мембрана ионоселективного электрода для определения цефалоспориновых антибиотиков в лекарственных и биологических средах

Формула изобретения

Состав мембраны ионоселективного электрода для ионометрического определения цефалоспориновых антибиотиков в лекарственных и биологических средах, включающий поливинилхлорид в качестве матрицы, дибутилфталат в качестве пластификатора и электродно-активное соединение, отличающийся тем, что в качестве электродно-активного соединения использован цефуроксим-диметилдистеариламмоний при следующем соотношении компонентов, %:

Поливинилхлорид	24,31-23,87
Дибутилфталат	72,94-71,36
Электродно-активное соединение	2,74-4,5

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в контрольно-аналитических, клинических лабораториях для определения концентрации цефалоспориновых антибиотиков (цефазолина, цефотаксима, цефтриаксона, цефуроксима, цефалексина, цефиксима и др.) в исследуемых жидких средах, для стандартизации и контроля качества лекарственных средств, для определения антибиотиков в биосистемах (сыворотке крови, жидкости ротовой полости, моче и др.) с целью изучения фармакодинамики, лекарственного мониторинга для регулирования введения оптимальных доз антибиотиков при лечении различных инфекционных заболеваний.

Заявляемое устройство может быть также применено и для определения антибиотиков в пищевых продуктах, сточных водах фармацевтических производств.

Актуальным вопросом здравоохранения является контроль за качеством выпускаемых лекарственных средств. Эффективность контроля качества лекарственных препаратов, а также всестороннего их изучения обеспечивается внедрением в практику фармацевтических производств современных физико-химических методов, среди которых важное место занимает потенциометрия с ионоселективными электродами.

Объектами настоящего исследования являются цефалоспориновые антибиотики различных поколений, применяемые для лечения инфекционно-соматических патологий - инфекций мочевыводящих путей, инфекций верхних и нижних дыхательных путей и др.

Для определения цефалоспоринов: (цефазолин) в литературе предложено использовать масс-спектрометрию (плазма и моча), жидкостную хроматографию (биосреды), спектрофлуориметрию (цефалексин в плазме крови, моче), диффузию в агар (цефотаксим в сыворотке и околораневых тканях), ионную хроматографию - цефтриаксон (в крови и тканях здоровых крыс), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) (сыворотка крови, моча) [Кулапина Е.Г., Баринова О.В., Кулапина О.И. и др. Современные методы определения антибиотиков в биологических и лекарственных средах. // Антибиотики и химиотерапия, 2009. - Т.54. - № 9-10. - С.53].

Многие из этих методов требуют дорогостоящего оборудования, реактивов, высококвалифицированных операторов, отличающихся длительностью и не применимы в клинических и биохимических лабораториях для экспресс-контроля за содержанием антибиотиков.

Для определения антибиотиков в фармацевтических формах и биологических жидкостях наиболее перспективным является использование потенциометрических методов с применением различных сенсоров, например ионоселективных электродов (ИСЭ) с различными видами электродно-активных соединений (ЭАС). Метод отличается экспрессностью, селективностью, простотой и доступностью оборудования.

Для определения цефалоспориновых антибиотиков наиболее эффективным классом электродно-активных соединений (ЭАС) являются анионообменники.

Известно использование в качестве ЭАС мембран соединений бензилпенициллинтетрадециламмоний (в электродах для определения пенициллиновых антибиотиков), цефазолинтетрадециламмоний, цефотаксимтетрадециламмоний (в электродах для определения цефазолина и цефотаксима соответственно) [Кулапина Е.Г., В.Ф.Киричук, В.В.Барагузина и др. Экспрессное определение -лактамных антибиотиков в биологических средах с применением потенциометрических сенсоров. // Антибиотики и химиотерапия, 2007. - № 9-10, С.14-18].

