способ подготовки образцов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью для многоцелевых исследований

Формула изобретения

1. Способ подготовки образцов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью для многоцелевых исследований, включающий метод подготовки тканей для трансмиссионной электронной микроскопии, отличающийся тем, что берут образцы тканей 3-4 мм и дегидратируют в режиме плавного перехода от спирта к ацетону с увеличением времени на этапах от 70% до 96% спирта до 1 ч, обезвоживают - в 2 сменах 70% спирта по 1 ч, в 2 сменах 80% спирта по 1 ч, в 2 сменах 90% спирта по 1 ч, в 2 сменах 96% спирта по 1 ч, в 2 сменах 100% спирта по 30 мин, в 2 сменах 100% ацетона по 30 мин, затем осуществляют пропитку в режиме плавного перехода от ацетона до смолы: смесь смол-ацетон 100% 3:1 - 2 ч, смесь смол-ацетон 100% 1:1 - 2 ч, смесь смол-ацетон 100% 1:3 - 2 ч и перед полимеризацией пропитывают в смоле при комнатной температуре до 10 суток.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный блок затачивают в виде пирамидки, при этом площадь ее основания при высоте 1,0 мм должна быть в 4 раза больше площади среза.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что срез блока начинают изготавливать с гиалинового хряща.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано для изучения влияния различных факторов на состояние суставного хряща и субхондральной кости, исследования биопсийного материала с целью диагностики суставной патологии.

Интерес к изучению субхондральной кости возник благодаря появлению новых сведений о патогенезе остеоартроза, когда стало ясно, что данное заболевание проявляется не только потерей суставного хряща, но и изменениями в костной ткани. Контакт суставного хряща с подлежащей к нему субхондральной костью представлен костным компонентом - зрелая кость остеонной структуры и хрящевым компонентом - кальцифицированный частично резорбирующийся хрящ (Сустав: Морфология, клиника, диагностика, лечение / Под. ред. В.Н.Павловой, Г.Г.Павлова, Н.А.Шостак, Л.И.Слуцкого. М.: ООО «Издательство «Медицинское информационное агентство», 2011. 552 с.; Алексеева Л.И., Зайцева Е.М. Субхондральная кость при остеоартрозе: новые возможности терапии // РМЖ. 2004. Том 12. № 20. С.1133-1136).

Известен способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе, включающий фиксацию, промывку и обезвоживание образцов, при этом образцы после обезвоживания, не высушивая, переносят в смесь дегидранта и камфена, затем последовательно пропитывают в двух порциях расплавленного камфена при температуре 51-60°C (Патент 2397472 RU, опубл. 20.08.2010, № 23, Способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе).

Однако известное изобретение не предназначено для проведения микроанализа суставного хряща и субхондральной кости.

Известны методы изучения морфологических особенностей контакта суставного хряща с подлежащей субхондральной костью с помощью световой микроскопии по целлоидиновым, парафиновым срезам (Мажуга П.М. Источники трофики и структурного самовосполнения суставного хряща // Морфология. 1999. № 1. С.43-50; Поляков В.Ю., Кудрявцева И.П., Антипов А.В. К вопросу о замещении дефектов суставных поверхностей костно-хрящевыми аллотрансплантатами (экспериментальное исследование) // Травматология и ортопедия России. 2000. № 1. С.37-40; Burr D.B., Schaffler M.B. The involvement of subchondral mineralized tissues in osteoarthrosis: guantitative microscopic evidence // Microsc Res Tech. 1997. № 37(4). P.343-357).

Однако исследование суставного хряща и субхондральной кости по таким препаратам без предварительной процедуры декальцинации, при которой происходит значительная потеря минеральных веществ, невозможно. Кроме того, световая микроскопия далеко не всегда дает возможность точно определить границу между кальцифицированным хрящом и костью. К существенному недостатку таких гистологических препаратов относится и их значительная толщина, не позволяющая проводить светооптические исследования на больших увеличениях. Для суставного хряща (диаметр хондроцитов 10-20 мкм) оптимальными являются срезы толщиной 0,5-1 мкм; изготовить качественные парафиновые срезы недекальцинированного суставного хряща с подлежащей костью такой толщины невозможно, требуется более плотная заливочная среда, например эпоксидные смолы.

Известна методика подготовки тканей для трансмиссионной электронной микроскопии с последующим изготовлением полутонких и ультратонких срезов (Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Мир, 1975. 324 с.).

Однако известная методика не дает возможность использовать полутонкие эпоксидные срезы, т.к. стандартная технология их изготовления предполагает заливку кусочков тканей размерами 0,5 - 1 мм, что затрудняет получить репрезентативные выборки изображений для стереологических исследований.

Задачей настоящего изобретения является разработка методики подготовки образцов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью для проведения качественного и количественного исследования методами световой, сканирующей, трансмиссионной электронной микроскопии и электронно-зондового микроанализа.

