штамм бактерий azotobacter chroococcum 5 v(e), используемый для получения азотфиксирующего удобрения для зерновых и кормовых культур

Формула изобретения

Штамм бактерий Azotobacter chroococcum 5 V(e), депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП «ГосНИИГенетика» под № В-10387, используемый для получения азотфиксирующего удобрения для зерновых и кормовых культур.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в сельском хозяйстве, а именно при производстве бактериальных удобрений для улучшения азотного питания растений.

Для улучшения азотного питания растений недостаточно вводить в почву соединения азота. Необходимо повысить эффективность потребления азота растением. Для этого давно применяют взаимодействие микроорганизма, производящего азот в форме, приемлемой для растений, и клеток корней растений.

Так, известны штаммы бактерий Azotobacter chroococcum, позволяющие улучшить азотное питание томатов (патент № 2076088 RU), огурцы (патент № 2074157 RU), ячменя (авторское удостоверение № 1316189 SU). Приведенные штаммы выделены из ризосферы или ризопланы объекта повышения азотного питания, и их недостатком является узкое действие.

Известен штамм бактерий Azotobacter chroococcum B35 (патент № 2074159 RU), который может быть использован при получении бактериальных удобрений под зеленые культуры, такие как салат, сельдерей, петрушка и др. При его использовании в удобрении снижается уровень нитратов в почве. Недостатком является то, что штамм также выделен из ризосферы томата Lycopersicon esculentum и может быть плохо приспособлен к выживанию в климатических и биологических условиях, отличных от области происхождения томата Lycopersicon esculentum.

Наиболее близким аналогом является штамм бактерий Azotobacter chroococcum для получения препарата, применяемого в растениеводстве (патент № 1703634 SU), обладающего широким спектром подавления фитопатогенных грибов, а также способностью к синтезу индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Этот штамм выделен из серозема.

Целью изобретения является получение штамма бактерий для азотфиксирующего удобрения, обладающего действием на широкий круг зерновых и кормовых растений, а также обладающего высокой устойчивостью к внешним условиям.

Цель достигается за счет использования штамма бактерий Azotobacter chroococcum 5 V(e). Штамм найден в естественных условиях, выделен из светло-серой лесной почвы поселка Раифа Зеленодольского района Республики Татарстан.

Культура идентифицирована до вида с помощью анализа 16S РНК во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ФГУП ГосНИИгенетики), где зарегистрирована за № В-10387.

Культурально-морфологические особенности штамма: Величина клеток 5-суточной культуры на среде Эшби около (0,7-1,7)×(3,0-3,6) мкм. Клетки крупные, округлые, одиночные или соединенные попарно, неподвижные, грамотрицательные. На среде Эшби образуют колонии средних размеров (5 мм). На 5-е сутки колонии блестящие, светло-бежевого цвета, круглые с фестончатыми краями и гладкой поверхностью, выпуклые, по структуре - однородные.

Активность (продуктивность) штамма, другие производственные показатели: Нитрогеназная активность штамма 515,7 нМ N₂ /мл·ч; способен синтезировать и выделять в среду витамины группы В (мг/л): биотин (В₇) - 1,2, пиридоксин (В ₆) - 1,31, тиамин (В₁) - 2,1, пантотеновую кислоту (В₃) - 1,2, а также индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) - 77,5 (Максимальное накопление происходит на 4 сутки).

Оптимальной температурой роста штамма Azotobacter chroococcum 5 V(e) является 25-30°C. Пределы pH для его роста 5,5-8,5, оптимум 7,0-7,5.

Для инокуляции использовали 4-суточную культуру, выращенную на жидкой среде Эшби (среда Эшби (г/л): K₂HPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; KH₂PO₄ (или K₂SO ₄) - 0,1; CaCO₃ - 5,0; сахароза - 20,0; вода водопроводная - 1000 мл [Колешко О.И. Экология микроорганизмов почвы. Лабораторный практикум. - Минск: Высшая школа, 1981. - 175 с.]. По истечении 4-х суток с помощью светового микроскопа осуществляли подсчет клеток в камере Горяева - определяли титр, который должен быть 2,0·10⁹-8,0·10⁹ кл./мл.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: Штамм может храниться без потери полезных свойств при температуре +4-6°C (в холодильнике) на косяках с агаризованной средой Эшби.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма: Среда Эшби - 0,02% K₂HPO₄ , 0,02% MgSO₄, 0,02% NaCl, 0,01% KH₂PO ₄, 0,5% CaCO₃, 2% маннит, 2% агар.

