способ прогнозирования сердечно-сосудистых осложнений у больных ишемической болезнью сердца после аортокоронарного шунтирования

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития сердечно-сосудистых осложнений у больных ишемической болезнью сердца после операции аортокоронарного шунтирования путем исследования крови, отличающийся тем, что до проведения аортокоронарного шунтирования в тромбоцитах периферической крови больных определяют активности ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), после чего рассчитывают коэффициент субстратно-гликолитического обмена (КСГО), представляющий собой отношение активности Г6ФДГ к сумме активностей ЛДГ и Г3ФДГ, то есть КСГО=Г6ФДГ/(ЛДГ+Г3ФДГ), и при значении КСГО ниже 0,05 прогнозируют развитие сердечно-сосудистых осложнений, а при значении КСГО равном или выше 0,05 - отсутствие сердечно-сосудистых осложнений.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии. Может быть использовано при лечении больных ишемической болезнью сердца (ИБС) после операции аортокоронарного шунтирования (АКШ).

Основными осложнениями после АКШ являются сердечно-сосудистые осложнения (острый инфаркт миокарда, рецидив стенокардии, сердечно-сосудистая смерть и др.), связанные с тем, что сосудистые имплантанты могут закупориваться из-за свертывания крови. При этом летальность и число осложнений после АКШ зависят от возраста пациента на момент операции, пола, сократительной способности миокарда, степени поражения ствола левой коронарной артерии, количества крупных ветвей коронарного русла со стенозом больше 70% и др. Дополнительными риск-факторами неблагоприятного прогноза после операции считаются: длительность и тяжесть стенокардии; желудочковые нарушения ритма; сердечная недостаточность; сахарный диабет и др. [1].

Известен способ прогнозирования кардиологических осложнений у больных ИБС после операции АКШ путем определения в сыворотке крови концентрации высокочувствительного С-реактивного белка (hsCPБ) [6]. При концентрации hsCPБ выше 3,3 мг/л прогнозируют высокий риск развития послеоперационных осложнений. Недостатком известного способа является то, что прогноз осуществляют только на ближайшие 30 дней после операции. Кроме того, операцию АКШ наиболее часто проводят у больных ИБС пожилого возраста, имеющих другие сопутствующие заболевания, при которых уровень hsCPБ в сыворотке крови также повышается.

Задачей изобретения является разработка информативного способа прогнозирования отдаленных сердечно-сосудистых осложнений у больных ИБС после АКШ.

Поставленная задача решается тем, что до проведения аортокоронарного шунтирования у больных ИБС в тромбоцитах крови определяют активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), затем вычисляют коэффициент субстратно-гликолитического обмена (КСГО), представляющий собой отношение активности Г6ФДГ к сумме активностей ЛДГ и Г3ФДГ, т.е.

КСГО=Г6ФДГ/(ЛДГ+Г3ФДГ).

При значении КСГО ниже 0,05 прогнозируют развитие сердечно-сосудистых осложнений у больных ИБС после операции АКШ. При значении равном или выше 0,05 прогнозируют отсутствие сердечно-сосудистых осложнений.

Значение 0,05 получено опытным путем, на основании сопоставления значений рассчитываемого КСГО и данных последующего наблюдения за клиническим состоянием больных ИБС после АКШ. Значение КСГО ниже 0,05 свидетельствует о снижении оттока субстратов на пентозофосфатный путь через Г6ФДГ и увеличении интенсивности субстратного потока по гликолизу за счет продуктов липидного катаболизма.

Известно, что у больных ИБС при исследовании показателей гемостаза выявляется гиперфункциональное состояние тромбоцитов и активация плазменного звена гемостаза [3]. Данные нарушения значительно ухудшают прогноз заболевания и осложняют лечение. Операция АКШ является методом выбора для лечения наиболее тяжелых форм ИБС. Однако в послеоперационном периоде в ряде случаев развиваются рецидивы стенокардии [3]. Ключевую роль в системе гемостаза играют тромбоциты. Именно эти клетки создают основу клеточного звена системы гемостаза, а также в тромбоцитах содержится ряд ключевых факторов плазменного звена гемостаза, в частности фибриноген. Функция тромбоцитов во многом определяется состоянием их внутриклеточной метаболической системы. Именно через метаболическую систему реализуется действие ряда веществ на тромбоциты, в том числе и воздействие ацетилсалициловой кислоты. К числу параметров, наиболее объективно отражающих основные параметры внутриклеточного метаболизма, можно отнести несколько дегидрогеназ.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.49) осуществляет дегидрирование глюкозо-6-фосфата и кофермента НАДФ. Образовавшийся в ходе данной реакции 6-фосфоглюконо- -лактон является нестабильным и гидролизуется либо спонтанно, либо с помощью фермента 6-фосфоглюконолактоназы с образованием 6-фосфоглюконата [2]. Г6ФДГ катализирует инициализирующую и ключевую реакцию пентозофосфатного цикла, который является конкурентом гликолиза за субстрат (глюкоза-6-фосфат). В норме доля пентозофосфатного цикла в количественном превращении глюкозы обычно невелика и варьирует в зависимости от функционального состояния клеток.

Лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27) - фермент гликолиза, обратимо катализирующий окисление лактата в пировиноградную кислоту с участием в качестве кофермента НАД. ЛДГ занимает ключевое положение в регуляции цитоплазматического уровня НАДН/НАД. В случае избытка НАДН в цитоплазме ЛДГ восстанавливает пируват до лактата, который затем удаляется из клетки (анаэробная реакция ЛДГ). В то же время, при активации аэробных процессов ЛДГ может окислять лактат до пирувата с образованием НАДН (аэробная реакция ЛДГ) [2].

Глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.8) - НАД-зависимая оксидоредуктаза, осуществляющая обратимое окисление глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат. Фермент занимает центральное положение в реакциях липидного обмена. В реакциях синтеза липидов Г3ФДГ осуществляет образование глицеро-3-фосфата из диоксиацетонфосфата, в то время как последний генерируется в реакциях гликолиза и глюконеогенеза. В то же время, образовавшийся в реакциях липидного катаболизма, глицерол-3-фосфат, переводится на реакции анаэробного окисления глюкозы с помощью Г3ФДГ [2].

Способ осуществляется следующим образом.

Производят забор крови из локтевой вены больных ИБС до проведения операции АКШ. Тромбоциты выделяют из 9 мл венозной крови по методу, предложенному Савченко Е.А. с соавт. (2006) [5]. Для этого венозную кровь смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Обогащенную тромбоцитами плазму получают путем центрифугирования стабилизированной крови при 140 g в течение 10 минут. Из пробирки осторожно отбирают супернатант, переносят в чистую пробирку и доводят до 10 мл буфером № 1 (90 мМ NaCl, 5 мМ KСl, 36 мМ цитрата натрия, 10 мМ ЭДТА, рН=7,2). Полученную смесь центрифугируют 15 мин при 400 g. Осадок ресуспензируют в 10 мл буфера № 1 и повторно центрифугируют 1 мин при 400 g. Отбирают 9 мл супернатанта, который вновь центрифугируют при 400 g в течение 15 мин. Супернатант аккуратно сливают, а к осадку добавляют 10 мл буфера № 2 (0,13 М NaCl, 0,02 М Трис-HCl буфера, 0,03 М ЭДТА, 0,015 М глюкозы, рН=7,4) и центрифугируют в том же режиме. После чего осадок разводят в 400 мкл буфера № 2 и центрифугируют 50 с при 140 g. Для дальнейших исследований забирают 250 мкл супернатанта. Для определения активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ из забранного супернатанта с тромбоцитами отбирают объем, содержащий 10⁷ клеток. Разрушают тромбоциты методом осмотического лизиса с доведением общего объема до 2,5 мл (конечная концентрация клеток составляет 4×10⁶ /мл). Активность Г6ФДГ, Г3ФДГ и ЛДГ определяют с помощью биолюминесцентного метода [4]. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных тромбоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в таблице 1.

Таблица 1
Фермент	Субстрат, мМ	Кофактор, мМ	рН буфера
Г6ФДГ	Глюкоза-6-фосфат -1,5	НАДФ - 0,025	9,8
Г3ФДГ	Г3Ф - 0,5	НАД-0,35	9,8
ЛДГ	Лактат - 2,0	НАД-0,50	9,0

После инкубации исследуемых проб при 37°С в течение 30 минут к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10^-5 М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 М K ⁺,Nа⁺-фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биохемилюминометра, например, марки "БЛМ-8803" измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определяют в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности строят графики зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДН и НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАД(Ф)Н в диапазоне 10^-9 -10^-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строят для каждого рН буфера. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ рассчитывают по формуле

где

А - активность дегидрогеназы, Е на 2×10⁵ тромбоцитов (1E=1 мкмоль/мин [2]);

[С] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах "фермент" и "фон

фермента", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

Т - время инкубации, мин.

