стабилизация жидких растворов рекомбинантного белка для хранения в замороженном состоянии

Формула изобретения

1. Способ стабилизации жидкого раствора факторов коагуляции и/или свертывания для хранения в замороженном состоянии, который содержит:

a. обеспечение жидкого раствора факторов коагуляции и/или свертывания, где указанный раствор имеет концентрацию NaCl и/или KCl, по меньшей мере, 100 мМ;

b. добавление карбогидрата к указанному раствору до достижения указанным раствором при замораживании температуры стеклования -56°C или выше и с.замораживание указанного раствора для хранения.

2. Способ по п.1, в котором жидкий раствор факторов коагуляции и/или свертывания представляет собой нерасфасованный раствор.

3. Способ по п.1, в котором раствор имеет концентрацию NaCl, по меньшей мере, 100 мМ.

4. Способ по п.1, в котором карбогидрат добавляется в количестве 8-25 мас.% от массы раствора.

5. Способ по п.1, в котором карбогидрат выбирается из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, гидроксиэтилкрахмала, декстрана и их комбинаций.

6. Способ по п.1, в котором нерасфасованный раствор имеет концентрацию NaCl, по меньшей мере, 300 мМ.

7. Способ по п.1, в котором нерасфасованный раствор имеет концентрацию NaCl, по меньшей мере, 600 мМ.

8. Способ по п.1, в котором фактор коагуляции и/или свертывания представляет собой Фактор VIII.

9. Способ по п.1, в котором температура стеклования находится между -56°C и

-35°С.

10. Способ по п.1, кроме того, содержащий добавление аминокислоты и/или поверхностно-активного вещества.

11. Жидкий раствор факторов коагуляции и/или свертывания, который стабилизирован для хранения в замороженном состоянии, и который имеет концентрацию NaCl и/или KCl, по меньшей мере, 100 мМ, и который содержит карбогидрат в таком количестве, что указанный раствор достигает при замораживании температуру стеклования -56°C или выше.

12. Жидкий раствор факторов коагуляции и/или свертывания по п.11, который содержит нерасфасованный раствор.

13. Жидкий раствор факторов коагуляции и/или свертывания по п.11, имеющий концентрацию NaCl, по меньшей мере, 100 мМ.

14. Жидкий раствор факторов коагуляции и/или свертывания по п.11, содержащий карбогидрат в количестве от 8 до 25 мас.% от массы раствора.

15. Жидкий раствор факторов коагуляции и/или свертывания по п.11, где карбогидрат выбирается из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, гидроксиэтилкрахмала, декстрана и их комбинаций.

16. Жидкий раствор факторов коагуляции и/или свертывания по п.11, где жидкий раствор имеет концентрацию NaCl, по меньшей мере, 300 мМ.

17. Жидкий раствор факторов коагуляции и/или свертывания по п.11, где жидкий раствор имеет концентрацию NaCl, по меньшей мере, 600 мМ.

18. Жидкий раствор факторов коагуляции и/или свертывания по п.11, где фактор коагуляции и/или свертывания представляет собой Фактор VIII.

19. Жидкий раствор факторов коагуляции и/или свертывания по п.11, где температура стеклования находится между -56°C и -35°С.

20. Жидкий нерасфасованный раствор рекомбинантного Фактора VIII, который содержит концентрацию NaCl, по меньшей мере, 100 мМ, содержит рекомбинантный Фактор VIII в концентрации между 0,0001 мкмоль/мл и 10 мкмоль/л, и стабилизирован для хранения в замороженном состоянии путем добавления карбогидрата.

Описание изобретения к патенту

Настоящая заявка заявляет преимущество предварительной патентной заявки 60/926,698, поданной 26 апреля 2007 г., раскрытие которой включено посредством ссылки.

Область изобретения

Изобретение относится к замораживанию и хранению жидких растворов рекомбинантного белка, предпочтительно нерасфасованных растворов.

