полипептиды модифицированного гормона роста

Формула изобретения

1. Молекула нуклеиновой кислоты, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из:

1) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 22, или

2) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 23,

отличающаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который имеет антагонистическую активность в отношении рецептора гормона роста.

2. Полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из: аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 24, или аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 32; где указанный полипептид имеет антагонистическую активность в отношении рецептора гормона роста.

3. Применение полипептида по п.2 в лечении избытка гормона роста.

4. Применение по п.3, где указанный полипептид вводят с недельными интервалами.

5. Применение по п.3, где указанный полипептид вводят с двухнедельными интервалами.

6. Применение по п.3, где указанный полипептид вводят с месячными интервалами.

7. Применение по п.3, где избыток гормона роста представляет собой гигантизм или акромегалию.

8. Гомодимер, состоящий из двух полипептидов, состоящих из SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 32, где указанный гомодимер имеет антагонистическую активность в отношении рецептора гормона роста.

9. Применение гомодимера по п.8 в лечении избытка гормона роста.

10. Применение по п.9, где избыток гормона роста представляет собой гигантизм или акромегалию.

11. Фармацевтическая композиция для лечения избытка гормона роста, содержащая полипептид по п.2, включающая эксципиент или носитель.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к слитым белкам модифицированного гормона роста и димерам, содержащим указанные слитые белки, молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим указанные белки, и способам лечения, включающим применение указанных белков.

Гормон роста (GH) представляет собой анаболический гормон-цитокин, важный для роста в длину в детском возрасте и нормальной конституции у взрослых. Регуляция активности GH сложна и включает несколько взаимодействующих полипептидных и пептидных агонистов и антагонистов. GH может оказывать свои эффекты либо непосредственно, связывая рецептор гормона роста, либо косвенно, стимулируя образование инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1). Таким образом, главной функцией GH является стимуляция образования IGF-1 печенью. Кроме того, секрецию GH контролируют два пептидных гормона с противоположной активностью. Рилизинг-фактор гормона роста (GHRH) представляет собой пептид из 44 аминокислот, образуемый дугообразным ядром гипоталамуса. Он функционирует, стимулируя образование GH передней долей гипофиза. Соматостатин представляет собой пептидный гормон, противодействующий эффектам GHRH, и является результатом процессинга более крупного пре-пропептида с образованием форм из 14 и 28 аминокислот. Нейроэндокринные клетки перивентрикулярного ядра гипоталамуса секретируют соматостатин в гипоталамо-гипофизарную систему воротной вены, соединяющую гипоталамус с передней долей гипофиза, где соматостатин ингибирует секрецию GH.

GH последовательно связывается с двумя мембраносвязанными рецепторами гормона роста (GHR) через два отдельных сайта на GH, называемых сайт 1 и сайт 2. Сайт 1 является сайтом связывания с высокой аффинностью, а сайт 2 является сайтом связывания с низкой аффинностью. Одна молекула GH связывает 1 GHR через сайт 1. Затем происходит вовлечение второго GHR через сайт 2 с образованием комплекса GHR:GH:GHR. Затем происходит интернализация комплекса, и он активирует каскад сигнальной трансдукции, приводящий к изменениям экспрессии генов. Внеклеточный домен GHR существует в виде двух связанных доменов, каждый из которых содержит приблизительно 100 аминокислот (SD-100), при этом C-концевой домен SD-100 (b) расположен ближе всего к поверхности клетки, а N-концевой домен SD-100 (а) расположен на наибольшем отдалении. При связывании гормона происходит конформационное изменение этих двух доменов с образованием тримерного комплекса GHR-GH-GHR.

