штамм бактерии lactobacillus reuteri okt, используемый для производства пробиотических препаратов для сельскохозяйственной птицы

Формула изобретения

Штамм бактерии Lactobacillus reuteri okt, депонированный под регистрационным номером ВКПМ В-10609, используемый для производства пробиотических препаратов для сельскохозяйственной птицы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности при производстве пробиотических препаратов, используемых в птицеводстве для лечения и профилактики болезней сельскохозяйственной птицы.

В последние годы все большее применение в птицеводстве находят пробиотики - кормовые добавки на основе штаммов живых микроорганизмов, оказывающие при естественном способе введения позитивное воздействие на физиологические, биохимические и иммунные реакции хозяина через стабилизацию и оптимизацию функции его нормальной микрофлоры. Они применяются при дисбактериозах, для регулирования микробиологических процессов в пищеварительном тракте, профилактики и лечения некоторых расстройств пищеварения инфекционной и алиментарной этиологии, как заменители антибиотиков и т.д. По эффективности действия пробиотики не уступают некоторым антибиотикам и химиотерапевтическим средствам, но они не оказывают губительного действия на микрофлору пищеварительного тракта, не загрязняют продукты животноводства и окружающую среду, то есть являются экологически чистыми.

К настоящему времени известны различные штаммы лактобактерий, входящие в состав пробиотических препаратов, используемые для лечения и профилактики болезней сельскохозяйственной птицы.

Известен рекомбинантный штамм Lactobacillus species 8 РАЗ (pLF-SL2), экспрессирующий соматолиберин в пищеварительном тракте (заявка RU 2002111437/13, опубл. 20.06.2004). Штамм используют в составе пробиотического препарата для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и улучшения качества продукции. Однако достижение результата использование штамма - повышение продуктивности, достигается благодаря генной модификации штамма, обеспечивающей способность экспресировать соматолиберин в пищеварительном тракте.

Известно средство для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта цыплят, содержащее симбиотическую систему штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus Д-75 и Д-76 препарата «Витафлор», энрофлоксацин и твин-80 при следующем соотношении ингредиентов (мас. %): симбиотические микроорганизмы препарата «Витафлор» - 10-20; энрофлоксацин - 75-85; твин-80 - 1-2 (патент RU 2371190, опубл. 27.10.2009). Средство снижает падеж молодняка птиц и способствует повышению среднесуточного привеса цыплят на 10-15%.

Недостатком известного средства является риск развития антибиотикорезистентности к энрофлоксацину, так как использование этого препарата сопровождается обязательным вводом антибиотика -энрофлоксацина, при этом использование симбиотических микроорганизмов препарата «Витафлор» сопровождается одновременным применением только одного антибиотика, что сужает круг инфекционных агентов до тех, которые чувствительны только к энрофлоксацину.

Известно пробиотическое средство для сельскохозяйственных животных и птицы, содержащее смесь суспензий штаммов бактерий и защитную среду при следующем соотношении компонентов, мас.%: сахароза 15, желатин 5,9% раствор хлорида натрия 80. В качестве смеси суспензий штаммов средство содержит суспензии следующих штаммов, мас.%: Azomonas agilisc B-2586 - 8, Azotobacter chroococcum B-3162 - 7, Azotobacter vinelandii B-2587 - 7, Bacillus subtilis B-5225 - 7, Bacillus subtilis B-4828 - 9, Bifidum bacterium globosum B-2584 - 10, Escherichia coli B-4412 - 8, Enterococcus faecium B-2898 - 7, Lactobacillus acidophilus B-3488 - 7, Lactobacillus acidophilus B-2585 - 7, Propionibacterium freudenreichii B-6561 - 7, Pseudomonas sp.B-3908 - 7, Pseudomonas sp.B-2589 - 7, Saccharomyces cerevisiae Y-365 - 2 (патент RU 2326692, опубл. 20.06.2008). Средство позволяет нормализовать микробиоценоз кишечника здоровых животных и птицы, сократить заболеваемость гнойно-воспалительного и диспепсийного характера, снизить падеж и повысить прирост массы тела у молодняка.