Однако использование различных ЭАС в мембранах потенциометрических сенсоров является трудоемким: практически для каждой мембраны необходимо синтезировать собственное электродно-активное соединение (ЭАС), получать мембрану на его основе и изготавливать ионоселективный электрод для определения каждого конкретного антибиотика. Кроме того, многократный забор крови из вены практически здоровых лиц и больных через определенные промежутки времени является весьма травматичным. Определение цефалоспориновых антибиотиков в смешанной слюне (жидкости ротовой полости (ЖРП) также требует разработки эффективной мембраны для определения концентраций антибиотиков.

Известен «Состав мембраны ионоселективного электрода для определения димедрола» (АС СССР № 1749813, G01N 27/333), включающий поливинилхлорид в качестве матрицы, дибутилфталат в качестве пластификатора и электродно-активное соединение. При этом с целью обеспечения прямого потенциометрического определения димедрола в водных растворах в качестве электродно-активного соединения использована соль димедрола с анионом 12-молибдофосфорной гетерополикислоты при следующем соотношении мембранных компонентов, мас.%: поливинилхлорид 53,05-51,68; дибутилфталат 41,64-40,57; соль димедрола с анионом 12-молибдофосфорной гетерокислоты остальное.

Известны также состав мембраны и устройство электродов для определения одного из антибиотиков цефалоспориновой группы, а именно, цефуроксима в лекарственных средах, описанное в статье авторов

Мембрана выполнена с использованием в качестве ЭАС - цефуроксимтетраоктиламмония, в качестве пластификатора - 2-нитрофенилоктилового эфира, в качестве добавки - 4-третоктилфенила.

Недостатком данной мембраны является узкий спектр применения мембраны - для определения только одного вида антибиотиков цефалоспориновой группы (цефуроксима) и только в лекарственных средах. Кроме того, характерен высокий предел обнаружения цефуроксима, а именно 2,8×10^-4 M, что не позволяет применять электрод для определения антибиотика в биосредах, где содержатся более низкие концентрации антибиотика.

Задачей изобретения является создание мембраны ионоселективного электрода (ИСЭ) для экспрессного определения цефалоспориновых антибиотиков, например цефуроксима, цефалексина, цефтриаксона, цефиксима в лекарственных и биологических средах (в т.ч. жидкости ротовой полости) и создание на основе полученной мембраны ионоселективного электрода, чувствительного ко всей группе цефалоспориновых антибиотиков, для их количественного определения как в лекарственных, так и в биологических средах (в том числе ЖРП).

Техническим результатом является сокращение времени определения за счет использования одного ионоселективного электрода, чувствительного ко всей группе цефалоспориновых антибиотиков, а также за счет снижения предела обнаружения при определении концентраций цефалоспоринов в биологических средах, снижение погрешности определения результата.

Изобретение поясняется чертежами.

На Фиг1 представлена конструкция жидкоконтактного электрода, где позициями обозначены:

1 - токоотвод;

2 - селективная мембрана;

3 - поливинилхлоридная трубка;

4 - внутренний электрод сравнения;

5 - внутренний раствор сравнения: 10^-3 М р-р цефуроксима + 10 ^-1 М NaCl.

На Фиг.2 представлена зависимость ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефалоспоринов (рС): 1 - цефазолин, 2 - цефуроксим, 3 - цефтриаксон, 4 - цефалексин ЭАС цефуроксим-диметилдистеариламмоний (Cefur - DMDSA).

На Фиг.3 - зависимость ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефиксима (pC).

На Фиг.4 - Зависимость ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефуроксима (pC) для смешанной слюны.

Поставленная задача решается тем, что в составе мембраны ионоселективного электрода для ионометрического определения цефалоспориновых антибиотиков в лекарственных и биологических средах, включающем поливинилхлорид в качестве матрицы, дибутилфталат в качестве пластификатора и электродно-активное соединение, согласно предлагаемому решению в качестве электродно-активного соединения использован цефуроксимдиметилдистеариламмоний при следующем соотношении компонентом:

Поливинилхлорид	24,31-23,87%,
Дибутилфталат	72,94-71,36%,
Электродно-активное соединение	2,74-4,5%.