Избыток GH ассоциирован с несколькими болезненными состояниями, например акромегалией и гипофизарным гигантизмом. Большая часть случаев избытка GH является результатом опухоли гипофиза из соматотрофных клеток передней доли гипофиза. Эти опухоли являются доброкачественными и постепенно увеличивают секрецию GH. Симптомы избытка гормона роста включают утолщение костей челюсти, пальцев рук и ног, сдавление нервов/мышц и инсулинорезистентность. Основным лечением избытка GH, связанного с опухолью, является хирургическое удаление опухоли гипофиза. В последнее время применение антагонистов GH для ингибирования GH-сигнализации становится предпочтительным лечением ввиду его неинвазивного характера. Антагонисты GH могут представлять собой либо рекомбинантные формы соматостатина, либо аналоги соматостатина (например октреотид, ланреотид), либо модифицированный GH.

Обзор антагонистов, представляющих собой модифицированный GH, приведен в Kopchick (2003) European Journal of Endocrinology 148; S21-25, где описан имеющийся в продаже антагонист GH, называемый пегвисомант, в котором комбинируют модификацию человеческого GH в положении G120 с присоединением полиэтиленгликоля для увеличения молекулярной массы модифицированного GH. Проблема, связанная с введением гормона роста, состоит в его быстром клиренсе почечной фильтрацией и/или протеолизом. Присоединение полиэтиленгликоля уменьшает эти потери. Тем не менее, известно, что полиэтиленгликоль уменьшает аффинность GH в отношении GHR, и, таким образом, для компенсации такой сниженной аффинности необходимо вводить увеличенные количества модифицированного GH. Это может приводить к побочным эффектам. Будет желательным предоставить антагонист, представляющий собой модифицированный GH, который можно вводить в меньшей дозе, избегая, таким образом, проблем, связанных с пегвисомантом. Это может заключаться либо в уменьшении вводимого количества, либо в снижении частоты введения.

В одновременно находящейся на рассмотрении заявке авторов настоящего изобретения, WO 03/070765, авторами настоящего изобретения описаны слитые белки модифицированного GH, включающие модификации сайта 1 и сайта 2 в GH. Эти модифицированные молекулы GH слиты с внеклеточным доменом GHR. Здесь авторами настоящего изобретения раскрыты слитые белки модифицированного GH, имеющие значительно увеличенный период полувыведения в сыворотке и образующие димеры, которые могут быть связаны с улучшенной фармакокинетикой этих слитых белков либо ввиду снижения почечного клиренса, либо ввиду защиты модифицированного GH от протеолиза. Улучшенные фармакокинетические профили этих слитых белков гормона роста сделают возможными схемы лечения, не требующие многократных введений и уменьшающие нежелательные побочные эффекты.

Согласно одному аспекту изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из:

1) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 1;

2) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 2;

3) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 4;

4) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 5;

5) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 7;

6) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 8;

7) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 10;

8) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 11;

9) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 13;

10) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 14;

11) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 16;

12) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 17;

13) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 19;

14) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 20;

15) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 22;

16) последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 23;

17) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, гибридизующуюся в строгих условиях гибридизации с SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22 или 23;

и кодирующая полипептид, имеющий антагонистическую активность в отношении рецептора гормона роста.

Гибридизация молекулы нуклеиновой кислоты происходит при образовании множества водородных связей между двумя комплементарными молекулами нуклеиновых кислот. Строгость гибридизации может варьировать в соответствии с условиями среды, окружающей нуклеиновые кислоты, характером способа гибридизации и составом и длиной используемых молекул нуклеиновых кислот. Вычисления относительно условий гибридизации, необходимых для достижения определенных степеней строгости, обсуждены в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); и Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York, 1993). T_m представляет собой температуру, при которой 50% данной цепи молекулы нуклеиновой кислоты гибридизуется с ее комплементарной цепью. Далее представлен примерный ряд условий гибридизации, и он не является ограничивающим.

