средство для предпосевной обработки семян гороха

Формула изобретения

Средство для предпосевной обработки семян гороха, содержащее органическую кислоту, отличающееся тем, что оно в качестве органической кислоты содержит салициловую кислоту и дополнительно содержит липиды из мицелия гриба Ascichyta pinodes и источник магния - сульфат магния MgSO₄ или хлорид магния MgCl₂ при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Салициловая кислота	0,001
Липиды из мицелия гриба Ascichyta pinodes	0,0001
Источник магния (сульфат магния MgSO4
или хлорид магния MgCl2)	0,001
Вода	99,9979

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, а именно к средствам для предпосевной обработки семян, индуцирующим болезнеустойчивость, устойчивость к поражению вредителями и урожайность гороха.

Рациональное применение экологических средств защиты в технологиях возделывания сельскохозяйственных культур предусматривает не полное истребление вредителей и болезней, а снижение их численности до порогов вредоносности. При этом сохраняется урожай, до минимума снижается вредное воздействие как на само растение, так и на полезную фауну и флору биоценоза. В связи с этим перспективным способом защиты растений в последнее время считается применение биологических препаратов и физиологически активных веществ.

В последние годы обнаружены метаболиты фитопатогенных грибов (элиситоры), которые распознаются растением и служат ему как бы сигналом для включения ответных защитных реакций. Биогенные, т.е. выделенные из микроорганизмов, элиситоры вызывают в растительных тканях образование защитных веществ. К настоящему времени обнаружено около ста биогенных элиситоров, большинство из которых высокомолекулярные соединения липогликопротеидного комплекса (ЛГПК).

Известно средство для предпосевной обработки семян НАРЦИСС ВР, содержащее хитозан (50%), янтарную кислоту (30%), глутаминовую кислоту (80%), которое можно рассматривать как биопрепарат (Справочник пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации за 2004 год. Норма расходования средства 1 л/т, он рекомендован для использования на рисе, пшенице, ячмене, подсолнечнике, огурцах. Издательство «Агрорус», ООО »Агро 48», Липецк, стр.318) [1].

Недостатком описанного выше препарата является то, что оно не действуют на бобовые культуры, в частности на горох.

Задачей изобретения является повышение болезнеустойчивости и урожайности семян гороха.

Поставленная задача решается благодаря тому, что известное средство, содержащее органическую кислоту (салициловую), согласно изобретению дополнительно содержит липиды из мицелия гриба Ascichyta pinodes и источник магния (сульфат магния MgSO₄ или хлорид магния MgCl₂) при следующем соотношении компонентов: мас.%:

Салициловая кислота	0,001
Липиды из мицелия гриба Ascichyta pinodes	0,0001
Источник магния (сульфат магния MgSO4
или хлорид магния MgCl2)	0,001
Вода	99,9979

При обработке растений липидами патогенных грибов в растениях возрастает фитоиммунный потенциал, их ткань становится способной быстрее и интенсивнее отвечать на инфицирование возбудителями заболеваний, в результате чего вдвое подавляется распространение инфекции.

Методика выделения липидов из мицелия гриба Ascichyta pinodes

Мицелий гриба растирают в однородную массу при помощи SiO ₂. Из однородной массы проводят экстракция липидов 70% спиртом (С₂Н₅ОН) в соотношении 1 часть измельченного гриба и 9 частей спирта (1:10). Экстрагируют кипячением на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. По окончании экстракции разделяют спиртовой экстракт липидов и нерастворимый осадок гриба. Проводят повторную экстракцию на водяной бане в течение 30 мин с 70% спиртом (C₂H₅OH). Также разделяют спиртовой экстракт липидов и нерастворимый осадок гриба. Объединяют оба спиртовых экстракта липидов. Из объединенного экстракта выпаривают спирт. Выпаривание спирта проводят на водяной бане. После прекращения кипения и выделения пузырьков, колба стоит на водяной бане 15 минут (t водяной бани = 100°С) Далее берут пробу из колбы и проводят качественную реакция на присутствие этилового спирта: 1 мл испытуемого раствора, содержащий спирт, нагревают с 1 мл 1 н раствора гидроокиси калия и несколькими каплями 0,1 н раствора йода до 50°С. В присутствии этилового спирта выпадает желтый осадок йодоформа - CHCl₃. Такую же реакцию дают ацетальдегид и ацетон. Реакция была отрицательная, т.е. спирта не было. После этого отгонку спирта прекращают.