Как правило, для измерения ЭДС используют стандартный и индикаторный ионоселективные электроды. Конструкция индикаторного ИСЭ содержит корпус электрода, представляющего собой поливинилхлоридную трубку, внутренний электрод сравнения, в качестве которого используется серебряная проволока, покрытая слоем хлорида серебра, внутренний раствор сравнения и мембрану.

Заявляемая мембрана представляет собой эластичную пленку, содержащую порошок поливинилхлорида, предварительно растворенного в циклогексаноне, пластифицированный дибутилфтолатом, и ЭАС, а именно один из его классов - анионообменник - ионный ассоциат цефуроксим-диметилдистеариламмоний. Для обеспечения контакта между мембраной и внутренним электродом сравнения внутри корпуса размещают раствор хлорида натрия и любой антибиотик цефалоспориновой группы.

Выбор оптимального состава мембраны осуществлялся посредством экспериментального исследования свойств ее компонентов при измерении содержания цефуроксима.

Выполнение мембраны с использованием в качестве электродно-активного соединения (ЭАС) сочетания цефуроксима с диметилдистеариламмонием обеспечивает универсальность электрода, который может быть использован для определения не одного вида, а всей группы цефалоспориновых антибиотиков. Выбор в качестве индикатора именно цефуроксима, а не любого другого цефалоспоринового антибиотика обусловлен тем, что только цефуроксим вводится как внутримышечно, так и перорально, то есть его возможно использовать для определения антибиотиков и в ротовой полости, избегая инъекций и лишней травматичности.

Сочетание цефуроксима с диметилдистеариламмонием препятствует вымыванию цефуроксима и обеспечивает устойчивость всего соединения, его малую растворимость, что подтверждают экспериментальные исследования и сравнение свойств анионообменников с другими солями тетраалкиламмония (см. Таблицу 1).

Таблица 1
ЭАС	Ks	Линейность, М	Предел обнаружения, М	Угловой коэффициент
Цефуроксим + диметилдистеариламмоний	(3,5±0,4)·10-8	1·10-4-1·10-1	4,8·10-5	54-55
Цефуроксим + бензилдиметилтетрадециламмоний	(4,6±0,4)·10-5	1·10-3-1·10-1	6,9·10-4	51
Цефуроксим + бензилдиметилдодециламмоний	(1,44±0,2)·10-4	1·10-2-1·10-1	6,3·10-3	47
Где Ks - произведение растворимости анионообменников.

В результате проведенных экспериментов и изучения свойств компонентов ЭАС сделан вывод о том, что при использовании, например, в качестве ЭАС бензилдиметилтерадециламмония результаты гораздо хуже как по произведению растворимости, так и по пределу обнаружения.

Примеры выполнения мембраны с различной концентрацией ЭАС:

ЭАС с=2,75%.

В делительную воронку помещали 2 мл раствора Cefur C=1,5·10^-2 М и 4 мл диметилдистеариламмония (DMDSA) С=10^-2. Смесь встряхивали в течение 2-х часов, хлороформный слой отделяли от водной фазы в предварительно взвешенный бюкс и испаряли хлороформ на водяной бане при температуре 50-60°С с целью избежания разложения электродно-активного вещества.

Затем изготавливали мембрану с электродно-активным веществом по следующей технологии.

В бюкс емкостью 10 мл помещали 0,7966 г или 72,94% дибутилфталата, 2 мл циклогексанона и при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при небольшом нагревании 50-60°С добавляли 0,03 г или 2,75% соединения цефалоспорин-диметилдистераиламмония и 0,2655 г или 24,31% поливинилхлорида. Перемешивание продолжали до полной гомогенизации смеси. Мембранную композицию выливали в чашку Петри диаметром 67 см и оставляли на воздухе до полного удаления циклогексанона (масса мембраны 1,0921 г)

Дибутилфталат	72,94%
Поливинилхлорид	24,31%
ЭАС	2,75%

ЭАС с=3,63%.