Уровень техники

Продуцирование рекомбинантных белков в клеточной культуре обычно включает ряд стадий очищения, с помощью которых желаемый белковый продукт выделяют из рекомбинантных клеток-хозяев и/или связанной культурной среды. Многие важные рекомбинантные белки получают в большом промышленном масштабе. В случае фармацевтических белков, например, нередко необходимо более одной стадии очищения для достижения желаемого уровня чистоты продукта.

Может быть необходимым хранение нерасфасованного раствора рекомбинантного белка, который был первоначально очищен, но не окончательно, перед конечным очищением для приготовления фармацевтического продукта. Например, содержащий белок продукт реакции рекомбинантной ферментации может сначала быть очищен на аффинной или ионообменной колонке. После первоначального прохождения через колонку белковый продукт является только частично очищенным, и раствор все еще содержит составляющие, такие как остатки клеточной культуры и другие белки. Перед конечным превращением в фармацевтический продукт нерасфасованный раствор должен быть далее обработан до получения белка удовлетворительной степени чистоты.

Как правило, раствор например, элюционный буфер, который применяют для выделения белка после первой стадии очистки, представляет собой высококонцентрированный раствор соли. В случае элюирования с колонки высокая концентрация соли необходима для выделения белка с колонки. Соответственно нерасфасованный раствор, полученный после первой стадии очистки, может содержать раствор, имеющий высокую концентрацию моновалентных солей, как правило, хлорида натрия, но возможно и хлорида калия и других солей.

Хранение нерасфасованного раствора рекомбинантного белка представляет собой сложную задачу из-за высокой концентрацией соли и очень низкой концентраций белка раствора. Идеально, белки хранятся при температурах ниже температуры стеклования для обеспечения стабильности, так как в стеклообразном состоянии инактивация и денатурация белка являются чрезвычайно медленными в фармацевтическом временном масштабе. С другой стороны, присутствие высокой концентрации соли в растворе приводит к понижению его температуры стеклования, и в растворах с высокой концентрацией соли и низкой концентрацией белка очень низкие температуры необходимы для достижения такого состояния.

Хранение в замороженном состоянии при более высокой температуре желательно для нерасфасованных растворов в больших объемных количествах по причинам стоимости и эффективности, но в то же время сохранения стабильности и активности белка.

Краткое описание изобретения

Изобретение представляет собой способ стабилизации жидкого раствора рекомбинантного белка для хранения в замороженном состоянии, который содержит: обеспечение раствора рекомбинантного белка, где указанный раствор имеет концентрацию моновалентной соли, например NaCl и/или KCl, по меньшей мере 100 мМ; добавление карбогидрата к указанному раствору в количестве, достаточном для придания раствору, при замораживании, температуры стеклования -56°C или выше; и замораживание указанного раствора для хранения.

Изобретение также обеспечивает жидкий раствор рекомбинантного белка, который стабилизируется для хранения в замороженном состоянии, который содержит карбогидрат в количестве, достаточном для придания раствору, при замораживании, температуры стеклования -56°C или выше.

Описание чертежей

Фиг.1 показывает эффект на сохранение активности рекомбинантного белка от добавления карбогидрата, с другими эксципиентами или без других эксципиентов, как описано в тексте, к нерасфасованному раствору рекомбинантного Фактора VIII. Четыре различные композиции обозначены как F1, F2, F3 и F4. Активность Фактора VIII была оценена после замораживания и хранения при -30°C в различные моменты времени, как показано, в течение до 24 недель. До добавления карбогидрата нерасфасованный раствор содержал около 600 мМ NaCl, 10 мМ CaCl ₂, 20 мМ имидазола и 0.1% Triton X-100, за исключением F3, которая была разбавлена, как описано здесь. График изображает зависимость эффективности коагуляции от времени (IU/мл).

Фиг.2 показывает потерю активности рекомбинантного FVIII после замораживания и хранения при -70°C и -30°C нерасфасованного раствора Фактора VIII, применяемого в экспериментах, проиллюстрированных на Фиг.1, но без стабилизирующих эксципиентов. Обозначение "LN2 до -70°С" указывает на то, что образцы были заморожены в жидком азоте перед хранением при -70°C, и "LN2 до -30°C" указывает на то, что образцы были заморожены в жидком азоте перед хранением при -30°C. "EVA до -70°C" указывает на то, что образцы были заморожены в полимерных мешках для хранения и хранились при -70°C.