Оптимальные условия и состав среды для ферментации: Среда Бэрка - 0,064% K₂HPO₄, 0,02% MgSO₄ , 0,02% NaCl, 0,016% KH₂PO₄, 2% сахароза, 0,005% CaSO₄·2H₂O, 0,0001% NaMoO ₄, 0,0003% FeSO₄.

Штамм Azotobacter chroococcum 5 V(e) обладает способностью прикрепляться к поверхности корней различных сельскохозяйственных культур, где размножается и функционирует в течение 5-6 месяцев после инокуляции.

Использование заявляемого штамма Azotobacter chroococcum 5 V(e) позволяет значительно повысить урожайность различных сельскохозяйственных культур. К тому же и время жизнедеятельности этого штамма (и, следовательно, продолжительность воздействия бактериального удобрения) не менее 5 мес.

У выделенного штамма Azotobacter chroococcum 5 V(e) определена азотфиксирующая активность (515,7 нМ N₂/мл·ч). Выделенный штамм может быть отнесен к высокоактивным, так как величина ацетиленредукции у него выше 150 нМ N₂/мл·ч (Садыков Б.Ф., Умаров М.М. Продуктивность азотфиксации в филосфере растений // Микробиология. - 1980. - Т.49. - Вып.6. - С.998-1002).

Предлагаемый штамм способен синтезировать витамины группы В и индолил-3-уксусную кислоту (ИУК).

Наибольшая способность продуцировать физиологически активные соединения установлена для него на 4 сутки ((мг/л): биотин (B₇) - 1,2, пиридоксин (В ₆) - 1,9, тиамин (B₁) - 2,1, пантотеновую кислоту (В₃) - 1,2, а также индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) - 107,5). Эти витамины играют важную роль в процессах обмена азотистых веществ. Известно, что гетероауксин оказывает стимулирующее действие в пределах концентраций 17,5-140,0 мг/л (Гуськов А.В., Земская В.А. Изменения ауксиноксидазной активности в укореняющихся черенках фасоли под действием ИУК и 2,4-Д // Физиология растений. - 1985. - Т.32, вып.6. - С.1137-1143). Следовательно, предлагаемый штамм может быть использован для производства ростстимулирующего препарата.

Также штамм хорошо культивируется в недорогих питательных средах, что уменьшает затраты на производство удобрений на основе этого штамма.

Известно, что хорошее качество посевного материала, высокая энергия прорастания семян и дружный рост всходов - важные условия, обеспечивающие в дальнейшем получение высоких урожаев. Результаты тестов, показывающих эффективность предлагаемого штамма, приведены в примерах.

Для всех примеров семена тестовых культур обрабатывались суспензией Azotobacter chroococcum 5 V(e) в течение 1 ч при 28°C (титр клеток 10⁹).

При изучении влияния суспензии Azotobacter chroococcum 5 V(e) на развитие проростков тестовых культур, их длину и биомассу установлено его ростстимулирующее действие (табл.1-5).

Пример 1.

Суспензией Azotobacter chroococcum 5 V(e) обрабатывались семена пшеницы, ржи, проса, кукурузы. Получено увеличение энергии прорастания семян на 5-30% в зависимости от культуры по сравнению с необработанными семенами. Данные представлены в таблице 1.

Пример 2.

Суспензией Azotobacter chroococcum 5 V(e) обрабатывались семена пшеницы, ржи, проса, кукурузы. Получено значительное увеличение длины корешков (от 20% до 80% на 10 сутки), что очень важно, так как корни обеспечивают растение различными питательными элементами, в том числе минеральными (табл.2-3).

Развитие корешков способствовало активному росту проростков тестовых растений (табл.4-5).

Таким образом, полученные данные позволяют рекомендовать для предпосевной обработки семян зерновых и кормовых культур штамм Azotobacter chroococcum 5 V(e), обладающий полифункциональным положительным действием на растения.

Пример 3.

Исследования были продолжены в вегетационных опытах с яровой пшеницей (табл.6-8), где установлена высокая отзывчивость тестовых растений на обработку семян суспензией Azotobacter chroococcum 5 V(e).

Пример 4.

Были проведены вегетационные опыты с кукурузой, также показавшие высокую эффективность обработку семян суспензией Azotobacter chroococcum 5 V(e) (табл.9-13).