В делительную воронку помещали 4 мл 1,5·10 ^-2 М раствора цефуроксима и 8 мл 10^-2 М диметилдистеариламмония (DMDSA) С=10^-2 М. Смесь встряхивали в течение двух часов, хлороформный слой отделяли от водной фазы в предварительно взвешенный бюкс, испаряли хлороформ на водяной бане при температуре 50-60°С.

Затем изготавливали мембрану с электродно-активным соединением (ЭАС) по следующей технологии:

В бюкс емкостью 10 мл помещали 0,7966 г. или 72,28% дибутилфталата, 2 мл циклогексанона и при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при небольшом нагревании 50-60°С добавляли 0,04 г или 3,63% соединения цефалоспорин-диметилдистеариламмоний и 0,2655 г или 24,09% поливинилхлорида. Перемешивание продолжали до полной гомогенизации смеси. Мембранную композицию выливали в чашку Петри диаметром 67 мм и оставляли на воздухе до полного удаления циклогексанона. (Масса мембраны 1,1021 г).

Дибутилфталат	72,28%
Поливинилхлорид	24,09%
ЭАС	3,63%.

ЭАС с=4,5%:

В делительную воронку помещали 4 мл раствора Cefur C=1,5·10^-2 M и 8 мл DMDSA С=10^-2 М. Смесь встряхивали в течение 2-х часов, хлороформный слой отделяли от водной фазы в предварительно взвешенный бюкс и испаряли хлороформ на водяной бане при температуре 50-60°C с целью избежания разложения электродно-активного вещества.

Затем изготавливали мембрану с электродно-активным веществом по следующей технологии.

В бюкс емкостью 10 мл помещали 0,7966 г или 71,63% дибутилфталата, 2 мл циклогексанона и при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при небольшом нагревании 50-60°C добавляли 0,05 г или 4,5% соединения цефалоспорин-диметилдистеариламмоний и 0,2655 г или 23,87% поливинилхлорида. Перемешивание продолжали до полной гомогенизации смеси. Мембранную композицию выливали в чашку Петри диаметром 67 см и оставляли на воздухе до полного удаления циклогексанона (масса мембраны 1,1221).

Дибутилфталат	71,63%
Поливинилхлорид	23,87%
ЭАС	4,5%

Полученную мембранную композицию использовали для изготовления жидкоконтактных электродов: вырезали диски диаметром 7 мм и приклеивали их к зачищенному и отполированному поливинилхлоридному корпусу клеем, содержащим 0,5 г поливинилхлорида, 0,25 г дибутилфталата и 5 мл циклогексанона. После высыхания клея внутрь трубки заливали 1 мл стандартного 1·10^-1 М раствора хлорида натрия и 1 мл 1·10^-3 М раствора соответствующего антибиотика (соотношение по объему 1:1). Изготовленные таким образом электроды кондиционировали в течение суток в 1·10^-3 М растворе соответствующего антибиотика.

При ионометрическом измерении концентрации антибиотиков цефалоспориновой группы используют индикаторный электрод, который размещают в растворе антибиотика, затем калибруют путем измерения электродных потенциалов (ЭДС) электрохимической цепи, составленной из индикаторного ИСЭ и стандартного хлоридсеребряного электрода по растворам антибиотика с известной концентрацией (стандартного), например цефуроксима.

Измеряли зависимость величины ЭДС от концентрации растворов цефалоспоринов при pH 6-7.

На Фиг.2 представлен график зависимости ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефалоспоринов (pC): 1 - цефазолин, 2 - цефуроксим, 3 - цефтриаксон, 4 - цефалексин) ЭАС цефуроксим-диметилдистеариламмоний (Cefur - DMDSA).

При этом анионные функции выполняются в интервале концентраций цефалоспоринов 1*10^-1-1*10^-4 (1*10 ^-5) М с угловыми коэффициентами 59±2 мВ/pC для цефазолина, цефалексина, цефуроксима, цефотаксима, цефиксима и 29±3 мВ/pC для цефтриаксона (динатриевая соль, содержащая двухзарядный анион). Эти показатели свидетельствуют, что электрод реагирует на цефалоспориновые антибиотики в соответствии с уравнением Нернста, лежащего в основе потенциометрического метода.