Очень строгие условия (допускают гибридизацию последовательностей, имеющих по меньшей мере 90% идентичность)

Гибридизация:	5-кратный (5х) раствор хлорида и цитрата натрия (SSC) при 65°С в течение 16 часов
Промыть два раза:	2х SSC при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут для каждого раза
Промыть два раза:	0,5х SSC при 65°С в течение 20 минут для каждого раза

Строгие условия (допускают гибридизацию последовательностей, имеющих по меньшей мере 80% идентичность)

Гибридизация:	5х-6х SSC при 65-70°С в течение 16-20 часов
Промыть два раза:	2х SSC при RT в течение 5-20 минут для каждого раза
Промыть два раза:	1х SSC при 55-70°С в течение 30 минут для каждого раза

Условия пониженной строгости (допускают гибридизацию последовательностей, имеющих по меньшей мере 50% идентичность)

Гибридизация:	6х SSC при RT 55°С в течение 16-20 часов
Промыть по меньшей мере два раза:	2х-3х SSC при RT 55°С в течение 20-30 минут для каждого раза

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 1.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 2.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 4.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 5.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 7.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 8.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 10.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 11.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 13.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 14.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 16.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 17.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 19.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 20.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 22.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 23.

Согласно одному аспекту изобретения предложен полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по изобретению.

Согласно другому аспекту изобретения предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из:

1) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 3;

2) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 6;

3) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 9;

4) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 12;

5) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 15;

6) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 18;

7) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 21;

8) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 24;

9) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 25;

10) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 26;

11) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 27;

12) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 28;

13) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 29;

14) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 30;

15) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 31;

16) аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 32;

имеющий антагонистическую активность в отношении рецептора гормона роста.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 3.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 6.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 9.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 12.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 15.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 18.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 21.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 24.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 25.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 26.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 27.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 28.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 29.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 30.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 31.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 32.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 3.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 6.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 9.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 12.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 15.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 18.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 21.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 24.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 25.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 26.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 27.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 28.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 29.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 30.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 31.

Согласно другому аспекту изобретения предложен гомодимер, содержащий два полипептида, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 32.

Согласно другому аспекту изобретения предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный вектор представляет собой вектор экспрессии, адаптированный для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению.

Необязательно, чтобы вектор, содержащий нуклеиновую кислоту (кислоты) по изобретению, содержал промотор или другую регуляторную последовательность, особенно если вектор предназначен для использования для введения нуклеиновой кислоты в клетки для рекомбинации в геноме для стабильной трансфекции. Предпочтительно, нуклеиновая кислота в векторе функционально связана с подходящим промотором или другими регуляторными элементами для транскрипции в клетке-хозяине. Вектор может представлять собой бифункциональный вектор экспрессии, функционирующий во многих хозяевах. Под «промотором» подразумевают нуклеотидную последовательность, расположенную в обратном направлении от сайта инициации транскрипции и содержащую все регуляторные области, необходимые для транскрипции. Подходящие промоторы включают конститутивные, тканеспецифичные, индуцибельные промоторы, промоторы развития или другие промоторы для экспрессии в эукариотических или прокариотических клетках. «Функционально связанный» означает связанный как часть той же молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующим образом расположенный и ориентированный для транскрипции, инициируемой промотором. ДНК, функционально связанная с промотором, находится «под регуляцией инициации транскрипции» промотора.

В предпочтительном воплощении промотор представляет собой конститутивный, индуцибельный или регулируемый промотор.

Согласно другому аспекту изобретения предложена клетка, трансфицированная или трансформированная молекулой нуклеиновой кислоты или вектором по изобретению.

Предпочтительно, указанная клетка представляет собой эукариотическую клетку. Альтернативно, указанная клетка представляет собой прокариотическую клетку.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная клетка выбрана из группы, состоящей из клетки гриба (например, Pichia spp, Saccharomyces spp, Neurospora spp), клетки насекомого (например, Spodoptera spp), клетки млекопитающего (например, клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО)), растительной клетки.

Согласно другому аспекту изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по изобретению, включающая эксципиент или носитель.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная фармацевтическая композиция объединена с дополнительным терапевтическим агентом.

