способ оценки интенсивности деструктивных процессов при травматическом повреждении коленного сустава и прогнозирования развития посттравматического артроза

Формула изобретения

Способ оценки интенсивности деструктивных процессов при травматическом повреждении коленного сустава и прогнозирования развития посттравматического артроза, заключающийся в определении оксипролина, отличающийся тем, что проводят исследование обмена коллагена по содержанию фракционного состава оксипролина у крыс после моделирования травмы коленного сустава, при содержании белковосвязанного оксипролина в плазме более 75 мкмоль/л с одновременным повышением свободной фракции оксипролина выше 16 мкмоль/л свидетельствует об активной репарации на фоне продолжающейся интенсивной деструкции коллагеновых структур с последующим исходом в деформирующий остеоартроз.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии для оценки деструктивных процессов при посттравматических артритах коленного сустава и прогноза развития деформирующего артроза.

Известен способ, определяющий характер течения травматических повреждений коленного сустава по биохимическим параметрам крови и синовиальной жидкости: уровень серомукоида, содержание белка и белковых фракций, маркеры окисления липидов, воспалительного процесса (Троценко В.В., Фурцева Л.Н., Кармаганов С.В., Богданова И.А., Алексеева Р.И. Биохимические исследования синовиальной жидкости у больных при заболеваниях и повреждениях крупных суставов. Пособие для врачей. - М., 1999, с.24).

Недостатком способа является необходимость пункции коленного сустава для получения синовиальной жидкости, что не всегда возможно. Частые пункции сустава без строгих показаний приводят к дополнительной травматизации сустава и являются фактором риска развития септических осложнений.

Известен способ прогнозирования течения посттравматического гемартроза, при котором после травмы проводят исследование сыворотки крови больного, определяют в ней активность пероксидазы и каталазы, определяют показатель преломления сыворотки крови, прогнозируют течение посттравматического гемартроза (RU № 2225987, опубл. 20.03.2004).

Известен способ оценки тяжести повреждения коленного сустава у больных с острой травмой, заключающийся в определении в синовиальной жидкости уровня среднемолекулярных пептидов, а также содержание некротических субстанций (RU № 2194989, опубл. 20.12.2002).

Однако во всех приведенных способах диагностики не оценивается уровень метаболизма коллагена, являющегося структурным компонентом внеклеточного матрикса суставного хряща, что наиболее точно отражает степень деструкции сустава, а также активность репаративных процессов в хрящевой ткани.

Известен способ оценки деструктивных процессов в суставе при остеоартрозе коленного сустава, заключающийся в определении оксипролина в качестве раннего биологического маркера катаболической фазы коллагена, отражающего изменения в суставе в зависимости от стадии патологического процесса (Лысенко И.В. Диагностическая ценность оксипролина и арахидоновой кислоты как биологических маркеров деградации хрящевой ткани // Украинский ревматологический журнал. - 2006. - № 2 (24). - С.40-44).

Недостатком способа является то, что проводится только количественное определение общего оксипролина и не оценивается его фракционный состав, а именно свободная и белковосвязанная фракции, а также нет сведений о четких биохимических критериях, более точно характеризующих уровень метаболических процессов в коллагене внеклеточного матрикса хряща. Определение количественного и качественного состава оксипролина позволяет получить представление о характере преобладающих процессов в хряще - глубине процессов дегенерации и деструкции, а также об имеющемся в ткани хряща потенциале регенерации.

Технический результат заключается в более точном определении активности деструктивных процессов, протекающих при посттравматическом артрите путем установления закономерностей изменения метаболизма одного из компонентов межклеточного матрикса хряща - коллагена, а именно его специфического маркера - оксипролина. Определение количественного и фракционного состава оксипролина позволяет получить представление о характере преобладающих процессов в хряще при травматических повреждениях сустава - глубине процессов деструкции, а также о степени активности регенерации и может быть использовано для оценки эффективности патогенетического лечения посттравматического артрита.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе оценки интенсивности деструктивных процессов при травматическом повреждении коленного сустава и прогнозирования развития посттравматического артроза, заключающемся в определении оксипролина, проводят исследование обмена коллагена по содержанию фракционного состава оксипролина, содержание белковосвязанного оксипролина в плазме более 75 мкмоль/л с одновременным повышением свободной фракции оксипролина выше 16 мкмоль/л свидетельствует об активной репарации на фоне продолжающейся интенсивной деструкции коллагеновых структур и прогрессировании деформирующего остеортроза.