Недостатком известного средства является применение в составе препарата микроорганизмов, обладающих антагонистиченской в отношении друг друга активностью (например E.coli и Lactobacillus acidophilus), а также оказывающих взаимно-противоположный биологический эффект на организм, например, лактобактерии и пропионовокислые бактерии чаще подавляют воспалительные процессы, в то время как Bacillus subtilis, Escherichia coli, как правило, обладают противовоспалительной активностью и повышают реактивность иммунной системы.

Известен пробиотик лактомикроцикол для выращивания и откорма цыплят-бройлеров, содержащий микробную биомассу штаммов бактерий Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 (ВКПМ, В-6253) и Escherichia coli S 5/98 (ВКПМ, В-8564), взятых в соотношении 1:1 при концентрации колонии образующих единиц (к.о.е.) каждого штамма в пределах 5×10⁸-5×10⁹ в 1 мл жидкого или 1 г сухого препарата. Лактобацилярный штамм обладает широким спектром антагонистической активности и множественной антибиотикорезистентностью, а кишечная палочка продуцирует микроцин В 5/98, подавляющий условно-патогенные и патогенные бактерии родов Escherichia и Salmonella.

Недостатком известного средства является то, что оба штамма не являются представителями нормальной микрофлоры кишечника птицы и, соответственно, не способны размножаться и накапливаться в кишечнике в течение длительного времени.

Актуальной задачей на сегодняшний день является поиск новых штаммов молочнокислых бактерий, являющихся представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы, обладающих устойчивостью к антибиотикам и способных сократить заболеваемость сельскохозяйственной птицы.

Наиболее перспективными для использования являются штаммы бактерий Lactobacillus reuteri, являющиеся природными обитателями желудочно-кишечного тракта животных и птиц и обладающие антибактериальной и противовоспалительной активностями. При выращивании клеток L. reuteri в анаэробных условиях в присутствии глицерина они продуцируют противомикробное вещество, известное как рейтерин (бетта-гидроксипропиональдегид). Так как у разных видов животных штаммы Lactobacillus reuteri различаются, то для лечения сельскохозяйственной птицы следует использовать штаммы, изолированные из желудочно-кишечного тракта соответствующих видов птиц (Casas I.A., Dobrogosz W.J. Lactobacillus reuteri: An overview of a new probiotic for humans and animals. Microecol Therap, 1997, 25, 221-231).

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является штамм Lactobacillus reuteri Pg4, продуцирующий -глюконазу, использующийся в составе пробиотического препарата для цыплят (В. Yu, J.R.Liu, F.S.Hsiao and P.W.S.Chiou Animal Feed Science and Technology, V.141, Issues 1-2, 1 March 2008, P.82-91). Штамм Pg4 является рекомбинантным суперпродуцентом фермента -глюконазы и предназначен для повышения эффективности усвоения растительных кормов, богатых некрахмалистыми полисахаридами.

Недостатком известного штамма является то, что он не предназначен для использования одновременно с проведением курсов антибиотикотерапии и профилактики, а также то, что этот штамм является генно-модифицированным, что ограничивает его применение.

Технической задачей изобретения является получение бактериального штамма, являющегося природным обитателем желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственной птицы и обладающего устойчивостью к антибиотикам.

Поставленная техническая задача достигается получением штамма Lactobacillus reuteri okt, обладающего устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, в частности к колистину, энрофлоксацину, норфлоксацину, тетрациклину, фуразолидону, а также продуцирующего фермент эстеразу.

Предлагаемый штамм выделен из природного материала желудочно-кишечного тракта курицы в результате целенаправленного систематического поиска.

Полученный штамм Lactobacillus reuteri okt депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика) под регистрационным номером ВКПМ В-10609.

Штамм Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки: грамм положительные короткие палочки и/или коккобактерии растут на среде MRS. Колонии серовато-белые с ровной поверхностью ровным краем.

Физиолого-биохимические признаки: факультативный анаэроб, для сельскохозяйственной птицы и лабораторных животных непатогенен. Токсигенность при инокуляции суточной культуры внутрибрюшинно белым мышам в концентрации 1×10⁶ кое/мл не обнаружена. Штамм продуцирует в культуральную среду фермент эстеразу, устойчивую к нагреванию при температуре 90°С в течение 10 минут.