Чувствительность (селективность) электрода к цефалоспориновым антибиотикам и неорганическим анионам, входящим в состав биологических сред (жидкость ротовой полости, плазма крови), поясняется Таблицей 2, в которой представлены коэффициенты потенциометрической селективности: основной ион - цефуроксим, мешающие ионы - цефазолин (Cef), цефалексин (Cefl), неорганические ионы. ЭАС Cefur - DMDSA.

Таблица 2
Мешающий ион	К сел
Cl-	(6.61±0.25)·10 -2
Br-	(8.92±0.10)10 -2
НСО3	(6.31±0.15)10-2
Н2РО4 -	(7.94±0.21)10-2
НРО4 2-	(6.31±0.20)10-2
J-	(8.32±0.15)10 -2
Cef	(1.78±0.10) 10-1
Cefl	(6.63±0.20) 10-1

Данные Таблицы 2 свидетельствуют о возможности применения электрода на основе выбранного ЭАС для определения цефалоспориновых антибиотиков в биологических средах.

Пример применения электрода с заявляемой мембраной в лекарственных средах

Наиболее показателен пример определения цефалоспориновых антибиотиков на примере определения цефиксима в суспензиях с целью установления срока его годности.

Для определения цефиксима, который используется в виде суспензии при лечении детей, также использвали электрод с ЭАС цефуроксим + диметилдистеариламмоний.

Навеску массой 2,835 г сухого цефиксима растворяли в мерной колбе объемом 25 мл (концентрация антибиотика 1·10 ^-2 М). Растворы 1·10^-3-1·10^-5 М готовили из 1·10^-2 М раствора последовательным разбавлением в мерных колбах вместимостью 25 мл. Проводили измерение ЭДС с индикаторным и хлоридсеребряным электродами.

На Фиг.3 представлена зависимость ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефиксима (pC).

Определение цефиксима в суспензии (СУПРАКС). Для приготовления трех проб различной концентрации отбирали 1; 1,5 и 2 мл суспензии и растворяли в мерных колбах вместимостью 25 мл. Проводили измерение ЭДС с индикаторным и хлоридсеребряным электродами и по зависимости ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефиксима (pC) определяли концентрацию цефиксима в суспензии. Расчет содержания цефиксима в суспензии проводили по формуле:

m=C·M,

где C_x - концентрация цефиксима, найденная по градуировочному графику, М;

V_ал - объем аликвоты, мл;

М - молярная масса цефиксима, 453,5 г/моль;

m - рассчитанная масса цефиксима, г.

Таким образом, применение в качестве ЭАС цефуроксим + диметилдистеариламмония позволяет определять основное вещество в лекарственных препаратах СУПРАКС, используемых в виде суспензии, что особенно важно из-за ограниченного срока хранения суспензии.

Пример применения электрода с заявляемой мембраной в жидкости ротовой полости

Выбор оптимального состава мембраны осуществлялся посредством экспериментального исследования свойств ее компонентов при измерении содержания цефуроксима в жидкости ротовой полости (ЖРП) больных с инфекционно-соматической патологией.

При использовании электродов для определения цефуроксима в ЖРП индикаторный электрод предварительно кондиционировали в ЖРП практически здорового человека в течение 20-30 мин. Для приготовления 10^-2 М раствора цефуроксима навеску 0,193 г растворяли в дистиллированной воде в мерной колбе на 25 мл. Последовательным разбавлением готовили растворы 10^-3-10^-5 М, отбирали 0,3 мл водных растворов цефуроксима и до 3 мл разбавляли ЖРП, перемешивали и измеряли ЭДС с индикаторным и хлоридсеребряным электродами.

