способ получения тест-объекта из клеток роговицы эмбриональных цыплят для оценки цитотоксичности лекарственных средств

Формула изобретения

Способ получения тест-объекта для оценки цитотоксичности лекарственных средств, включающий использование роговицы эмбриональных цыплят и клеточной технологии, отличающийся тем, что выделяют роговицу эмбрионов цыплят 7-14 дней гестации, которую измельчают и замораживают в парах жидкого азота до -180°С, при оценке цитотоксичности лекарственных средств замороженный материал подвергают медленной разморозке, переносят в центрифужную пробирку и трехкратно отмывают в 0,9%-ном растворе NaCl, а затем измельчают клеточные элементы до получения гомогенной клеточной суспензии, осаждают строму в центрифуге, надосадок, содержащий клетки роговицы, переносят в стерильную пробирку и вновь осаждают клетки, супернатант удаляют, а к осадку, содержащему роговичные клетки, добавляют 1 мл 0,9%-ного раствора NaCl и рессуспендируют, в полученной суспензии считают цитоз и определяют жизнеспособность клеток по окрашиванию их ДНК-флуорохромами на проточном цитофлюориметре, затем 0,9%-ным раствором NaCl суспензию клеток роговицы доводят до концентрации 5,0·10⁵ клеток в 1 мл и переносят в культуральные флаконы и добавляют исследуемые препараты, для контроля в один из флаконов добавляют NaCl 0,9%-ный, дальнейшую инкубацию проводят в культуральных флаконах в СО₂-инкубаторе в течение суток, далее суспензии клеток переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют для осаждения клеток и отбирают по 1 мл суспензии каждого опыта для исследования цитотоксичности по окрашиванию клеток ДНК-флуорохромами, цитотоксичность исследуемых веществ оценивают на проточном цитофлюориметре.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, точнее к клеточным технологиям оценки цитотоксичности, и может быть использовано для оценки качества лекарственных средств для местного лечения с целью исключения возможности использования цитотоксичных и фальсифицированных материалов, а также предупреждения вредных последствий их воздействия на организм.

Важнейшие требования при разработке и создании новых лекарственных препаратов - анализ и изучение их токсичности. Это - первый и необходимый этап доклинических исследований и скрининга синтезированных соединений. Исследование токсичности проводят как на подопытных животных, так и с использованием первично трипсинизированных или перевиваемых культур клеток и тканей человека, животных и микроорганизмов.

Требование этичности эксперимента стало обязательным условием проведения опытов на животных. Проблеме замены животных на альтернативные модели уделяется очень большое внимание. Проводится активная научно-исследовательская работа по созданию альтернативных методов, повышающих точность, экономичность, уменьшению времени продолжительности опытов.

Известен способ оценки токсичности средств, проводимый на лабораторных животных. Испытуемый препарат вводят в конъюнктивальную полость бодрствующего поросенка. Повреждение тканей оценивают по изменению температуры глаза. Температуру измеряют с помощью тепловизора. Измерение температуры начинают до введения лекарств. Лекарство вводят однократно в конъюнктивальную полость в минимальной дозе, после чего освобождают веки, которые затем повторно разводят через каждую минуту для повторного измерения температуры, а при развитии гиперемии промывают конъюнктивальную полость теплым изотоническим раствором NaCl 0,9%, закапывают в нее каплю раствора 1% лидокаина гидрохлорида и выдают заключение о токсичности лекарства и о возможности повреждения эпителия конъюнктивы (RU 2396562 С1).

Недостатком этого метода является, во-первых, его неэтичность, т.к. испытания проводят на подопытных животных. Кроме того, разность пола, линий, возраста, массы используемых животных может приводить к ошибочным результатам.

Известен также способ оценки раздражающего действия и активности природных, синтетических субстанций и готовых препаратов на куриных эмбрионах методом ультразвуковой доплерографии (ХЕТ-КАМ тест). Недостаток этого способа заключается в том, что оценивается только раздражающее действие препарата по сужению сосудов без остановки или с временной остановкой крови в отдельных капиллярах, замедление и/или остановка кровотока, гиперемия, тромбоз сосудов, появление кровоизлияний и их распространенность, коагуляция белков хориоаллантоисной оболочки (нарушение прозрачности). Определяется местнораздражающая токсичность препарата на сосуды эмбриона без оценки цитотоксичности препарата (RU 2383888 С1).