Штамм характеризуется резистентностью к терапевтическим концентрациям колистина, энрофлоксацина, норфлоксацина, тетрациклина, фуразолидона. Чувствителен к амоксициллину, левомицетину, рифампицину.

Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж.Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А.Заварзина). - М., 1997], а также на основе секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНК.

Хранение штамма осуществляют в лиофильно высушенном состоянии или в растворе 30% глицерина при температуре -60°С.

Для культивирования штамма применяют среду МРС (Ман, Рогоза, Шарп) следующего состава (г/л): гидролизат обезжиренного молока ферментативного сухого (ГОМ) в виде мелкодисперсного гигроскопического порошка бело-серого цвета 33,0; марганец сернокислый 0,1; магний сернокислый 0,4; калий фосфорнокислый двузамещенный 4,0; цистеин 0,4; глюкоза 40,0; пептон 20,0;

дрожжевой гидролизат 0,01; натрий уксуснокислый 10,0; аммоний лимоннокислый двузамещенный 4,0; агар микробиологический 2,0. Выход биомассы составляет 5 г/л среды.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является его устойчивость к антибиотикам - тетрациклину, колистину, энрофлоксацину, фуразолидону, а также способность продуцировать в культуральную жидкость термостабильную эстеразу, устойчивую к нагреву до 90С в течение 10 минут и способную гидролизовать субстрат - флюоресцеина диацетат с образованием флюоресцеина, что позволяет использовать этот признак в качестве штамм-специфического, а также использовать эстеразную активность для контроля стабильности характеристик культуры при производстве и хранении.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и он характеризуется уникальным спектром устойчивости к антибиотикам, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выращивание штамма Lactobacillus reuteri okt и выделение фермента эстеразы.

Для получения биомассы клетки штамма-продуцента переносили на агаризованную среду МРС в чашку Петри и инкубировали в течение ночи при 37°С. Свежевыращенные колонии переносили стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду МРС и культивировали при 37°С до достижения стационарной фазы роста. Выход биомассы составил 5 г/л среды. Выделение и очистку фермента производили следующим образом: 1 г сырой биомассы ресуспендировали в 50 мл 50 мМ ТрисHCl буфера рН 7.2-7.4, содержащего 20 мМ ЭДТА. Суспензию клеток охлаждали на льду и разрушали ультразвуком в течение 3 минут с частотой 20 кГц. Полученную суспензию центрифугировали со скоростью 9 тыс.об/мин, в течение 15 минут при +5°С. Надосадочную жидкость переносили в другие пробирки, а осадок выбрасывали. Липиды и жирорастворимые компоненты удаляли путем добавления к экстракту холодного хлороформа в соотношении 1:5, пробирку с экстрактом тщательно встряхивали и оставляли на 3 часа при +5°С. Пробирку центрифугировали со скоростью 9 тыс.об/мин, в течение 15 минут при +5°С, водную фазу переносили в другую пробирку. К раствору белков добавляли аммоний сернокислый до 70% насыщения и инкубировали при +5°С в течение 16 часов. Высалившиеся белки осаждали центрифугированием со скоростью 9 тыс.об/мин, в течение 15 минут при +5°С. Надосадочную жидкость переносили в диализный мешок и удаляли аммоний сернокислый диализом при +5°С против 10 кратного объема 50 мМ ТрисНСl буфера рН 7.2-7.4, содержащего 20 мМ ЭДТА в течение 3 часов на магнитной мешалке. Процедуру диализа повторяли три раза, меняя буферный раствор. Для удаления белков крупнее 20 кДа препарат фермента подвергали ультрафильтрации через мембрану с пропускной способностью более 20 кДа. Полученный препарат фермента тестировали на активность с субстратом к щелочной фосфатазе и эстеразе. Выход фермента составил не менее 1000 ед. на 1 мл.

Пример 2. Изучение устойчивости к антибиотикам штамма Lactobacillus reuteri okt.

Антибиотикорезистентность заявляемого штамма лактобактерии определяли диско-диффузионным методом на кровяном агаре с селективной добавкой для выделения лактобактерии фирмы «Biolot». Для этого на поверхность кровяного агара сплошным газоном рассевали культуру лактобактерии. На агар помещали диски с различными антибиотиками. Учет проводили по зонам отсутствия или подавления роста антибиотика вокруг диска с клетками штамма. Результаты приведены в табл.1.

