способ прогнозирования риска развития гиперплазии эндометрия у женщин с генитальным эндометриозом

Формула изобретения

Способ определения риска развития гиперплазии эндометрия у женщин с генитальным эндометриозом, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, получение данных о генетическом полиморфизме -308G/A фактора некроза опухоли , прогнозирование риска развития гиперплазии эндометрия при генитальном эндометриозе на основе анализа полиморфизма гена -308G/A TNF в зависимости от выявленного аллеля: в случае выявления аллеля -308 А, больные генитальным эндометриозом имеют высокий риск развития гиперплазии эндометрия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития гиперплазии эндометрия у женщин с генитальным эндометриозом на протяжении всей жизни.

Основная задача молекулярно-генетического типирования локусов генов цитокинов - это определение единичных нуклеотидных замен в генах, которые вызывают изменения уровня продукции цитокинов, что может влиять на развитие более выраженного воспалительного процесса.

Эндометриоз - это патологический процесс, при котором за пределами полости матки происходит доброкачественное разрастание ткани, по морфологическим и функциональным свойствам подобное эндометрию (Missmer S.A. et al., 2003, Адамян Л.В. и др., 2006). В структуре гинекологической заболеваемости генитальный эндометриоз прочно удерживает третье место после воспалительных заболеваний и миомы матки. Эндометриоз приводит к значительным нарушениям репродуктивной функции, стойкому болевому синдрому, а в тяжелых случаях - к нарушению функции смежных органов и инвалидизации (Баскаков В.П. и др., 2002, Treloar S.A. et al., 2005, Адамян Л.В. и др., 2006).

Гиперпластические процессы эндометрия - это патологическая диффузия или очаговая пролиферация железистого эпителия слизистой оболочки матки (Гинекология: учебник/под ред. Г.М.Савельевой, В.Г.Бреусенко. - М.: ГЭОТАР. Медиа. 2005. - 432 с.).

Патологическая трансформация эндометрия диагностируется по данным литературы (Ищенко А.И. и др., 2008) в 31,8%-35% наблюдений в сочетании с внутренним эндометриозом, в структуре которой преобладают полипы эндометрия на фоне неизмененной слизистой матки (56%), а также различные разновидности гиперплазии в сочетании с полипами эндометрия (44%). Развитие гиперплазии эндометрия при генитальном эндометриозе может приводить к циклическим и ациклическим маточным кровотечениям, контактным кровотечениям, формированию хронического метроэндометрита, развитию бесплодия и анемизации больных.

Согласно экспериментальным и клиническим данным важную роль в развитии гиперплазии эндометрия и эндометриоза играют цитокины, в частности фактор некроза опухоли (Pierro E. et al., 2001, Сидорова И.С. и др., 2007).

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе не обнаружено способа прогнозирования риска развития гиперплазии эндометрия при генитальном эндометриозе на основе данных о полиморфизме гена TNF .

Известен способ диагностики гиперпластических процессов эндометрия у больных миомой матки, заключающийся в определении показателей каталазы, каталазного числа, малонового диальдегида в супернатанте смыва из полости матки или менструальной крови одномоментно. При снижении значений каталазного числа до 2,53±0,16 ед., показателя каталазы до 0,71±0,05 ед. и увеличении значения малонового диальдегида до 0,49±0,06 нмоль диагностируют нормальное строение эндометрия у больных миомой матки; при снижении значений каталазного числа до 1,8±0,33 ед., показателя каталазы до 0,44±0,09 ед. и нарастании значения малонового диальдегида до 1,68=1=0,23 нмоль диагностируют гиперплазию эндометрия у больных миомой матки; при снижении значения каталазного числа до 0,68±0,2 ед., показателя каталазы до 0,2±0,09 ед. и нарастании значения малонового диальдегида до 3,01±0,85 нмоль диагностируют атипическую гиперплазию эндометрия у больных миомой матки (RU № 2007101040, публ. 09.01.2007).

Известен способ диагностики гиперпластических процессов эндометрия, включающий количественное определение содержания биологически активных веществ в крови, определяют количество лизосомального фермента b-D-глюкуронидазы и при уровне от 0,01 до 0,02 нмоль/мин/мг диагностируют гиперплазию эндометрия (RU № 2159441, публ. 20.11.2000).

Известен способ ранней диагностики доброкачественных гиперпластических процессов эндометрия, включающий забор венозной крови, анализ ее на содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малонового диальдегида, дополнительно в эритроцитах определяют первичные продукты перекисного окисления липидов: гидроперекиси (ГП) и диеновые конъюгаты (ДК), активность ферментов антиоксидантной системы: глутатионпероксидазы (ГП) и каталазы (Кат), рассчитывают соотношение показателей ГП/ДК, Кат/ДК и при значении первого соотношения 11-14, второго - 14-15 диагностируют доброкачественные гиперпластические процессы эндометрия (RU № 2190221, публ. 27.09.2002).

Недостатком известных способов является то, что они решают задачу диагностики гиперпластических процессов эндометрия, а не прогнозирования риска развития гиперплазии эндометрия при генитальном эндометриозе.

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования риска развития гиперплазии эндометрия у женщин с генитальным эндометриозом на основании определения генетического полиморфизма фактора некроза опухоли (-308G/A TNF ).