Наиболее близким к заявляемому является метод определения цитотоксичности различных лекарственных средств в органной культуре роговицы (Мальханов В.Б., Азнабаев М.Т. Органные культуры. - Уфа: Полиграфкомбинат, 1998. - 192 с.: с ил.). Суть способа заключается в том, что при внесении испытуемых препаратов в органную культуру роговицы в случае содержания в препарате токсичных примесей происходит изменение способности клеток к размножению и дегенерация. Недостатком этого способа является односторонность оценки воздействия препарата на чувствительную культуру только по эффекту дегенерации, что не обеспечивает учета полноты реакции клеток на препарат. Метод не стандартизован также по используемым для целей контроля органным культурам. Недостатками указанного метода являются также не только отсутствие контроля за процессом деления клеток in vitro и появлением любых антигенов, несущих признаки генетически чужеродной информации вследствие естественных мутаций и появления атипичных недифференцированных клеток, но и трудоемкость получения, наличие культуральной среды (наличие токсических веществ в среде, высокий риск микробного заражения и сдвиг рН, предусматривающий проверку на цитотоксичность и периодическую смену среды).

Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в создании нового высокоэффективного тест-объекта для оценки цитотоксичности лекарственных препаратов, повышающего точность и объективность результатов исследования, универсальность применения для широкого круга препаратов, стандартность проводимой оценки.

Указанный результат достигается тем, что в качестве тест-объекта предлагаются эмбриональные клетки роговицы цыплят 7-14 дней гестации, обладающие стабильностью культуральных и морфологических свойств. А предлагаемый способ получения тест-объекта для определения цитотоксичности лекарственных препаратов включает в себя использование современных методов клеточной технологии и приборов, таких как проточный цитофлюориметр и программы Cell Quest Pro и др., которые дают возможность определения пролиферативных характеристик культуры и позволяют оценить степень задержки и/или повреждения общефизиологических процессов в клетках роговицы. Морфологические исследования способствуют оценке направленности цитотоксичности исследуемого объекта при определении изменений морфологии клеток, митотической активности, в частности состояние клеточного цикла.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Получают культуру клеток роговицы из эмбрионов цыплят на 7-14 день гестации. Эмбрионы цыплят тщательно обрабатывают антисептическим раствором и отмывают дистиллированной водой. Забирают для исследования роговицу глаза, которую затем измельчают. Проверенный на стерильность материал помещают в криопробирки емкостью 2 мл (Costar) с раствором для замораживания (Эмбриональная телячья сыворотка 90% + Диметилсульфоксида 10% + криопротектор (90% Fetal Bovine Serum + 10% DMSO)). Замораживание проводят в парах жидкого азота до -180°С со скоростью заморозки 1°С в минуту с использованием программного биологического замораживателя Кrуо 560-16 (Planer, Великобритания). Затем криопробирки с материалом помещают в жидкий азот (t=-180°С) в сосуды Дюара (СДС-35М ОАО «НПО ГЕЛИЙМАШ», г.Москва).

Через 24 часа хранения при температуре -180°С замороженный материал для сохранения высокой жизнеспособности клеток подвергают медленному размораживанию в парах жидкого азота со скоростью +1°С в минуту с использованием программного биологического замораживателя Кrуо 560-16 (Planer, Великобритания). Размороженный материал переносят в стерильную стеклянную центрифужную пробирку и трехкратно отмывают в растворе NaCl 0,9%. Затем измельчают клеточные элементы в Medimashine (Becton Dichinson, Cod 79300, maximal volume 1 ml, нож BD medicors) до получения гомогенной клеточной суспензии. Осаждают строму в центрифуге при 1500 об/мин в течение 10 минут. Надосадок, содержащий клетки роговицы, переносят в стерильную пробирку и вновь осаждают клетки. Супернатант удаляют, а к осадку, содержащему роговичные клетки, добавляют 1 мл раствора NaCl 0,9% и ресуспендируют. В полученной суспензии определяют жизнеспособность клеток и считают цитоз. Далее раствором NaCl 0,9% суспензию клеток роговицы доводят до концентрации 5,0·10 ⁵ клеток в 1 мл и переносят в культуральные флаконы.

В суспензию клеток роговицы концентрации 5,0·10 ⁵ добавляют исследуемые препараты и для контроля в один из флаконов вносят NaCl 0,9%. Дальнейшую инкубацию проводят в культуральных флаконах в СО₂ инкубаторе (Sanyo СО ₂ INCUBATOR, Япония) при температуре +37°C в атмосфере с 5% СО₂ в течение суток. Затем суспензии переносят в стерильные стеклянные центрифужные пробирки. Для осаждения клеток центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин. Отбирают по 1 мл суспензии каждого опыта в стерильные пробирки для исследования цитотоксичности. Цитотоксичность определяется по окрашиванию клеток флуоресцентными красителями, обладающими способностью избирательно окрашивать двухспиральные нуклеиновые кислоты одним из известных ДНК-флуорохромов. В данных исследованиях использовался внутриклеточный краситель 7-АДД (7-аминоактиномицин-Д) в объеме 20 мкл. Далее рассчитывают в процентах соотношение количества апоптотических клеток к их общему количеству. Цитотоксичность исследуемых веществ оценивают на проточном цитофлюориметре с помощью программы Cell Quest Pro. Полученные данные обрабатывают на ПЭВМ IBM/PC при помощи стандартных статистических пакетов «SPSS 11,5 for Windows».