Оксипролин является специфической аминокислотой коллагена, поэтому может выступать в роли маркера обмена этого белка. Увеличение свободного и пептидосвязанного оксипролина отражает разрушение коллагеновых структур внеклеточного матрикса. При исследовании уровня свободного оксипролина и его содержании в плазме выше 22 мкмоль/л диагностируют наличие активного деструктивного процесса в травмированном суставе.

Следующий важный показатель - содержание белковосвязанного оксипролина (БСО). Снижение или увеличение этого показателя отражает активность синтеза коллагеновых волокон. Увеличение количества БСО свидетельствует о высоком уровне репаративных процессов в тканях сустава. При уровне белковосвязанного оксипролина до 75 мкмоль/л на фоне снижения количества свободного оксипролина ниже 16 мкмоль/л диагностируют выраженное стимулирование биосинтеза коллагена в ответ на травматическое повреждение, что свидетельствует о высоком уровне регенеративных процессов в тканях сустава.

Однако если при показателе БСО более 75 мкмоль/л наблюдается повышение СО выше 16 мкмоль/л, то это свидетельствует о высоком уровне репарации на фоне продолжающейся деструкции коллагеновых структур. Такое нарушение динамического равновесия между распадом и синтезом коллагена свидетельствует о фибриллогенезе, интенсивность которого не коррелирует со степенью распада коллагеновых волокон. Это связано с тем, что после повреждения хондроциты меняют свой фенотип и начинают синтезировать неполноценный, не образующий фибрилл коллаген, накопление которого приводит к изменению упругоэластических свойств хряща. В этих условиях для сустава даже физиологические механические нагрузки являются деструктивным фактором и будут способствовать прогрессированию патологического процесса с исходом в деформирующий артрозоартрит.

Способ осуществляют следующим образом. Состояние обмена коллагена в плазме крови оценивается по содержанию свободного, пептидносвязанного и белковосвязанного оксипролина с использованием парадиметиламинобензальдегида по методу П.Н.Шараева (Шараев П.Н. Метод определения свободного и связанного оксипролина в сыворотке крови // Лабораторное дело. - 1990. - № 5. - С.283-285). Количество свободного, пептидносвязанного и белковосвязанного оксипролина выражается в микромолях на 1 литр плазмы крови (мкмоль/л).

Ход определения. К 2 мл плазмы крови добавляли 1 мл 5% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 1 мл 57% хлорной кислоты. Содержимое пробирок перемешивали, центрифугировали в течение 5-6 минут при 3000 об/мин. Ровно половину надосадочной жидкости нейтрализовали 6 н. NaOH до рН 8 (1-я пробирка). Вторую половину надосадочной жидкости гидролизовали в кипящей водяной бане (при 100°С) в течение 40 минут. Далее охлаждали и нейтрализовали 6 н. NaOH до рН 8 (2-я пробирка). К осадку добавляли по 1 мл дистиллированной воды, 5% ТХУ и 57% хлорной кислоты. Полученную смесь гидролизовали в течение 6 часов в кипящей водяной бане (при 100°С), охлаждали, центрифугировали в течение 5-6 минут при 3000 об/мин и прозрачную часть содержимого пробирки нейтрализовали 6 н. NaOH до рН 8 (3-я пробирка). Контрольная (4-я пробирка) содержала 4 мл дистиллированной воды. Во все 4 пробирки добавляли по 0,5 мл 7% хлорамина Б в 0,26 М фосфатном буфере (рН 8). Через 10 минут к смеси приливали 0,5 мл 57% хлорной кислоты, а еще через 5 минут - 0,5 мл 10% раствора парадиметиламинобензальдегида в 94-96% этаноле. Содержимое пробирок перемешивали и помещали в водяную баню (при 100°С) на 90-120 секунд. Содержимое пробирок встряхивали, центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин и фотометрировали при длине волны 550-560 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм напротив контроля. Содержание свободного оксипролина (1-я пробирка), свободного с пептидносвязанным оксипролином (2-я пробирка) и белковосвязанным оксипролином (3-я пробирка) рассчитывали по калибровочной кривой. По разности оксипролина в 1-й и 2-й пробирках находили содержание пептидносвязанного оксипролина.