При введении фармацевтической композиции по настоящему изобретению ее вводят в фармацевтически приемлемых препаратах. Такие препараты могут обычно содержать фармацевтически приемлемые концентрации соли, буферных агентов, консервантов, совместимых носителей и, возможно, других терапевтических агентов.

Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить любым обычным способом введения, включая инъекцию. Введение и применение может, например, быть пероральным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриполостным, внутрисуставным, подкожным, местным (глазным), кожным (например, кремовая жирорастворимая вкладка для кожи или слизистой оболочки), чрескожным или интраназальным.

Фармацевтические композиции по изобретению вводят в эффективных количествах. «Эффективное количество» представляет собой такое количество лекарственных средств/композиций, которое само по себе или вместе с дополнительными дозами или синергическими лекарственными средствами приводит к желаемому ответу. Это может включать только временное замедление прогрессирования заболевания, тем не менее, более предпочтительно это включает стойкое прекращение прогрессирования заболевания. Это можно контролировать обычными способами или можно контролировать в соответствии с диагностическими способами.

Дозы фармацевтических композиций, вводимые субъекту, могут быть выбраны в соответствии с различными параметрами, в частности в соответствии с используемым способом введения и состоянием субъекта (например, возрастом, полом). При введении фармацевтические композиции по изобретению используют в фармацевтически приемлемых количествах и в фармацевтически приемлемых композициях. При использовании в медицине соли должны быть фармацевтически приемлемыми, но фармацевтически неприемлемые соли могут легко быть использованы для получения их фармацевтически приемлемых солей и не исключены из объема изобретения. Такие фармакологически и фармацевтически приемлемые соли включают, без ограничения, соли, полученные из следующих кислот: соляной, бромоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, лимонной, муравьиной, малоновой, янтарной и тому подобных. Кроме того, фармацевтически приемлемые соли могут быть получены как соли щелочных или щелочноземельных металлов, как, например, соли натрия, калия или кальция.

Если желательно, фармацевтические композиции можно объединять с фармацевтически приемлемым носителем. При использовании здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель» обозначает один или более чем один совместимый твердый или жидкий наполнитель, разбавитель или инкапсулирующее вещество, подходящее для введения человеку. Термин «носитель» обозначает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединяют активный ингредиент для облегчения применения. Компоненты фармацевтических композиций также могут быть смешаны вместе с молекулами по настоящему изобретению и друг с другом таким образом, что не будет взаимодействия, которое могло бы существенно снизить желаемую фармацевтическую эффективность.

Фармацевтические композиции могут содержать подходящие буферные агенты, включая уксусную кислоту в форме соли, лимонную кислоту в форме соли, борную кислоту в форме соли и фосфорную кислоту в форме соли.

Возможно, фармацевтические композиции также могут содержать подходящие консерванты, такие как хлорид бензалкония, хлорбутанол, парабены и тимерозал.

Фармацевтические композиции могут легко быть представлены в виде стандартной лекарственной формы и могут быть изготовлены любым из способов, хорошо известных в фармацевтической области. Все способы включают стадию ассоциации активного агента и носителя, представляющего собой один или более чем один дополнительный ингредиент. В большинстве случаев композиции изготавливают посредством равномерного и тесного объединения активного соединения с жидким носителем, тонкоизмельченным твердым носителем или и тем, и другим и затем, если необходимо, придания продукту формы.

Композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в форме дискретных единиц, таких как капсулы, таблетки, лепешки, каждая из которых содержит предварительно определенное количество активного соединения. Другие композиции включают суспензии в водных жидкостях или неводных жидкостях, такие как сироп, эликсир или эмульсия.