Предлагаемый способ апробирован на препаратах, применяемых в офтальмологии: Корнерегель, MEDgel 0,3% и MEDgel 0,1%.

Результаты проведенных исследований по приведенному выше способу свидетельствуют о том, что после добавления в изучаемый тест-объект «Корнерегель» через 1 сутки наблюдается снижение абсолютного и относительного количества клеток ниже контрольной группы, а при добавлении «MEDgel» 0,3% и 0,1% количество клеток повышалось (табл.1-3).

В табл.1-3 и гистограмме (рис.1) также приведены результаты исследования возможности использования клеток роговицы эмбрионов более ранней гестации, в частности 7-дневной, и сравнение их с чувствительностью 14-дневной.

Таблица 1
Абсолютное количество клеток роговицы
Показатель	Контроль	Корнерегель	MEDgel, 0,3%	MEDgel, 0,1%
Клетки роговицы 14 дней гестации (n=8)
	310420,0±998,44	6290,0±582,96	564466,67±21254,09	352450,0±2744,02
Абсолютное количество
Сигмальное отклонение	19794,57	1648,86	52061,68	55711,25
Клетки роговицы 7 дней гестации (n=6)
Абсолютное количество	163780,0±30585,21#	6000,0±1024,92	670033,33±51782,88	300556,67±39366,7
Сигмальное отклонение	74918,17	2510,52	126841,64	96428,33
Примечание: - достоверность различия с контролем ( - р<0,01; - р<0,001); # - достоверность различия с клетками роговицы 14 дней гестации (# - р<0,001).

После добавления в изучаемый тест-объект исследуемых лекарственных веществ с заявленной производителями репаративной активностью через 1 сутки обнаружили снижение жизнеспособности эмбриональных клеток роговицы цыпленка как 14 дней гестации, так и 7 дней гестации. Однако абсолютное и относительное количество клеток через 1 сутки инкубации в тест-объекте эмбриональных клеток роговицы цыпленка 7 дней гестации было значительно меньше (р<0,001).

Таблица 2
Относительное количество клеток роговицы
Показатель	Контроль	Корнерегель	MEDgel, 0,3%	MEDgel, 0,1%
Клетки роговицы 14 дней гестации (n=8)
Относительное количество, %	62,08±1,4	1,26±0,12	112,89±4,25	70,49±4,55
Сигмальное отклонение	3,96	0,33	10,41	11,14
Клетки роговицы 7 дней гестации (n=6)
Относительное количество, %	32,76±6,12#	1,2±0,2	134,01±10,36	60,11±7,87
Сигмальное отклонение	14,98	0,5	25,37	19,29
Примечание: - достоверность различия с контролем ( - р<0,05; - р<0,001); # - достоверность различия с клетками роговицы 14 дней гестации (# - р<0,001)

Таблица 3
Жизнеспособность клеток роговицы
Показатель	Контроль	Корнерегель	MEDgel, 0,3%	MEDgel, 0,1%
Клетки роговицы 14 дней гестации (n=8)
Жизнеспособность, %	91,5±1,12	87,95±2,44	94,0±1,32	94,33±0,76
Сигмальное отклонение	3,16	6,9	3,22	1,86
Клетки роговицы 7 дней гестации (n=6)
Жизнеспособность, %	89,67±0,76	85,67±1,17	94,33±1,38	95,0±0,37
Сигмальное отклонение	1,86	2,88	3,39	0,89
Примечание: - достоверность различия с контролем ( - р<0,05; - р<0,01; - р<0,001)

При добавлении «Корнерегеля» жизнеспособность клеток роговицы цыпленка 7 дней гестации достоверно снижается (р<0,01), а при добавлении «MEDgel, 0,3%» и «MEDgel, 0,1%» повышается в среднем на 5%.

В результате проведенных исследований выяснилось, что для определения цитотоксичности лекарственных средств экспериментатор при необходимости может использовать эмбрионы цыплят от 7 до 14 дней гестации.

Таким образом новый тест-объект, полученный по предложенному способу, отличается высокой чувствительностью и специфичностью определения цитотоксичности лекарственных веществ, объективностью интерпретирования результатов исследования, универсальностью применения для широкого круга препаратов, быстротой получения результатов и соответствием современным этическим требованиям. Применение тест-объекта позволило стандартизировать исследование на цитотоксичность. И, кроме того, он соответствует требованиям этичности.

Заявителю неизвестны технические решения, обладающие указанными отличительными признаками, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата, поэтому авторы считают, что заявляемый способ соответствует критериям новизны, изобретательского уровня и промышленной применимости.

Заявляемый способ может найти широкое применение в медицине, аллергологии и иммунологии, фармакологии, клинической фармакологии.