Указанная задача достигается тем, что в способе подготовки образцов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью для многоцелевых исследований, включающем метод подготовки тканей для трансмиссионной электронной микроскопии, для чего берут образцы тканей 3-4 мм и дегидратируют в режиме плавного перехода от спирта к ацетону с увеличением времени на этапах от 70% до 96% спирта до 1 час, обезвоживают - в 2-х сменах 70% спирта по 1 час; в 2-х сменах 80% спирта по 1 час; в 2-х сменах 90% спирта по 1 час; в 2-х сменах 96% спирта по 1 час; в 2-х сменах 100% спирта по 30 мин; в 2-х сменах 100% ацетона по 30 мин, затем осуществляют пропитку в режиме плавного перехода от ацетона до смолы: смесь смол - ацетон 100% 3:1 - 2 часа; смесь смол - ацетон 100% 1:1 - 2 часа; смесь смол - ацетон 100% 1:3 - 2 часа и перед полимеризацией пропитывают в смоле при комнатной температуре до 10 суток. Полученный блок затачивают в виде пирамидки, при этом площадь ее основания при высоте 1,0 мм должна быть в 4 раза больше площади среза. Срез блока начинают изготавливать с гиалинового хряща.

Изобретение поясняют примером качественного и количественного исследования суставного хряща с подлежащей субхондральной костью методами световой, сканирующей электронной микроскопии и электронно-зондового микроанализа и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг.1 (а, б, в, г) - полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином:

а - общий вид суставного хряща с субхондральной костью, об.2,5; ок. 12,5;

б - глубокая зона хряща, базофильная линия (стрелки), об.40; ок.12,5;

в - кальцифицированный хрящ (КХ), остеокласт резорбирующий кальцифицированный хрящ (ОК), сосуды субхондральной кости (стрелка), об.40, ок.12,5;

г - активные остеобласты на поверхности трабекулы, об.40, ок.12,5.

Фиг.2 (а, б) - суставной хрящ с подлежащей костью:

а - поверхность эпоксидного блока, СЭМ, увеличение 70, 1 - некальцифицированный хрящ, 2 - кальцифицированный хрящ, 3 - кость, стрелки - базофильная линия;

б - элементная карта (Smart Map), отражающая распределение кальция в суставном хряще и субхондральной кости.

Способ осуществляют следующим образом.

Суставной хрящ с подлежащей субхондральной костью разрезали на кусочки размером 2-3 на 3-4 мм, которые после альдегидной фиксации, без этапа декальцинации промыли в фосфатном буфере.

Следующий этап фиксации в 1% растворе тетраоксида осмия исключили с целью проведения в последующем электронно-зондового микроанализа. Затем материал дегидратировали в режиме плавного перехода от спирта к ацетону, в соответствии с методами [Уикли Б., 1975], но с увеличением времени на этапах от 70% до 96% спирта до 1 час.

Схема обезвоживания: в 2-х сменах 70% спирта по 1 час; в 2-х сменах 80% спирта по 1 час; в 2-х сменах 90% спирта по 1 час; в 2-х сменах 96% спирта по 1 час; в 2-х сменах 100% спирта по 30 мин; в 2-х сменах 100% ацетона по 30 мин.

Следующий этап - пропитки осуществляли в режиме плавного перехода от ацетона до смолы с увеличением времени в 2 раза на каждом этапе.

Схема пропитки: смесь смол-ацетон 100% 3:1 - 2 часа; смесь смол-ацетон 100% 1:1 - 2 часа (можно оставить на ночь); смесь смол-ацетон 100% 1:3 - 2 часа.

И дополнительная, перед полимеризацией, пропитка в смоле при комнатной температуре до 10 суток.

Этап полимеризации осуществляли согласно методам подготовки тканей для трансмиссионной электронной микроскопии [Уикли Б., 1975].

Следующий этап - подготовка блоков для резки, формирование пирамидки. Для получения достаточной площади полутонких срезов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью применили следующие технические приемы.

При заточке блока площадь основания пирамидки при ее высоте до 1,0 мм должна быть как минимум в 4 раза больше площади среза, что позволяет избежать вибрации блока и образования механических дефектов на срезах при ультратомировании. При изготовлении срезов важен тщательный контроль качества и отбор стеклянных ножей. При ультратомировании блок следует ориентировать так, чтобы срез начинался с гиалинового хряща, а не с субхондральной кости, что позволяет избежать образования механических дефектов на ноже и срезах из-за различных биомеханических свойств хряща и кости. Полученные таким способом полутонкие срезы увеличенной площади существенно повышают разрешение препаратов, позволяют проводить исследования на органном (фиг.1 а), тканевом (фиг.1 а, б) и клеточном (фиг.1 б, в, г) уровнях структурной организации, формировать репрезентативную выборку для количественного исследования. Эти же блоки после изготовления срезов можно изучать в сканирующем электронном микроскопе (фиг.2 а) и использовать без дополнительной шлифовки для проведения микроанализа суставного хряща и субхондральной кости (фиг.2 б).

Предложенный способ, используемый в ФГУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А.Илизарова» Минздравсоцразвития, не требует применения различных методик обработки материала для световой, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии, не требует изготовления различных видов срезов и позволяет без дополнительных технических и материальных затрат получить объективную информацию о морфологических особенностях контакта суставного хряща с подлежащей субхондральной костью в различных экспериментальных условиях.

Данный способ может быть рекомендован для обработки биопсийного материала с целью диагностики суставной патологии и изучения влияния различных факторов на состояние суставного хряща и субхондральной кости.