Таблица 1
Наименование антибиотика	результат теста, мм
ампициллин	0
польодоксин	0
метронидазол	0
амоксиклав	32
доксициклин	30
левомицетин	30
рифампицин	22
офлоксацин	0
энрофлоксацин	0
тетрациклин	0
спектиномицин	16
энроколи	20
фуразолидон	10
левомицетин	24
пенициллин	10
эритромицин	28
флорфеникол	35
колистин	0
клиндамицин	0
флубактин	0
гентамицин	14

Из таблицы 1 видно, что новый штамм Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 проявляет устойчивость в отношении широкого спектра антибиотиков: тетрациклину, колистину, энрофлоксацину, фуразолидону.

Пример 3. Исследование токсичности штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt.

Острую и хроническую токсичность штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 изучали на белых мышах массой 20-22 г согласно утвержденной методике (Л.П.Маланин и др. «Методические указания по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве», М., 1988). Для определения острой токсичности было сформировано 6 групп животных по 6 голов в каждой. Перед началом эксперимента мышей выдерживали на карантине в течение 14 дней. Для испытания использовали культуру клеток заявляемого штамма в виде суспензии клеток с концентрацией бактерий не ниже 1×10⁶ кое/мл. Испытуемую культуру вводили непосредственно в желудок с помощью шприца с тупой иглой, на конце которой наплавлено олово в количестве 0,8-2 мл на животное. Наблюдение за животными вели в течение 14 дней, отмечая признаки интоксикации и количество погибших животных.

Для изучения хронической токсичности заявляемого штамма были сформированы 4 группы белых мышей по 10 голов в каждой с живой массой 20-22 г. Мыши содержались на обычном рационе питания в виварии. Каждый день на протяжении 2,5 месяцев в питьевую воду мышам добавляли испытуемую культуру: в первой группе - в дозе 0,5 мл на голову, во второй группе - 0,8 мл; в третьей - 1,0 мл. Четвертая группа служила контролем, мышам давали питьевую воду без добавок. В ходе эксперимента учитывали следующие показатели: внешний вид и поведение животных, состояние шерстного покрова и видимых слизистых оболочек, подвижность, отношение к корму, гибель.

Для изучения отдаленных последствий влияния заявляемого штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 были сформировапны две группы белых мышей с живой массой 22-25 г по 6 голов в каждой группе (4 самки и 2 самца). В опытной группе на протяжении 2 месяцев ежедневно в питьевую воду мышам добавляли испытуемую культуру в дозах по 0,5 мл на животное. Вторая группа служила контролем и содержалась на обычном рационе вивария. Наблюдение вели в течение 2 месяцев. Учитывали общее состояние, число самок, давших потомство, число мышат в помете, их подвижность, время отлипания ушей, появление шерсти, пропорциональность развития тела и хвоста, отклонения в развитии и поведении. За полученным потомством наблюдали в течение месяца. Каких либо статистически достоверных различий между опытной и контрольной группами обнаружено не было, что свидетельствует об отсутствии токсичности штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt.

Пример 4. Использование нового штамма для выращивания и откорма бройлерных цыплят.

Штамм бактерий Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 в виде суспензии клеток с концентрацией бактерий 2×10⁶ кое/мл выпаивали цыплятам бройлерам опытной группы (40000 голов) из расчета 0,5 мл на голову в день в течение 5 дней, начиная с десятидневного возраста, одновременно с введением антибиотика энрофлоксацина в дозировках, рекомендуемых наставлением по применению. Контрольная группа получала тот же антибиотик, но не получала культуру L.reuteri okt. Среднесуточный привес у цыплят-бройлеров опытной группы в возрасте 35 дней составил 53,7 г., а в контрольной группе 51,4 г.В течение 35 дней в опытной группе погибло 4% цыплят, а в контрольной группе погибло 7% цыплят. Таким образом, применение нового штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 одновременно с антибиотиком позволило повысить среднесуточный привес и снизить гибель цыплят в процессе выращивания.

Использование предлагаемого штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 позволит повысить эффективность выращивания сельскохозяйственной птицы, а также применять последний одновременно с проведением курсов антибиотикотерапии и профилактики заболеваний птиц.