Композиции, подходящие для парентерального введения, подходяще содержат стерильный водный или неводный препарат, предпочтительно изотонический по отношению к крови реципиента. Этот препарат может быть изготовлен в соответствии с известными способами с применением подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может также представлять собой стерильный раствор или суспензию для инъекций в нетоксичном разбавителе или растворителе, приемлемом для парентерального введения, например, в форме раствора в 1,3-бутандиоле. В числе приемлемых растворителей могут быть использованы вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. В дополнение, в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно используют стерильные нелетучие масла. С этой целью может быть использовано любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. В дополнение, в препарате для инъекций могут быть использованы жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. Состав носителя, подходящего для перорального, подкожного, внутривенного, внутримышечного и тому подобного введения можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Согласно другому аспекту изобретения предложен способ лечения субъекта-человека, страдающего избытком гормона роста, включающий введение эффективного количества по меньшей мере одного полипептида по изобретению.

В предпочтительном способе по изобретению указанный полипептид вводят внутривенно.

В альтернативном предпочтительном способе по изобретению указанный полипептид вводят подкожно.

В другом предпочтительном способе по изобретению указанный полипептид вводят ежедневно или с двухдневными интервалами; предпочтительно, указанный полипептид вводят с недельными, двухнедельными или месячными интервалами.

В предпочтительном способе по изобретению указанный избыток гормона роста приводит к акромегалии.

В предпочтительном способе по изобретению указанный избыток гормона роста приводит к гигантизму.

Согласно другому аспекту изобретения предложен способ лечения субъекта-человека, страдающего раком, включающий введение эффективного количества по меньшей мере одного полипептида по изобретению.

При использовании здесь термин «рак» относится к клеткам, имеющим способность к автономному росту, то есть ненормальному статусу или состоянию, характеризующемуся быстрым пролиферирующим ростом клеток. Подразумевают, что этот термин включает все типы злокачественного роста или онкогенных процессов, метастатических тканей или злокачественным образом трансформированных клеток, тканей или органов, независимо от гистопатологического типа или стадии инвазии. Термин «рак» включает злокачественные новообразования различных систем органов, такие как злокачественные новообразования, поражающие, например, легкое, молочную железу, щитовидную железу, лимфоидные органы, желудочно-кишечный и мочеполовой тракт, а также аденокарциномы, включающие такие злокачественные новообразования, как большинство злокачественных новообразований ободочной кишки, почечно-клеточный рак, рак предстательной железы и/или опухоли яичка, немелкоклеточный рак легкого, рак тонкой кишки и рак пищевода. Термин «карцинома» принят в данной области техники и относится к злокачественным новообразованиям эпителиальных или эндокринных тканей, включая карциномы дыхательной системы, карциномы желудочно-кишечной системы, карциномы мочеполовой системы, карциномы яичка, карциномы молочной железы, карциномы предстательной железы, карциномы эндокринной системы и меланомы. Примеры карцином включают карциномы, имеющие происхождение от ткани шейки матки, легкого, предстательной железы, молочной железы, головы и шеи, ободочной кишки и яичника. Термин «карцинома» также включает карциносаркомы, например, включающие злокачественные опухоли, состоящие из карциноматозных и саркоматозных тканей. Термин «аденокарцинома» относится к карциноме, имеющей происхождение от железистой ткани, или опухолевые клетки которой образуют распознаваемые железистые структуры. Термин «саркома» принят в данной области техники и относится к злокачественным опухолям мезенхимального происхождения.

В предпочтительном способе по изобретению указанный рак представляет собой рак предстательной железы.

В описании и формуле изобретения данной заявки слова «включать» и «содержать» и варианты этих слов, например «включающий» и «включает», обозначают «включающий, без ограничения» и подразумевают, что они не исключают другие группировки, дополнения, компоненты, целые или стадии.

В описании и формуле изобретения данной заявки единственное включает множественное, если контекст не требует иного. В частности, при использовании терминов, указывающих на неопределенное количество, описание следует понимать как предполагающее множество, так же как и единственное число, если контекст не требует иного.

Свойства, целые, характеристики, соединения, химические группировки или группы, описанные в связи с определенным аспектом, воплощением или примером изобретения, следует понимать как применимые в любом другом аспекте, воплощении или примере, описанном здесь, если они совместимы с ним.