Получившийся водный экстракт охлаждают до н.у. (21-25°С), центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. По окончании центрифугирования получается осадок липогликопротеинового комплекса). Далее проводят экстракция липидов по Фолчу смесью СН₃ ОН-CHCl₃-Н₂О в соотношении 1:2:0,8 соответственно. При экстракции проводят интенсивное встряхивание в течение 1 часа. При этом система из прозрачной становится белой. Жидкость расслаивается 4 суток. Получается две фазы: водная и хлороформная. Нижняя хлороформная содержит раствор липидов, водная фаза далее не используется.

Раствор липидов в хлороформе испаряют при 30-40°С, липиды быстро взвешивают и заливают фосфатным буфером рН 7,8 (чтобы не произошло окисление двойных связей в непредельных кислотах).

Значение магния в растениях определяется его вхождением в состав хлорофилла; участием в окислительно-восстановительных процессах, обмене углеводов и органических кислот; стимулированием образования витамина С и эфирных масел.

Устойчивость растений к вирусам можно повысить, обрабатывая растения салициловой кислотой. Показано действие салициловой кислоты как фитогормона. Салициловая кислота вызывает повышение температуры в отдельных органах термогенных растений. Активно изучается роль салициловой кислоты в развитии не специфической реакции на стрессогенные факторы и накопление в клетках активных форм кислорода.

Изучение эффективности предлагаемого средства и биологической активности его компонентов проводят на тест системах с помощью измерения величины активности антиоксидантных ферментов: пероксидазы и каталазы, являющейся экспресс-методом ускоренной оценки препаратов (Метод оценки устойчивости гороха к возбудителям фузариоза и аскохитоза по биохимическим показателям / Павловская Н.Е., Шалимова О.А., Азарова Е.Ф. Орел. - Орел ГАУ, 2002, 20 с.; [2]. Павловская Н.Е., Гринблат А.И. Активные формы кислорода и апоптоз / Сельскохозяйственная биология, 2010) [3].

Показателем устойчивости гороха к патогенам может служить альтернативная оксидазная система клеток: пероксидаза и каталаза, по активности которых можно судить о жизнеспособности растений. Пероксидаза и каталаза конкурируют за субстрат - перекись водорода и активность отдельно каждого фермента зависит от работы «партнера». Как правило, с повышением активности фермента пероксидазы активность фермента каталазы снижается.

Испытания компонентов предлагаемого средства проводили на семенах гороха сортов «Норд» и «Батрак».

Обработку проводили перед проращиванием в течение двух часов.

Показания активности ферментов каталазы и пероксидазы измеряли в течение первых 10 дней проращивания, начиная с 3-го дня.

Контрольные варианты:

1 - вариант без обработки, т.е. замачивание семян гороха в течение 2-х часов в воде.

2 - Замачивание в течение 2-х часов в промышленном средстве «Нарцисс».

Варианты для испытаний (замачивание в течение 2-х часов):

1 - семена, обработанные салициловой кислотой 0,001%;

2 - семена, обработанные Mg 0,001%;

3 - семена, обработанные липогликопротеидным комплексом (ЛГПК) 0,0001%.

Пример 1.

Измерение активности фермента пероксидазы проводили на проростках гороха на 3-и, 5-е, 7-е и 10-е сутки эксперимента.

Таблица 1
Активность пероксидазы в проростках гороха сорта «Норд»
Варианты обработок	Активность пероксидазы в у.е. по суткам
3-и сутки	5-е сутки	7-е сутки	10-е сутки
Контроль, семена без обработки	69	96	101	122
Семена, обработанные средством «Нарцисс»	98	102	106	187
Семена, обработанные салициловой кислотой 0,001%	102	113	145	166
Семена, обработанные, Mg 0,001%	98	104	112	170
Семена, обработанные ЛГПК 0,0001%	96	102	123	169
Семена, обработанные предлагаемым средством	133	149	198	212

Выявлено, что в контрольном образце без обработки наблюдается самая низкая активность фермента пероксидазы, повышающаяся в течение эксперимента (69 у.е., 96 у.е, 101 у.е, 122 у.е.).

У контрольного образца с применением средства «Нарцисс» показатели активности фермента пероксидазы выше и соответствуют следующим значениям: 3-й сутки 98 у.е., 5-е сутки - 102 у.е., 7-е сутки - 106 у.е., 10-е сутки - 187 у.е. В процессе роста проростков активность пероксидазы также неуклонно повышается.

При обработке семян салициловой кислотой обнаружено, что актиность пероксидазы выше в сравнении с обоими контролями и ее активность также повышается начиная с 3-х суток по 10-е сутки (3-и сутки 102 у.е., 5-е сутки - 113 у.е., 7-е сутки - 145 у.е., 10-е сутки - 166 у.е.).

