистая дистония	2.21	1.75	1.2
5. Пациент, 7 лет Респ. аллергоз	2.31	2.0	1.5
6. Пациент, 0 лет Респ. аллергоз	2.55	2.3	2.0
Примечание. * Диагностический критерий кратности отношения оптической плотности в опытном образце к оптической плотности в контрольном образце