Воплощение изобретения будет теперь описано только посредством примеров и со ссылкой на следующие графические материалы.

В Таблице 1 показан анализ по Брэдфорду фракций 1B8v2.

Фиг.1а: 1B8v0, состоит из GH (содержит мутацию сайта 1), связанного с внеклеточной частью GHR (доменами 1 и 2) через линкер G4Sx4; данная конструкция содержит сайты рестрикции вблизи линкерной области и на 3'-конце; на Фиг.1б представлена кодируемая аминокислотная последовательность.

Фиг.2а: 1B8v1. Данная молекула имеет происхождение от 1B8v0, но не содержит постороннюю последовательность на 5'- и 3'-концах и содержит линкер G4Sx4; на Фиг.2б представлена кодируемая аминокислотная последовательность.

Фиг.3а: 1B8v2. Данная молекула имеет происхождение от 1B8v0, но не содержит постороннюю последовательность и содержит линкер G4Sx5; на Фиг.3б представлена кодируемая аминокислотная последовательность.

Фиг.4а: 1B8v3. Данная молекула имеет происхождение от 1B8v0, но не содержит постороннюю последовательность и не содержит линкер; на Фиг.4б представлена кодируемая аминокислотная последовательность.

Фиг.5а: 1B9v0, состоит из GH (содержит мутации сайта 1 и сайта 2), связанного с GHR (доменами 1 и 2) через линкер G4Sx4; данная конструкция содержит сайты рестрикции вблизи линкерной области и на 3'-конце; на Фиг.5б представлена кодируемая аминокислотная последовательность.

Фиг.6а: 1B9v1. Данная молекула имеет происхождение от 1B9v0, но не содержит постороннюю последовательность на 5'- и 3'-концах и содержит линкер G4Sx4; на Фиг.6б представлена кодируемая аминокислотная последовательность.

Фиг.7а: 1B9v2. Данная молекула имеет происхождение от 1B9v0, но не содержит постороннюю последовательность и содержит линкер G4Sx5; на Фиг.7б представлена кодируемая аминокислотная последовательность.

Фиг.8а: 1B9v3. Данная молекула имеет происхождение от 1B9v0, но не содержит постороннюю последовательность и не содержит линкер; на Фиг.8б представлена кодируемая аминокислотная последовательность.

На Фиг.9 показан основной способ лигирования для субклонирования молекулы G120R в плазмиду экспрессии млекопитающих.

На Фиг.10 показано конструирование 1B9v0.

На Фиг.11 показан Nar1-Avrll-фрагмент 1В8 v2 (524 пары оснований (п.о.)). Новая линкерная область показана жирным шрифтом, сайт рестрикции подчеркнут. Данный фрагмент лигировали в плазмиду pGHsecTag-1B8v1 с образованием

плазмиды pGHsecTag-1B8v2.

На Фиг.12 показан Nar1-Avrll-фрагмент 1В9 v2 (524 пары оснований (п.о.)). Новая линкерная область показана жирным шрифтом, сайт рестрикции подчеркнут. Данный фрагмент лигировали в плазмиду pGHsecTag-1B9v1 с образованием

плазмиды pGHsecTag-1B9v2.

На Фиг.13 показан вестерн-блот с использованием GH-специфичного антитела для выявления экспрессии как 1B8v2 (дорожки 1 и 2), так и 1B9v2 (дорожка 3) из культуральных сред стабильной клеточной линии СНО Flp-ln. Образцы имеют соответствующий ожидаемый для каждого белка размер (~75 кДа) и не демонстрируют признаков деградации.

На Фиг.14 показано, что в присутствии (+) 0,5 нМ rhGH образцы сред как от стабильной клеточной линии 1B8v2, так и от стабильной клеточной линии 1B9v2 способны антагонизировать эффекты rhGH. В отсутствие (-)0,5 нМ GH ни одна из молекул не проявляет биологической активности. Показана калибровочная кривая GH (0-5 нМ).