Описание предпочтительных вариантов выполнения изобретения

Жидкий раствор рекомбинантного белка может содержать раствор любого рекомбинантного белка, полученного из культуры рекомбинантных клеток, применяя аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию или тому подобное. В предпочтительном варианте выполнения изобретения раствор представляет собой нерасфасованный раствор, который содержит раствор, который был первоначально очищен. Во всех вариантах выполнения изобретения жидкий раствор представляет собой раствор с высокой концентрацией соли, предпочтительно водный раствор.

Рекомбинантные белки включат, например и без ограничения к этому, факторы коагуляции, вирусные антигены, бактериальные антигены, грибковые антигены, протозоальные антигены, пептидные гормоны, хемокины, цитокины, факторы роста, ферменты, белки крови, такие как гемоглобин, -1-антитрипсин, фибриноген, сывороточный альбумин человека, протромбин/тромбин, антитела, факторы коагуляции и/или свертывания крови и их биологически активные фрагменты; такие как Фактор V, Фактор VI, Фактор VII, Фактор VIII и их производные, такие как FVIII с удаленным В-доменом, Фактор IX, Фактор X, Фактор XI, Фактор XII, Фактор XIII, Фактор Флетчера, Фактор Фицджеральда и Фактор фон Виллебранда; молочные белки, такие как казеин, лактоферрин, лизозим, -1 антитрипсин, белковые факторы, иммунные белки и их биологически активные фрагменты; и антитела, включая моноклональные антитела, одноцепочечные антитела, фрагменты антител, химерные антитела, гуманизированные антитела и другие варианты молекул антител, которые могут быть продуцированы в культуре рекомбинантных клеток.

Предпочтительный в настоящее время рекомбинантный белок представляет собой рекомбинантный Фактор VIII. Фактор VIII в качестве применяемого здесь включает сконструированные варианты Фактора VIII, такие как варианты Фактора VIII с удаленным В-доменом.

Нерасфасованный раствор в значении, в котором он упоминается в настоящем изобретении, содержит частично, но не полностью очищенный жидкий раствор рекомбинантного белка, который содержит по меньшей мере 100 мМ моновалентной соли. Моновалентная соль предпочтительно представляет собой NaCl, которая обычно применяется для элюирования рекомбинантных белков с очистительных колонок. Однако NaCl может быть заменен, полностью или частично, на KCl. Нерасфасованный раствор может также содержать различные количества других солей, таких как двухвалентные соли, включая хлорид кальция.

С помощью термина "частично, но не полностью очищенный" обозначают жидкий раствор, подвергнутый по меньшей мере одной стадии очищения, но этот жидкий раствор все еще содержит достаточные остаточные примеси, так что еще по меньшей мере одна стадия очищения требуется перед приготовлением конечного продукта. Например, нерасфасованный раствор рекомбинантного Фактора VIII должен быть далее очищен перед окончательным приготовлением продукта, что в случае Фактора VIII и других белков может включать лиофилизацию.

Жидкий раствор содержит, по меньшей мере, 100 мМ моновалентной соли, предпочтительно 100 мМ NaCl, более предпочтительно, по меньшей мере, 300 мМ NaCl, более предпочтительно, по меньшей мере, 500 мМ NaCl, более предпочтительно, по меньшей мере, 560 мМ NaCl и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 600 мМ NaCl. Нередко нерасфасованные растворы рекомбинантного белка имеют такую высокую концентрацию моновалентной соли после первоначальной стадии очищения.

В следующих вариантах выполнения изобретения жидкий раствор содержит 100-200 мМ NaCl, 100-300 мМ NaCl, 200-300 мМ NaCl, 100-400 мМ NaCl, 100-500 мМ NaCl, 100-600 мМ NaCl, 100-800 мМ NaCl, 300-500 мМ NaCl, 300-600 мМ NaCl, 300-800 мМ NaCl, 400-600 мМ NaCl, 400-800 мМ NaCl, 500-600 мМ NaCl, 560-700 мМ NaCl и 500-800 мМ NaCl.