Затем по уровням активности Г6ФДГ, ЛДГ и Г3ФДГ рассчитывают КСГО. Развитие сердечно-сосудистых осложнений у больных ИБС после АКШ прогнозируют, если значение КСГО ниже 0,05, отсутствие сердечно-сосудистых осложнений - если значение КСГО равно или выше 0,05.

Данный способ апробирован на 70 больных ИБС, которым была проведена операция АКШ в кардиохирургическом отделении Краевой клинической больницы № 1 г.Красноярска. Диагноз ИБС был установлен согласно клинико-функциональным критериям и подтвержден коронароангиографией (КАГ). До проведения АКШ все больные были обследованы по заявляемому способу. По результатам обследования развитие осложнений после АКШ не прогнозировалось у 62 больных ИБС. Величина КСГО у них составила 0,050-7,161 (ниже 0,05). У 8 больных ИБС прогнозировалось развитие сердечно-сосудистых осложнений после АКШ. Величина КСГО у них составила 0,050-7,161 (выше 0,05). Результаты обследования представлены в табл.2.

Таблица 2
Особенности распределения КСГО у больных ИБС до проведения АКШ
КСГО	Без осложнений n=62	С осложнениями n=8
Медиана	0,337	0,003
Минимальное значение	0,050	0,001
Максимальное значение	7,161	0,046

Все больные после операции получали терапию антитромбоцитарными препаратами (клопидогрел первые 3 месяца после АКШ, а затем ацетилсалициловая кислота) и гиполипидемическими средствами.

После операции АКШ больные наблюдались в течение 3-х лет, при этом отслеживались неблагоприятные коронарные события, такие как вновь возникшая стенокардия, острый инфаркт миокарда, сердечно-сосудистая смерть. Из 70 больных у 62 послеоперационный период протекал без осложнений, у 8 - с осложнениями в виде вновь возникшей стенокардии, острого инфаркта миокарда, сердечно-сосудистой смерти. Все случаи осложнений были обусловлены тромбозом шунта или шунтируемой коронарной артерии в течение 1-2 года после операции. Таким образом, отмечено совпадение прогноза у 100% наблюдаемых больных.

Клинический пример 1. Больной Д., 1954 г.р., история болезни № 2480. Находился на стационарном лечении в кардиохирургическом отделении Краевой клинической больницы № 1 г.Красноярска с 31.01.06 г. по 22.02.06 г. с диагнозом: ИБС, стабильная стенокардия напряжения 3 функционального класса, постинфарктный кардиосклероз (от 03.2005 г.), чрескожная транслюминальная коронарная ангиопластика (ЧТКА) и стентирование передней межжелудочковой ветви (ПМЖВ) (31.03.05 г. и 25.10.05 г.) и правой коронарной артерии (ПКА) (25.10.05 г.). Гипертоническая болезнь 2 ст., риск 4. Гиперлипидемия. При поступлении в стационар пациента беспокоили постоянные давящие боли в левой половине грудной клетки, за грудиной.

Проведена операция АКШ. До проведения АКШ больной был обследован по заявляемому способу. По результатам обследования активность дегидрогеназ в тромбоцитах крови: Г6ФДГ - 5,98 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; Г3ФДГ - 13,91 мкЕ на 2×10 ⁵ тромбоцитов; ЛДГ - 1351,95 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов. Величина КСГО составила 0,004 (ниже 0,05), что дает основание прогнозировать развитие сердечно-сосудистых осложнений после операции АКШ.

После операции - пароксизм трепетания предсердий с восстановлением ритма. При выписке пациенту сделаны рекомендации по антитромботической терапии с применением клопидогрела (плавикса) в течение 3 месяцев, а затем аспирина в суточной дозе 75 мг. Через 6 месяцев агрегация тромбоцитов повышена, клиники стенокардии нет. Через 1,5 года после операции возобновилась клиника стенокардии. При контрольной КАГ выявлена окклюзия артериального шунта, что объясняет развитие коронарной недостаточности и появление клиники нестабильной стенокардии.

Клинический пример 2. Больной С., 1948 г.р., история болезни № 10963. Находился на стационарном лечении в кардиохирургическом отделении Краевой клинической больницы № 1 г.Красноярска с 23.05.05 г. по 10.06.05 г. с диагнозом: ИБС, постинфарктная (от 24.04.05 г.) стенокардия напряжения 2-3 функционального класса, постинфарктный кардиосклероз (1987 г.).