На Фиг.15а показан электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) с додецилсульфатом натрия (SDS) (SDS-PAGE-анализ) очищенных белковых фракций с окрашиванием кумасси. На изображениях показано, что очищенный белок (1B8v2) имеет соответствующий ожидаемый размер (~75 кДа), наряду с отсутствием видимых продуктов деградации с меньшей молекулярной массой; на Фиг.15б показан SDS-PAGE-анализ 1B9v2.

Фиг.16а. Пик уровней белка в сыворотке через 24 часа после инъекции после подкожного (SC) введения 1В8. 1В8 все еще можно выявить через 10 дней после введения. Фиг.16б. Пик уровней белка в сыворотке через 1 час после инъекции с последующим резким снижением после внутривенного (IV) введения 1В8.

Фиг.17а. Вестерн-блот нативных PAGE-образцов. 1: 1B7v0, слитый белок нативного GH, 2: 1B7v1, нативный GH, 3: 1B7v2, нативный GH, 4: 1B7v3, нативный GH, 5: 1В8, слитый белок модифицированного GH. Все образцы демонстрируют две отдельные полосы, характерные для мономера и образования димера. На Фиг.17б представлен эквивалентный окрашенный кумасси гель, на котором показано образование димера.

На Фиг.18 показан % прироста массы тела у белых кроликов NZ на протяжении 12 дней для сравнения 5 вводимых доз пегвисоманта с однократными дозами IB8 и IB9.

На Фиг.19 показана фармакокинетика (PK) IB8 у белых кроликов NZ на протяжении 250 часов.

Материалы и методы

Конструирование молекулы антагониста 1В8

Конструировали молекулу с мутацией аминокислоты глицина в положении 120 на аргинин в сайте 2 (сайте с низкой аффинностью) молекулы GH (G120R). Связывание молекулы GH с рецептором GH через сайт 1 с высокой аффинностью не затронуто, тем не менее, связывание с рецептором через сайт 2 GH ингибировано объемной боковой группой молекулы аргинина.

Ранее для получения молекулы GH, содержащей мутацию G120R, был применен ПЦР-способ, и с применением подходящих сайтов рестрикции стало возможным клонирование этой молекулы в плазмиду экспрессии pTrc-His с образованием клона pTrc-His-1A7 (G120R, связанного с внеклеточным доменом B GHR).

Затем из этого вектора вырезали Bsu36l-Not1-фрагмент длиной 300 п.о. и лигоровали его в плазмиду экспрессии млекопитающих pGHsecTag-1B7 (GH, связанный с внеклеточными доменами А и В GHR) с образованием pGHsecTag-1В8 (секреторной экспрессией управляет секреторная сигнальная последовательность GH). См. Фиг.9.

Конструирование молекулы антагониста 1B9v0

Конструировали молекулу с мутацией аминокислот как в сайте 1, так и в сайте 2 молекулы GH. Связывание молекулы GH с рецептором GH через сайт 1 с высокой аффинностью усилено этими мутациями, в то время как связывание с рецептором через сайт 2 GH ингибировано одной заменой глицина на аргинин.

Способ сайт-направленного мутагенеза с применением одноцепочечной ДНК использовали для получения молекулы GH, содержащей мутации как сайта 1, так и сайта 2. Применение подходящих сайтов рестрикции сделало возможным клонирование этой молекулы в плазмиды экспрессии pTrc-His и рЕТ21а (+). С применением ПЦР получали клон, содержавший сигнальную последовательность GH (GHss) с фланкирующими сайтами Nhe1 и Not1. Его лигировали в плазмиду экспрессии млекопитающих pGHsecTag-1B8v0 (GH связанный с внеклеточными доменами А и В GHR) с образованием pGHsecTag-1B9v0 (секреторной экспрессией управляет секреторная сигнальная последовательность GH). См. Фиг.10.