Нерасфасованные растворы по изобретению, кроме того, отличаются очень низкой концентрацией белка в них. В вариантах выполнения изобретения концентрация рекомбинантного белка в нерасфасованном растворе может быть такой низкой как 0.0001 мкмоль/л, 0.001 мкмоль/л или 0.01 мкмоль/л. В вариантах выполнения изобретения концентрация рекомбинантного белка в нерасфасованном растворе может быть такой высокой как 10 мкмоль/л, 1 мкмоль/л или 0.1 мкмоль/л. Любая концентрация белка, лежащая внутри любой комбинации верхних и нижних пределов, представляет собой вариант выполнения нерасфасованного раствора в значении по изобретению.

Карбогидрат добавляют в жидкий раствор перед замораживанием в количестве, достаточном для придания раствору, при замораживании, температуры стеклования -56°C или выше, или более предпочтительно, по меньшей мере -34°C, или любой температурой, выраженной целым или дробным числом, лежащим между указанными пределами. Нормальная температура стеклования нерасфасованного раствора с высокой концентрацией соли и низкой концентрацией белка по существу составляет менее чем -56°C, например от -60 до -70°C. Количество добавляемого карбогидрата, необходимое для повышения температуры стеклования до -56°C, должно учитывать в качестве одного из факторов концентрацию белка. Более высокие концентрации белка сами по себе способствуют повышению температуры стеклования нерасфасованного раствора. В качестве других факторов количество карбогидрата не должно чрезмерно увеличивать вязкость раствора, и предпочтительно вязкость должна поддерживаться ниже, чем около 9.0 сП. Проводимость раствора может изменяться при добавлении карбогидрата и предпочтительно должна поддерживаться ниже около 39 мСм/см.

Замораживание раствора в контексте настоящего изобретения означает замораживание нерасфасованного жидкого раствора, и его необходимо отличать от лиофилизации, которая включает различные технические соображения.

Карбогидрат может относиться к типу карбогидрата, обычно применяемому в фармацевтических композициях, включая сахара и ди-, олиго- и полисахариды. Примеры включают декстраны, циклодекстраны, хитозаны, крахмалы, гиалуроновые кислоты, целлюлозу, раффинозу, мальтозу, лактозу, стахиозу и их комбинации. Предпочтительные примеры представляют собой карбогидраты, которые одобрены для инъекции, которые включают сахарозу, трегалозу, гидроксиэтилкрахмал, декстран или их комбинации. Карбогидраты фармацевтической категории доступны для приобретения на коммерческой основе у множества поставщиков.

Точное количество карбогидрата, необходимое для защиты раствора в процессе замораживания, может быть легко определено, например, с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии и зависит от конкретного белка и конкретного карбогидрата. Предпочтительные в настоящее время количества карбогидрата составляют 8-25 мас.% от массы жидкого раствора.

В конкретных вариантах выполнения изобретения количества карбогидрата составляют около 8-15 мас.%, 12-20 мас.%, 16-20 мас.%, 15-25 мас.% и 20-25 мас.% от массы жидкого раствора.

Другие компоненты вследствие первоначального очищения (например, элюирования), могут присутствовать в нерасфасованном растворе, включая поверхностно-активное вещество (например, Tween 80 или Triton-X), хлорид кальция или имидазол. Другие эксципиенты могут быть добавлены в жидкие растворы. Как показано в композициях ниже, дополнительное поверхностно-активное вещество может быть добавлено в качестве эксципиента. В качестве следующего эксципиента может быть добавлена аминокислота (например, глицин).