Технический результат использования изобретения - получение в кратчайшие сроки неинвазивным способом критериев прогноза риска развития гиперплазии эндометрия у женщин с генитальным эндометриозом, позволяющих определить тактику ведения больных с данной патологией: динамический контроль состояния эндометрия (с использованием ультразвукового, пайпель-биопсического, гистероскопического и других методов исследования) с целью раннего выявления и своевременного лечения гиперплазии эндометрия у больных генитальным эндометриозом.

Поставленная задача решается с помощью способа определения риска развития гиперплазии эндометрия у женщин с генитальным эндометриозом, включающего выделение ДНК из периферической венозной крови, получение данных о генетическом полиморфизме -308G/A фактора некроза опухоли , прогнозирование риска развития гиперплазии эндометрия при генитальном эндометриозе на основе анализа полиморфизма гена -308G/A TNF в зависимости от выявленного аллеля: в случае выявления аллеля -308 А больные генитальным эндометриозом имеют высокий риск развития гиперплазии эндометрия.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность определения риска развития гиперплазии эндометрия у женщин с генитальным эндометриозом на основе анализа генетического полиморфизма -308G/A TNF .

Способ осуществляют следующим образом: ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных генитальным эндометриозом в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-НСl (рН 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaСl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С. Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. Нуклеотидная последовательность типируемого локуса TNF (-308G/A) включает 80 п.н. (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Анализ локуса -308G/A TNF осуществляют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М», олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей. Структура праймеров и зондов, использованных для генотипирования ДНК-маркеров методом ПЦР, представлена в таблице 1.

Таблица 1
Ген	Полиморфизм и его локализация в гене	Структура праймеров	Литература
TNF	-308G/A (промотор)	F: 5'-GAAATGGAGGCAATAGGTTTTGAG-3'	(Hulkkonen J., 2002)
R:5'-GGCCACTGACTGATTTGTGTGTAG-3'
5'-FAM-CCGTCCTCATGCC-RTQ 1-3'
5'-ROX-CCGTCCCCATGCC-RTQ 1-3'

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза полиморфного локуса -308G/A TNF выполняется в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-НСl (рН 8,8), 2,5 мМ MgCl₂, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин при 52°С; денатурация - 15 сек при 95°С.

При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе IQ5) генотипирование осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствовал аллелю G, зонд с красителем FAM - аллелю А.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси х) относительно RFU для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей.

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси у).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю А (RFU аллеля А отложены по оси x).

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляли с использованием программы «STATISTICA 6.0». Взаимосвязи между клинико-патогенетически значимыми признаками генитального эндометриоза и полиморфизмом гена TNF оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия ² с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI).

Возможность использования предложенного способа для определения прогноза развития гиперплазии эндометрия у женщин при генитальном эндометриозе подтверждает анализ результатов наблюдений 230 больных генитальным эндометриозом и 248 женщин контрольной группы. Пациентки включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью лабораторно-инструментальных и гистологических методов обследования (возраст варьировал от 18 до 60 лет, средний возраст составил 36,8±8,5 лет). Контрольную группу составили 248 практически здоровых женщин в возрасте от 20 до 60 лет (средний возраст 41,2±7,5 лет), отобранных по национальному составу (русские) и месту рождения (уроженки Центрального Черноземья) соответственно группе больных генитальным эндометриозом. Таким образом, группа популяционного контроля не отличалась от группы больных по полу, возрасту (р>0,05), месту рождения и национальности.

Проведен анализ распределения исследуемых молекулярно-генетических маркеров у женщин с генитальным эндометриозом в зависимости от его сочетания с гиперплазией эндометрия. Установлено, что среди 230 пациенток с генитальным эндометриозом простая гиперплазия эндометрия без атипии была выявлена у 42 больных (18,1%) и 188 (81,9%) пациенток с генитальным эндометриозом не имели гиперплазии эндометрия.

При анализе распределения генетического полиморфизма -308G/A фактора некроза опухоли среди исследуемых групп женщин установлено, частота аллеля -308 A TNF у женщин с генитальным эндометриозом, имеющих гиперплазию эндометрия, составила 19,05%, что в 1,8 раза превышает аналогичные показатели в других сравниваемых группах: контрольная группа - 10,08% ( ²=4,87, p=0,03), больные генитальным эндометриозом без гиперплазии эндометрия - 10,64% ( ²=3,79, p=0,05) (фиг.1). Следует отметить, что отношение шансов развития гиперплазии эндометрия у больных генитальным эндометриозом при наличии генетического маркера -308 А TNF составляет OR=2,10 при доверительном интервале 95% CI 1,08-4,05 (p=0,03).

Частоты аллеля -308 А TNF в группах больных эндометриозом в зависимости от его сочетания с гиперплазией эндометрия и в контрольной группе (%) представлены на фиг.1.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что поставленная задача - разработка способа прогнозирования риска развития гиперплазии эндометрия у женщин с генитальным эндометриозом на основании определения генетического полиморфизма фактора некроза опухоли (-308G/A TNF ) решена. Выявление аллеля -308 А TNF свидетельствует о риске развития гиперплазии эндометрия у пациенток с генитальным эндометриозом (OR=2,10).

Предложенный способ прогнозирования малоинвазивен, не требует больших затрат времени, прост в исполнении.