Применение магния показало и еще большую активность фермента пероксидазы с повышением ее по мере произрастания проростков (3-и сутки 98 у.е., 5-е сутки - 104 у.е., 7-е сутки - 112 у.е., 10-е сутки - 170 у.е.).

При обработке семян гороха ЛГПК активность фермента пероксидазы также повышается в процессе роста (3-и сутки 96 у.е., 5-е сутки - 102 у.е., 7-е сутки - 123 у.е., 10-е сутки - 169 у.е.).

Однако самую высокую активность пероксидазы при исследовании показали проростки гороха, семена которых обработаны предлагаемым средством (3-и сутки - 133 у.е., 5 -е сутки - 149 у.е., 7-е сутки - 198 у.е., 10-е сутки - 212 у.е.) (Табл. 1).

Таким образом, выявлено, что активность фермента пероксидазы во всех образцах повышается, однако наиболее высокое повышение происходит у образца, обработанного предлагаемым средством.

Пример 2.

Аналогичные исследования по измерению активности фермента пероксидазы проведены на сорте гороха «Батрак».

Таблица 2
Активность пероксидазы в проростках гороха сорта «Батрак»
Варианты обработок	Активность пероксидазы в у.е. по суткам
3-и сутки	5-е сутки	7-е сутки	10-е сутки
Контроль, семена без обработки	119	126	141	162
Семена, обработанные средством «Нарцисс»	138	152	166	230
Семена, обработанные салициловой кислотой 0,001%	122	145	191	211
Семена, обработанные, Mg 0,001%	120	167	182	188
Семена, обработанные ЛГПК 0,0001%	123	132	139	195
Семена, обработанные предлагаемым средством	141	151	204	235

Выявлено, что в контрольном варианте без обработки активность фермента пероксидазы повышалась со 119 у.е 3-и сутки до 162 у.е. к 10-м суткам.

В контрольном варианте с применением средства «Нарцисс» активность пероксидазы повышается со 138 у.е от 3-х суток до 200 у.е. к 10-м суткам, что выше по активности по сравнению с первым контролем.

При изучении активности пероксидазы в вариантах, обработанных салициловой кислотой, выявлено незначительное повышение активности в пределах контрольных вариантов: (3-и сутки - 122 у.е., 5-е сутки - 145 у.е., 7-е сутки - 191 у.е., 10-е сутки - 211 у.е.).

Более высокие показатели активности обнаружены при обработке семян гороха магнием (3-и сутки - 120 у.е., 5-е сутки - 167 у.е., 7-е сутки - 182 у.е., 10-е сутки - 188 у.е.).

Измерение активности фермента пероксидазы в проростках гороха под воздействием ЛГПК выявило следующие показатели: (3-и сутки 123 у.е., 5-е сутки - 123 у.е., 7-е сутки - 139 у.е., 10-е сутки - 195 у.е.) (Табл.2).

Таким образом, мы увидели идентичную картину повышения активности фермента пероксидазы на втором сорте гороха «Батрак». Причем наиболее высокие показатели выявлены также в варианте с применением предлагаемого средства.

Пример 3.

На проростках сорта гороха «Норд» проведено изучение активности фермента каталазы в тех же вариантах.

Таблица 3
Активность каталазы в проростках гороха сорта «Норд»
Варианты обработок	Активность каталазы в у.е. по суткам
3-и сутки	5-е сутки	7-е сутки	10-е сутки
Контроль, семена без обработки	3,9	3,3	3,0	1.1
Семена, обработанные средством «Нарцисс»	4,4	3,9	3,7	2,4
Семена, обработанные салициловой кислотой 0,001%	5,3	4,9	4,1	2,6
Семена, обработанные, Mg 0,001%	5,3	4,9	4,1	2,6
Семена, обработанные ЛГПК 0,0001%	6,1	4,6	4,0	2,2
Семена, обработанные предлагаемым средством	5,6	4,3	4,0	2,0

В контрольном варианте без обработки активность фермента каталазы снижается (3-и сутки - 3,9 у.е., 5-е сутки - 3,3 у.е., 7-е сутки - 3,0 у.е., 10-е сутки - 1,1 у.е.).

У контрольного образца, обработанного средством «Нарцисс», активность каталазы также снижается (3-и сутки - 4,4 у.е., 5-е сутки - 3,9 у.е., 7-е сутки - 3,7 у.е., 10-е сутки - 2,4 у.е.).

При изучении активности каталазы в вариантах, обработанных салициловой кислотой, выявлено также снижение активности фермента: (3-и сутки - 5,3 у.е., 5-е сутки - 4,9 у.е., 7-е сутки - 4,1 у.е., 10-е сутки - 2,6 у.е.).