Примеры

Изобретение проиллюстрировано с применением рекомбинантного Фактора VIII в качестве примера рекомбинантного белка. Рекомбинантный Фактор VIII получают, применяя способы, известные в области техники, например, как описано в патентах США № 5576194; 5804420 и 5733873. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения рекомбинантный Фактор VIII продуцируют в клетках млекопитающих в крупномасштабных ферментационных реакторах, в среде, которая может быть свободна от сыворотки и/или от белка. Предпочтительно рекомбинантный Фактор VIII секретируется в среду рекомбинантными клетками.

Рекомбинантный фактор VIII (полной длины) выделяли из клеток-хозяев и очищали от осветленной тканевой культуральной жидкости путем хроматографии, осуществляемой с помощью мембранного адсорбера. Применение мембранного адсорбера позволяет выделить и концентрировать рекомбинантный Фактор VIII из тканевой культуральной жидкости путем связывания и элюирования (в общем как описано в Suck et al., J. Biotechnology, 121: 361-367, 2006.) Элюат разделили на четыре порции и каждую порцию перенесли в стерильную колбу (400 мл в каждую колбу). В дополнение к рекомбинантному Фактору VIII и остаточным примесям, которые остались, элюат (нерасфасованный раствор) содержал около 600 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂, 20 мМ имидазола и 0.1% Triton X-100. Концентрация рекомбинантного Фактора VIII в элюате составляла около 0.067 мкмоль/л.

Карбогидрат или комбинацию карбогидратов наряду с другими эксципиентами, как указано, затем добавляли в каждую колбу при комнатной температуре в количествах, показанных как Композиции 1, 2, 3 и 4 в Таблице 1 ниже.

ТАБЛИЦА 1
Композиция 1	Композиция 2	Композиция 3	Композиция 4
8% Сахарозы	15% Сахарозы	10% Гидрокси-	15% Декстрана
3% Глицина		этилкрахмала	8% Трегалозы
		8% Трегалозы
			80 чнм Tween
		80 чнм Tween

Все компоненты в Таблице 1 показаны в массовых процентах от общей массы раствора. Карбогидраты и другие эксципиенты были получены коммерческим образом. Из каждой свежеприготовленной порции был взят образец. Образцы Композиций (1), (2), (3) и (4) были оценены на активность Фактора VIII, применяя стандартный коагуляционный анализ.

Композиция 3 была приготовлена из того же элюата, но была разбавлена буфером, содержащим 20 мМ имидазола и 10 мМ CaCl₂ для уменьшения концентрации NaCl на половину. Разбавление осуществляли, чтобы исследовать пригодность способа по изобретению для раствора, имеющего более низкую, но все еще относительно высокую концентрацию моновалентной соли.

Температура стеклования каждого образца была определена, применяя дифференциальную сканирующую калориметрию (DuPont Modulated DSC). Композиции 1, 2, 3 и 4 показали температуры стеклования -56°C, -34.9°C и -35.5°C соответственно. В каждом случае температура стеклования была значительно выше, чем температура стеклования, наблюдаемая в отсутствие добавления карбогидрата (которая для такого же нерасфасованного раствора без карбогидрата, как было определено, находилась в интервале от -60 до -70°C). Композиции имели следующие вязкости: Композиция 1: 1.8428 сП; Композиция 2: 3.1089 сП; Композиция 3: 6.8076 сП и Композиция 4: 7.2123 сП. Композиции имели следующие проводимости: Композиция 1: 27.8 мСм/см; Композиция 2: 25.57 мСм/см; Композиция 3: 21.05 мСм/см и Композиция 4: 32.1 мСм/см.

Как было обнаружено, все композиции были стабильны после хранения в замороженном состоянии при температурах -80, -30, -18 и -14°C в течение до 24 недель, как определено с помощью коагуляционного анализа для активности Фактора VIII в различные моменты времени, без значительной потери активности.

Как показано на Фиг.1, все четыре композиции по изобретению поддерживали коагуляционную активность Фактора VIII на по существу начальном уровне после хранения при -30°С в течение до 24 недель.

Как показано на Фиг.2, в отсутствие дополнительных эксципиентов раствор теряет по существу всю коагуляционную активность его Фактора VIII уже через день хранения при -30°C.