способ выделения и фиксации клеток ретинального пигментного эпителия трупных глаз человека

Формула изобретения

Способ выделения и фиксации клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) из трупных глаз человека для последующего проведения цитологического спектрального анализа нормальных и атипических флуорофоров липофусциновых гранул, включающий формирование глазного бокала с иссечением стекловидного тела, слущивание и центрифугирование клеток РПЭ, отличающийся тем, что полученный глазной бокал фиксируют раствором формалина в течение 24 ч при комнатной температуре, содержимое глазного бокала трехкратно промывают дистиллированной водой, иссекают поверхностные слои сетчатой оболочки в области макулы до слоя РПЭ, слущивают клетки РПЭ в области макулы с одновременным капельным нанесением на ее поверхность раствора антифейда, содержащего в своем составе, об.%: глицерина раствор - 50%, диазабицикло[2.2.2]октана раствор - 2%, трис-буфер - 0,02 М, рН 7,4 - до 100%, полученную взвесь клеток центрифугируют, 2/3 объема жидкости удаляют из пробирки, оставшуюся надосодочную жидкость с клеточным осадком диспергируют и наносят полученный диспергат на предметное стекло.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для выделения и фиксации клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) трупных глаз человека.

Подготовленная суспензия клеток (препарат) РПЭ в дальнейшем используется для проведения цитологического спектрального анализа нормальных и атипических флуорофоров липофусциновых гранул (ЛГ) РПЭ трупных глаз человека.

РПЭ представляет собой монослой клеток гексагональной формы, расположенный между нейрональной сетчаткой и сосудистой оболочкой глаза. Клетки РПЭ выполняют транспортную, барьерную, метаболическую, антиоксидантную функции, способствуют адгезии нейросенсорной сетчатки, фагоцитируют наружные сегменты фоторецепторов, абсорбируют световую энергию, что обеспечивает нормальное функционирование сетчатки. С возрастом в клетках РПЭ происходит накопление ЛГ, что может привести к развитию возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Основным источником аутофлуоресценции (АФ) глазного дна является ЛГ РПЭ. Процесс старения РПЭ характеризуется массивным накоплением ЛГ. В настоящее время большое внимание в отечественной и зарубежной офтальмологии уделяется анализу содержания ЛГ в РПЭ, поскольку он играет огромную роль в прогрессировании ВМД.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ выделения клеток РПЭ с целью получения дедифференцированных клеток РПЭ глаза взрослого человека (патент РФ № 2409663), согласно которому энуклеируют глазное яблоко при аутопсии, промывают его в спиртовом растворе последовательно при концентрациях 70°, 50°, 30° и в растворе Хенкса без Са2+, Mg2+ антибиотиков, удаляют по зубчатой линии передний сегмент глазного яблока, отделяют стекловидное тело и нейральную сетчатку от пигментного эпителия, наполняют глазную чашу раствором Хенкса без Са2+, Mg2+ с ЭДТА и инкубируют клетки ретинального пигментного эпителия в течение 15-30 мин, полученные клетки собирают пипеткой и переносят в стерильную среду для выделения, состоящую из 500 мл среды DMEM/F12, 2 mM L-глугамина, 50 мл 10% FBS, 5 мл раствора антибиотика, пипетируют, центрифугируют в течение 5-7 мин при скорости 800 об/мин. Выделенные клетки ресуспендируют на ростовую среду с высоким содержанием сыворотки, состоящую из 500 мл среды DMEM/F12 в соотношении 1:1,2 mM L-глутамина, 50 мл 20% FBS, добавки В27 (1:100), 20 нг/мл FGF-2, 20 нг/мл EGF, 2 мкг/мл гепарина, 5 мл раствора антибиотика. Полученную суспензию клеток ретинального пигментного эпителия распределяют на культуральной поверхности и инкубируют до достижения прикрепления клетками 15-25% ее площади, суспензию с неприкрепившимися клетками аспирируют и распределяют на свежей культуральной поверхности и инкубируют, а к прикрепившимся клеткам добавляют ростовую среду с высоким содержанием сыворотки и инкубируют до достижения конфлюэнтного монослоя целевого продукта. Причем распределение суспензии клеток на свежую культуральную поверхность и инкубирование проводят неоднократно до прекращения прикрепления клеток ретинального пигментного эпителия на культуральной поверхности.

Однако ближайший аналог не предназначен для фиксации клеток РПЭ трупного глаза, его задачей является культивирование клеток РПЭ с последующим получением большого количества жизнеспособных дедифференцированных клеток для трансплантации с целью стимуляции регенераторных процессов при широком спектре нейродегенеративных заболеваний. В процессе культивирования клетки РПЭ взрослого человека в культуре быстро пролиферируют и дедифференцируются на молекулярном уровне, теряют маркеры дифференцировки РПЭ, то есть теряют накопленные с возрастом ЛГ, с их индивидуальными особенностями.