Таблица 1
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на энергию прорастания семян различных сельскохозяйственных культур
Культура	Контроль	Azotobacter chroococcum 5V(e)	% к контролю
Зерновые
Пшеница	72	88	+22,2
Рожь	82	86	+4,9
Просо	90	96	+6,7
Кормовые
Кукуруза	72	94	+30,6

Таблица 2
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на длину корешков различных сельскохозяйственных культур
Культура	Контроль	Azotobacter chroococcum 5V(e)	% к контролю
Зерновые
Пшеница	9,2	16,7	+81,5
Рожь	10,3	17,4	+68,9
Просо	4,3	6,4	+48,8
Кормовые
Кукуруза	17,8	21,4	+20,2

Таблица 3
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на биомассу корешков различных сельскохозяйственных культур
Культура	Контроль	Azotobacter chroococcum 5V(e)	% к контролю
Зерновые
Пшеница	0,0055	0,0075	+36,4
Рожь	0,0078	0,0103	+32,1
Просо	0,0003	0,0004	+33,3
Кормовые
Кукуруза	0,0232	0,0297	+28,0

Таблица 4
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на длину проростков различных сельскохозяйственных культур
Культура	Контроль	Azotobacter chroococcum 5V(e)	% к контролю
Зерновые
Пшеница	10,6	12,4	+17,0
Рожь	12,0	14,9	+24,2
Просо	7,8	8,9	+14,1
Кормовые
Кукуруза	9,0	13,9	+54,4

Таблица 5
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на биомассу проростков различных сельскохозяйственных культур
Культура	Контроль	Azotobacter chroococcum 5V(e)	% к контролю
Зерновые
Пшеница	0,0103	0,0127	+23,3
Рожь	0,0118	0,0130	+10,2
Просо	0,0014	0,0018	+28,6
Кормовые
Кукуруза	0,0574	0,0593	+3,3

Таблица 6
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на урожай зерна яровой пшеницы (вегетационный опыт)
№ п/п	Вариант	Урожайность, г/сосуд	% к контролю
1	Контроль без удобрений	7,6	-
2	Azotobacter chroococcum 5V(e)	8,2	+7,9

Таблица 7
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на вес соломы яровой пшеницы (вегетационный опыт)
№ п/п	Вариант	Вес соломы, г/сосуд	% к контролю
1	Контроль без удобрений	16,1	-
2	Azotobacter chroococcum 5V(e)	18,5	+14,9

Таблица 8
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на качество зерна яровой пшеницы (вегетационный опыт)
№ п/п	Вариант	Содержание белка, %	% к контролю
1	Контроль без удобрений	11,3	-
2	Azotobacter chroococcum 5V(e)	12,5	+10,6

Таблица 9
Влияние Azotobacler chroococcum 5 V(c) на содержание в почве фосфора, калия, нитратного (N-NО3) и аммиачного (N-NH 4) азота в фазе семи листьев кукурузы (вегетационный опыт)
№ п/п	Вариант	Содержание, мг/кг почвы
P2O5	K2O	N-NO 3	N-NH 4	N-NO 3 + N-NH4
1	Контроль без удобрений	1065	915	386	6,9	392,9
2	Azotobacler chroococcum 5 V(e)	1658 (+55,7%)	920 (+0,6%)	397 (+2,8%)	7,1 (+2,9%)	404,1 (+2,9%)
Примечание: (+55,7%) - % к контролю

Таблица 10
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на площадь листовой поверхности растений кукурузы
№ п/п	Вариант	Площадь листовой поверхности одного растения, см2	% к контролю
1	Контроль без удобрений	1180	-
2	Azotobacter chroococcum 5 V(e)	1493	+26,5

Таблица 11
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на урожай зеленой массы кукурузы
№ п/п	Вариант	Урожайность, г/сосуд	% к контролю
1	Контроль без удобрений	200,0	-
2	Azotobacter chroococcum 5 V(e)	232,3	+16,2

Таблица 12
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) па структуру урожая кукурузы
№ п/п	Вариант	Вес зеленой массы кукурузы, г/сосуд	В том числе вес зерна, г/сосуд
вес стебля	вес листьев	вес початка
1	Контроль без удобрений	118	29,0	53,0	6,8
2	Azotobacter chroococcum 5V(e)	127 (+7,6%)	32,0 (+10,3%)	72,6 (+37,0%)	7,1 (+4,4%)
Примечание: (+7,6%) - % к контролю

Таблица 13
Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на микробную биомассу в ризосфере кукурузы во время уборки
№ п/п	Вариант	Cmic, мг/100 г·ч	% к контролю
1	Контроль без удобрений	30,6	-
2	Azotobacter chroococcum 5 V(e)	56,8	+85,6