При обработке семян гороха магнием выявлено: (3-и сутки - 5,3 у.е., 5-е сутки - 4,9 у.е., 7-е сутки - 4,1 у.е., 10-е сутки - 2.6 у.е.).

Измерение активности фермента каталазы в проростках гороха под воздействием ЛГПК выявило: (3-и сутки - 6,1 у.е., 5-е сутки - 4,6 у.е., 7-е сутки - 4,0 у.е., 10-е сутки - 2,2 у.е.).

Использование предлагаемого средства показало следующий результат (3-и сутки - 5,6 у.е., 5-е сутки - 4,3 у.е., 7-е сутки - 4,0 у.е., 10-е сутки - 2,0 у.е.) (Табл.3).

Таким образом, активность фермента каталазы по всем вариантам испытаний имеет тенденцию к снижению. Однако в контрольном варианте без обработки такое снижение происходит более скачкообразно, что может привести к стрессовым последствиям для растения. Наиболее плавное и безболезненное снижается во всех остальных вариантах.

Пример 4.

Исследовали активность фермента каталазы и на другом сорте гороха «Батрак».

Таблица 4
Активность каталазы в проростках гороха сорта «Батрак»
Варианты обработок	Сутки проведения эксперимента
3-и сутки	5-е сутки	7-е сутки	10-е сутки
Контроль, семена без обработки	4,0	2,9	3,0	2,5
Семена, обработанные средством «Нарцисс»	17,2	13,4	4,5	2,4
Семена, обработанные салициловой кислотой 0,001%	4,6	3,2	2,1	1,7
Семена, обработанные Mg 0,001%	15,1	14,1	11,3	8,8
Семена, обработанные ЛГПК	12,1	11,1	9,5	7,6
Семена, обработанные предлагаемым средством	10,4	9,3	7,8	6,4

В контрольном варианте без обработки активность фермента снижается (3-и сутки - 4,0 у.е., 5-е сутки - 2,9 у.е., 7-е сутки - 3,0 у.е., 10-е сутки - 2,5 у.е.).

У контрольного образца, обработанного средством «Нарцисс», активность каталазы также снижается (3-и сутки - 17,2 у.е., 5-е сутки - 18,4 у.е., 7-е сутки - 4,5 у.е., 10-е сутки - 2,4 у.е.).

При изучении активности каталазы в вариантах, обработанных салициловой кислотой, выявлено также снижение активности фермента каталазы: (3-и сутки - 4,6 у.е., 5-е сутки - 3,2 у.е., 7-е сутки - 2,1 у.е., 10-е сутки - 1,7 у.е.).

При обработке семян гороха магнием выявлено: (3-и сутки - 15,1 у.е, 5-е сутки - 14,1 у.е., 7-е сутки - 11,3 у.е., 10-е сутки - 8,8 у.е.).

Измерение активности фермента каталазы в проростках гороха под воздействием ЛГПК выявило: (3-и сутки - 12,1 у.е., 5-е сутки - 11,1 у.е., 7-е сутки - 9,5 у.е., 10-е сутки - 7,6 у.е.).

Обработка предлагаемым средством показывает (3-и сутки - 10,4 у.е., 5-е сутки - 9,3 у.е., 7-е сутки - 7,8 у.е., 10-е сутки - 6,4 у.е.) (Табл.4).

Таким образом, наблюдается характерное снижение активности фермента каталазы, как и на сорте гороха «Норд».

Следовательно, при изучении биологической активности компонентов предлагаемого средства на двух среднеустойчивых сортах гороха «Норд» и «Батрак», была установлена закономерность увеличения активности фермента пероксидазы и снижение активности каталазы. Проростки гороха быстро реагируют на обработку биологически активными веществами увеличением или снижением активности ферментов, что способствует усилению пероксидазозависимого иммунитета в среднеустойчивых сортах гороха.

Пример 5.

На основании проведенных лабораторных опытов для полевых испытаний было вынесено трехкомпонентное предлагаемое средство в составе: салициловая кислота 0,001%; Mg 0,001% и ЛГПК 0,0001%. Контрольные варианты: 1 - контроль без обработки, т.е. замачивание перед посевом в воде; 2 контроль - обработка производилась промышленным средством «Нарцисс».