Задачей изобретения является разработка способа выделения и фиксации клеток ретинального пигментного эпителия трупных глаз человека.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является получение клеток РПЭ с сохранением структуры ЛГ и характерных индивидуальных спектральных характеристик для каждого донора, что позволит впоследствии провести цитологический спектральный анализ РПЭ.

Технический результат достигается тем, что в способе выделения и фиксации клеток РПЭ трупных глаз человека для последующего проведения цитологического спектрального анализа нормальных и атипических (патологических) флуорофоров ЛГ клеток РПЭ с помощью флуоресцентного конфокального микроскопа формируется глазной бокал с иссечением стекловидного тела, фиксируется полученный глазной бокал раствором формалина в течение 24 часов при комнатной температуре, 3-кратно промывается содержимое глазного бокала дистиллированной водой, иссекаются поверхностные слои сетчатой оболочки в области макулы до слоя РПЭ, слущиваются клетки РПЭ в области макулы с одновременным капельным нанесением на ее поверхность раствора антифейда (протектора обесцвечивания флуорофоров), содержащего в своем составе в объемных %: глицерина раствор - 50%, диазабицикло[2.2.2]октана раствор - 2%, трис-буфер - 0,02 М, рН=7,4 - до 100%, центрифугируется полученная взвесь клеток, удаляется 2/3 объема жидкости из пробирки, диспергируется оставшаяся надосодочная жидкость с клеточным осадком и наносится диспергат на предметное стекло.

При этом проведение до этапа выделения клеток РПЭ фиксации тканей глазного яблока 5% нейтральным раствором формалина позволяет выделить клетки РПЭ из макулярной зоны (макулярная зона является «зоной-мишенью» при возрастных изменениях сетчатки и РПЭ, так как в этой зоне происходит наибольшее скопление нормальных и атипических флуорофоров ЛГ). Использование же раствора антифейда предлагаемого состава препятствует обесцвечиванию флуорофоров ЛГ.

Изобретение осуществляется следующим образом. Клетки РПЭ были выделены из аутопсийного материала (глазных яблок), полученного из судебного морга от доноров-трупов. У энуклеированного глазного яблока отсекается передний отрезок циркулярно в 2-3 мм от лимба с иридо-хрусталиковой диафрагмой, максимально иссекается и удаляется стекловидное тело до центральной зоны сетчатки. Образовавшийся глазной бокал заполняется 3-4 мл нейтрального 5%-го раствора формалина и оставляется на 24 часа при комнатной температуре в герметично закрытом контейнере. Далее с помощью автоматической пипетки формалин максимально извлекается из полости глазного бокала, после чего содержимое бокала 3-кратно промывается дистиллированной водой. После этого под увеличением х30 стереомикроскопа микрохирургическими инструментами ретинальным шпателем, ретинальными ножницами и цанговым микропинцетом в области макулы иссекаются поверхностные слои сетчатой оболочки до слоя пигментного эпителия в диаметре 7-10 мм. Другим инструментом, шпателем типа «шарошка» с наждачной поверхностью, производится слущивание клеток РПЭ путем щадящих возвратно-поступательных движений на поверхности пигментного эпителия в области макулы с одновременным капельным нанесением на ее поверхность раствора антифейда в количестве 700-1000 мкл, содержащего в своем составе в объемных %: глицерина раствор - 50%, диазабицикло[2.2.2]октана раствор - 2%, трис-буфер - 0,02 М, рН=7,4 - до 100%, препятствующего разрушению флуорофоров и их «выцветанию» при видимом свете. С помощью автоматической пипетки жидкость со спущенными клетками пигментного эпителия собирается в микропробирку «эппендорф» в объеме 500-700 мкл, после чего содержимое пробирки центрифугируется со скоростью 1000 об/мин в течение 5 мин. Далее 2/3 объема жидкости удаляется из пробирки, а оставшаяся надосадочная жидкость с клеточным осадком диспергируется с помощью автоматической пипетки. Диспергат в объеме по 30 мкл капельно наносится на 4-5 предметных стекла, которые покрываются предметными стеклами. В горизонтальном положении в герметично закрытых контейнерах с ватным шариком, обильно смоченным 0,5%-ным раствором формалина, предметные стекла с выделенными образцами клеток РПЭ хранятся в холодильнике при +4°С до 30 суток до проведения цитологического спектроскопического анализа на конфокальном микроскопе.

Пример 1. Донор М., 45 лет.

Танатологический диагноз: Острая сердечно-сосудистая недостаточность, кардиомиопатия. Энуклеация глаза через 9 часов после смерти.

При осмотре глазного дна правого глаза патологии не выявлено. Клетки РПЭ выделены и фиксированы по предложенному способу.

Получены клетки РПЭ именно из макулярной зоны глазного дна, при этом в процессе выделения РПЭ сохранились индивидуальные спектральные характеристики и возрастные особенности клеток РПЭ, а фиксированный препарат в виде суспензии клеток РПЭ защищен раствором антифейда, препятствующим обесцвечиванию флуорофоров ЛГ.