Пробу ЖРП практически здоровых лиц отбирали спустя 1-2 часа после приема пищи, перед сбором ротовую полость ополаскивали водой. Смешанную слюну центрифугировали в течение 15 мин при 3500 об/мин. Для приготовления серии растворов антибиотиков V=3 мл на фоне ЖРП с внесенными добавками антибиотиков концентрации 5·10^-5, 1·10^-4, 1·10 ^-3 М (с учетом разбавления) отбирали 2,7 мл надосадочной жидкости, переносили в стаканчики для измерения и добавляли по 0,3 мл раствора соответствующего антибиотика с концентрацией 5·10^-4, 1·10^-3, 1·10 ^-2 М (внесенные добавки), перемешивали и проводили измерения ЭДС.

С учетом разбавления строили график зависимости ЭДС, мВ, от отрицательного логарифма концентрации антибиотика.

Интервал линейности электродной функции составил: 10^-3-10^-4 М, а предел обнаружения цефуроксима 5·10^-5 М. Полученные градуировочные характеристики являются воспроизводимыми и увеличение времени кондиционирования не влияет на них.

Установлено уменьшение интервала линейности и углового коэффициента электродной функции в ЖРП вследствие высокой ионной силы раствора и «белкового отравления» поверхности мембран. Зависимость ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефуроксима (pC) для смешанной слюны представлена на Фиг.4.

Аналогичным образом готовили жидкость ротовой полости больных с инфекционно-соматической патологией и по графику зависимости ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефуроксима (pC) определяли концентрацию антибиотика. Расчет содержания цефуроксима в ЖРП проводили по следующей формуле:

C=C_x·M·1000,

где Сх - концентрация антибиотика, найденная по градуировочному графику, М;

М - молярная масса антибиотика, 453,5 г/моль.

С учетом сложности анализируемых объектов и самого определяемого вещества достоверность полученных результатов при выборе оптимального состава мембраны оценивалась следующим образом. В пробу ЖРП здорового человека вводили определенную добавку стандартного раствора цефуроксима и далее пробу проводили через все операции пробоподготовки. Относительная погрешность определения не превышала 4-6%.

Заключительный вывод

Полученные значения коэффициентов потенциометрической селективности позволили сделать прогноз о возможности применения разработанных ионоселективных электродов на основе ионного ассоциата цефуроксим-диметилдистеариламмоний для определения цефуроксима, цефазолина, цефтриаксона, цефалексина, цефиксима в лекарственных формах и биологических жидкостях при высоких концентрациях ионов Cl, HCO₃, Br, H₂HO₄, НРО ₄.

Полученная мембрана ИСЭ благодаря изученным в результате проведенных экспериментов свойствам выбранных компонентов ЭАС характеризуется низкой растворимостью ЭАС (произведение растворимости равно 3,5+0,4)10^-8). Это имеет большое значение, так как чем ниже растворимость ЭАС, тем выше чувствительность электрода.

Полученная мембрана обеспечивает широкий диапазон определяемых содержаний антибиотика, а именно 10^-4 -10^-1 М. При этом выявленные в результате проведенных экспериментов высокие свойства используемого в мембране ЭАС обеспечивают низкий предел обнаружения антибиотика, а именно 4,8×10 ^-5 М. Это позволяет использовать электрод для анализа антибиотика не только в лекарственных препаратах, где концентрация антибиотика высокая, но и в биологических средах (в том числе для изучения фармакокинетики цефалоспоринов), где концентрация антибиотика предельно низкая.

В результате угловой коэффициент электродных функций в растворах цефуроксима составляет 54-55 мВ/pc.

Таким образом, полученная мембрана ИСЭ расширяет функциональные возможности экспрессного определения антибиотиков в лекарственных формах и биологических жидкостях за счет расширения спектра исследуемых объектов - цефалоспориновых антибиотиков. Полученная мембрана обеспечивает экспрессность, возможность определения активной концентрации антибиотиков в широком концентрационном интервале и дает возможность определения любого вида антибиотиков цефалоспориновой группы у больных с инфекционно-соматической патологией.

Благодаря устойчивости полученного ЭАС обеспечивается широкий интервал линейности функций и низкий предел обнаружения антибиотиков.