Таблица 5
Структура урожая гороха сорта «Батрак».
Вариант обработок	Кол-во бобов шт.	% к контролю	Кол-во семян шт.	% к контролю	Вес семян г, с 1 растения	% к контролю	Масса 1000 семян г	% к контролю
Контроль, семена без обработки	2,09	-	3,81	-	14,65	-	203,99	-
Семена, обработанные средством «Нарцисс»	1,92	-8,2	3,48	-8,7	12,84	-12,3	181,84	-15,4
Семена, обработанные предлагаемым средством	2,16	+3,3	4,79	+25,0	17,59	+20,0	212,38	+1,3

Выявлено, что при проведении замачивания семян в предлагаемом средстве количество бобов на растении увеличивается до 2,16 шт. в среднем, в сравнении с контролем без обработки (2,09 шт.) и контролем с применением средства «Нарцисс» (1,92 шт.), что выше на 3,3% по сравнению с 1 контролем.

Количество семян под воздействием предлагаемого средства составляет 4,79 шт. на одном растении в среднем, что выше на 25% контроля без обработки (3,81 шт.) и 2-го контроля (3,48 шт.).

Вес семян на одном растении с применением предлагаемого средства составляет 17,59 г. Это составляет 20% прибавку в сравнении с контролем без обработки (14,65 г), а вес семян с применением средства «Нарцисс» составляет 12,84. Масса 1000 семян наиболее высокая у варианта с применением предлагаемого средства (212,38 г). (Табл. 5).

Таким образом, при анализе полученных данных видно, что количество бобов на растении, количество семян, вес семян с одного растения и масса 1000 семян наиболее высокая в варианте с использованием предлагаемого средства для замачивания семян.

Пример 6.

Таблица 6
Биологическая эффективность применения физиологически активных веществ на поражение гороха сорта Норд болезнями.
Варианты обработки	Развитие корневых гнилей, % (бутонизация)	Развитие корневых гнилей, % (плодообразование)	Ржавчина, % (развитие болезни)	Аскохитоз, % (развитие болезни)
Контроль, семена без обработки	42	71	58	28
Семена, обработанные средством «Нарцисс»	24	47	50	16
Семена, обработанные предлагаемым средством	16	46	46	12

По результатам анализа биологической эффективности предпосевной обработки семян выявлено, что развитие корневых гнилей в период бутонизации под влиянием предлагаемого средства снижается до 16%, в то время, как у контрольного образца без обработки развитие корневых гнилей составляет 42%, у образца обработанного средством «Нарцисс» 24%. К периоду плодообразования процент развития болезни увеличивается у образца, обработанного предлагаемым средством до 46%, 1-й контроль до 71%, 2 - и контроль до 47%. Развитие ржавчины наиболее низкое в образце, обработанном, предлагаемым средством и составляет 46%. Контроль 1 - 58%, контроль 2-50%. По развитию аскохитоза мы наблюдали аналогичную картину: контроль без обработки - 28%, обработка средством «Нарцисс» - 16%, обработка предлагаемым средством - 12% (Табл.6).

Таким образом, результаты анализов показали наибольшее снижение зараженности семян патогенной и сапрофитной микрофлорой под влиянием предлагаемого средства при предпосевной обработке семян.

Пример 7.

Оценить роль биопрепаратов на рост и развитие растений гороха наиболее полно позволяет такой показатель как урожайность.

Таблица 7
Урожайность гороха сорта «Батрак»
Варианты обработок	Урожайность, ц/га	% к контролю
Контроль, семена без обработки	5,62	-
Контроль, семена, обработанные средством «Нарцисс»	5,96	+6,05
Семена, обработанные предлагаемым средством	6,84	+22

При замачивании семян гороха в предлагаемом средстве мы обнаружили наиболее высокие показатели урожайности - 6,84 ц/га, превышающие контроль без обработки на 22% (5,62 ц/га). При обработке семян гороха средством «Нарцисс» урожайность несколько ниже, чем при обработке предлагаемым средством - 5,96 ц/га (Табл.7).

Таким образом, показано, что наибольшая урожайность 6,84 ц/га обнаружена при использовании предлагаемого средства при предпосевной обработке семян гороха.

Следовательно, применение исследуемых биологически активных веществ способствует повышению активности пероксидазы и снижению активности каталазы, как индикаторов увеличения устойчивости к неспецифическим патогенам, а также усиливает ростовые процессы на стадии проростков. При обработке предлагаемым средством индукционный эффект явно выражен, чем в контрольных вариантах, что делает возможным использование его в создании иммуномодулирующего средства широкого спектра действия.

Механизм действия предлагаемого средства заключается в том, что происходит активизация синтеза ферментов, в частности пероксидазы, которые приводят к усиленному образованию фитоалексинов, вызывающих формирование целого комплекса защитных реакций.

Таким образом, использование предлагаемого средства позволяет увеличить ростовые показатели, урожайность, устойчивость к болезням.