При поступлении в стационар предъявлял жалобы на давящие боли за грудиной при минимальной физической нагрузке после перенесенного трансмурального инфаркта миокарда. При КАГ выявлена окклюзия ПМЖВ за 1 диагональной ветвью.

Проведена операция аортокоронарного шунтирования ПМЖВ без искусственного кровообращения с применением аппарата Oktopus-4. До проведения АКШ больной был обследован по заявляемому способу. По результатам обследования активность дегидрогеназ в тромбоцитах крови: Г6ФДГ - 10,70 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; Г3ФДГ - 15,36 мкЕ на 2x10⁵ тромбоцитов; ЛДГ - 806,52 мкЕ на 2×10 ⁵ тромбоцитов. Величина КСГО составила 0,013 (ниже 0,05), что свидетельствует о развитии сердечно-сосудистых осложнений после операции АКШ.

При выписке пациенту даны рекомендации по антитромботической терапии аспирином 75-100 мг/сутки.

Через 3 месяца после операции у больного отмечена клиника стенокардии, спустя 12 и 24 месяца после коронарного шунтирования два повторных острых инфаркта миокарда. При КАГ выявлена окклюзия ПМЖВ от устья, а также стеноз ПКА 50-75%.

Клинический пример 3. Больной Ш., 1947 г.р., история болезни № 28066. Находился на стационарном лечении в кардиохирургическом отделении Краевой клинической больницы № 1 г.Красноярска с 07.12.07 г. по 29.12.07 г. с диагнозом: ИБС, прогрессирующая стенокардия напряжения и покоя, постинфарктный кардиосклероз (1998 г.), сердечная недостаточность 3 функционального класса. Гипертоническая болезнь 3 ст., риск 4.

При поступлении клиника нестабильной стенокардии. По КАГ установлена окклюзия ПМЖВ, окклюзия ПКА, сегментарная окклюзия огибающей ветви (ОВ).

Проведена операция аортокоронарного шунтирования ПКА и ПМЖВ.

До проведения АКШ больной был обследован по заявляемому способу. По результатам обследования активность дегидрогеназ в тромбоцитах крови: Г6ФДГ - 33,87 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; Г3ФДГ - 1,23 мкЕ на 2×10 ⁵ тромбоцитов; ЛДГ - 145,08 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов. Величина КСГО составила 0,232 (выше 0,05), что определяет отсутствие сердечно-сосудистых осложнений после операции АКШ.

Состояние после операции удовлетворительное, стенокардия отсутствует. Через 2 года после операции проведена велоэргометрическая проба (ВЭМ), данных за коронарную недостаточность нет.

Технический результат предлагаемого способа:

- возможность прогнозирования развития сердечно-сосудистых осложнений у больных ИБС до проведения АКШ;

- инвазивное вмешательство ограничено однократным забором из вены малого объема крови (9 мл);

- возможность своевременной профилактики послеоперационных осложнений у больных ИБС.

Таким образом, способ информативен, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики, позволяет своевременно определить риск развития кардиологических осложнений после АКШ.

Источники информации

1. Абышев Р.А. Факторы риска рецидива стенокардии в отдаленном периоде после аортокоронарного шунтирования. // Вестник Военно-медицинской академии. - 2009. - № 2 (26). - С.224-230.

2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

3. Кардаш О.Ф., Белавина Я.Л., Островский Ю.П. Система гемостаза в течение первого года после аортокоронарного шунтирования. // Белорусский медицинский журнал. - 2006. - № 4. - С.28-30.

4. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом. // Лабораторное дело. - 1989. - № 11. - С.23-25.

5. Савченко Е.А., Савченко А.А., Герасимчук А.Н., Грищенко Д.А. Оценка метаболического статуса тромбоцитов в норме и при ишемической болезни сердца. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - № 5. - С.33-36.

6. Balciunas M, Bagdonaite L., Samalavicius R. et al. Pre-operative high sensitive C-reactive protein predicts cardiovascular events after coronary artery bypass grafting surgery: A prospective observational study // Annals of Cardiac Anaesthesia. - 2009. - Vol. 12, № 2. - P.127-132. (Найдено в Интернет на: http://www.annals.in/article.asp?issn=0971 -9784;year=2009;volume=12;issue=2;spage=127;epage=132;aulast=Balciunas).