Конструирование клонов-вариантов как 1B8v0, так и 1B9v0

Плазмиду pGHsecTag-1B7v3 расщепляли с использованием рестриктаз HindIII-EcoRV и фрагмент лигировали в плазмиды pGHsecTag-1B8v0 и 1B9v0 для конструирования плазмид pGHsecTag-1B8v1 и 1B9v1 (эти молекулы не содержат какую-либо ошибочную последовательность на 3'-конце). Следующая стадия состояла в удалении сайтов рестрикции вблизи линкерной области с образованием плазмид pGHseTag-1B8v2 и 1B9v2. Это осуществляли с применением синтеза генов, в которых исходный линкер был заменен на линкер G4Sx5.

Синтезом генов конструировали следующие фрагменты с фланкирующими сайтами рестрикции Narl и Avrll и лигировали их либо в pGHsecTag-1B8v1, либо в 1B9v1; см. Фиг.11 и 12.

Биологическая активность молекул-вариантов антагонистов in vitro

Биологическую активность каждой химерной молекулы in vitro исследовали с применением анализа с GH-специфичным люциферазным репортером. По существу, клеточную линию, имеющую происхождение от человека, стабильно трансфицировали человеческим рецептором GH и затем транзиторно трансфицировали люциферазным сигнальным репортером. Этим анализом выявлены физиологические уровни GH, см. Фиг.14.

Очистка молекул-антагонистов

Клеточные линии СНО Flp-In, экспрессирующие как 1B8v2, так и 1B9v2 в виде секретируемого продукта, выращивали в свободных от белка средах. Перед аффинной очисткой среды собирали, концентрировали и осветляли. Для очистки готовили 20 мл активированной N-гидроксисукцинимидом (NHS) смолы Sepharose 4 Fast Flow, связанной с моноклональным антителом 5Е1 к человеческому GH (hGH). Обычно образец сред концентрировали в десять раз и разводили в соотношении 1:1 со связывающим буфером (25 мМ трис-HCl/150 мМ NaCl, pH 7,4) перед очисткой.

Материал вносили на колонку со скоростью потока 2 мл/мин. После промывки связанный белок элюировали при скорости потока 1 мл/мин 200 мМ глицином, pH 2,7, с последующей нейтрализацией 1 М трис-HCl, pH 9,0. Образцы анализировали посредством SDS-PAGE (см. Фиг.15а и 15б). На Фиг.17а и 17б показано образование димеров IB9 по сравнению с химерными молекулами нативного гормона роста.

Фармакокинетические исследования IB8

6 нормальным здоровым крысам однократной инъекцией вводили 1 нмоль (75 мкг) белка либо подкожно (SC, Фиг.16а), либо внутривенно (IV, Фиг.16б). Контрольным крысам вводили только наполнитель. Образцы брали с временными интервалами на протяжении 10-дневного периода и анализировали на присутствие 1В8 с применением твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на GH собственной разработки.

Таблица 1а
	Концентрация белка (мкг/мл)	Объем (мл)	Общий белок (мг)
Внесение 1B8v2	293	106	31,1
Несвязанный	227	120	27,2
Промывка	-	120	-
Элюирование 1	-	5	-
Элюирование 2	60,7	5	0,3
Элюирование 3	63,6	5	0,32
Элюирование 4	84,7	5	0,42
Элюирование 5	18,5	5	0,09
Элюирование 6	10,0	5	0,05
30 кДа F/T	8,6	450	3,9

Таблица 1б
	Концентрация белка (мкг/мл)	Объем (мл)	Общий белок (мг)
Внесение 1B9v2	311	110	34,2
Несвязанный	246	125	30,8
Промывка	-	150	-
Элюирование 1	9,4	5	-
Элюирование 2	32,4	5	0,16
Элюирование 3	129	5	0,65
Элюирование 4	80,1	5	0,4
Элюирование 5	37,1	5	0,19
Элюирование 6	9,4	5	0,05
30 кДа F/T	9,4	450