Для обоснования предлагаемого способа проведено экспериментальное исследование на коленных суставах 85 белых нелинейных крыс обоего пола массой 180-200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария ГОУ ВПО «МГУ им. Н.П.Огарева». Производилось моделирование травмы коленного сустава механическим путем по методике О.Я.Ломницкого (Ломницкий О.Я. Экспериментальное изучение деформирующего остеоартроза // Ревматология. - 1986. - № 4. - С.65-67).

Под ингаляционным наркозом в асептических условиях рассекалась кожа, фасция и капсула коленного сустава, после чего в полость сустава вводили иглу Дюфо, обточенную под углом 90° и ориентированную на хрящ внутреннего мыщелка бедренной кости. Ввинчивающими движениями перфорировали суставной хрящ до упора в субхондральную кость, затем иглу удаляли. Получение фрагмента суставного хряща контролировали мандреном.

Животных выводили из эксперимента на 3, 15 и 28 сутки после предварительного внутрибрюшинного введения раствора тиопентала натрия в дозе 100 мг/кг.

Животные были разделены на 3 серии. Первую серию составили интактные животные в количестве 25 особей. Во второй (контрольной) серии (n=30) лечение не проводилось. В третьей серии (n=30) проводилось внутрисуставное введение антиоксиданта мексидола в дозе 5 мг/кг в 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия через день. Курс лечения составлял 5 инъекций.

При исследовании сыворотки крови животных контрольной серии на 28 сутки после моделирования травмы коленного сустава происходило увеличение содержания свободного оксипролина до 26,7 мкмоль/л (p<0,001) и белковосвязанной фракции оксипролина до 105 мкмоль/л (p<0,001), превосходя значения животных интактной серии на 119,5% и 135,3% соответственно. Данные изменения свидетельствуют высоком уровне неполноценного фибрилллогенеза на фоне продолжающихся деструктивных процессов коллагеновых структур суставного хряща.

Полученные результаты были подтверждены гистологическим исследованием суставного хряща.

К концу эксперимента у животных контрольной серии поверхность хряща имела дефект в виде углубления с неровными границами бело-желтого цвета. Хрящ, окружающий дефект, был тусклый, желтоватого цвета. Морфологическое исследование в перифокальной области выявило стертость зональности хрящевой ткани, глубокие узуры, доходящие до середины глубокой зоны. В промежуточной зоне определялись лакуны, содержащие 1-3 хондроцита, и скопления из 4-6 клеток. Половина хондроцитов как в лакунах, так и в скоплениях имела пикнотичные ядра. Матрикс промежуточной зоны был слабо эозинофильным, волокнистым. В поверхностном и среднем слое происходила фибрилляция с дезорганизацией и уплотнением коллагеновых волокон, появлением горизонтальных и вертикальных трещин, формированием фиброзного хряща на поверхности.

При внутрисуставном введении мексидола фракции оксипролина в сыворотке крови по сравнению с данными контрольной серии изменились следующим образом: СО снизился на 51,1% (p₁<0,001) и составил 13,2 мкмоль/л, свидетельствуя об уменьшении процессов распада коллагена. Важно отметить, что на фоне антиоксидатной терапии произошло уменьшение белковосвязанного оксипролина на 47,8% (р₃<0,001) по сравнению с данными контрольной серии, достигая 50,1 мкмоль/л, что свидетельствовало об ограничении формирующегося фиброза и склероза тканей сустава.

При гистологическом исследовании выявлено, что сам дефект заполнен зрелой соединительной тканью, в которой определяется большое количество хондроцитов. В пограничных областях обнаруживались отдельные пикнотичные клетки и скопления молодых хондроцитов. Зональность структуры хрящевой ткани вне очага повреждения четко прослеживалась. Фибрилляции поверхностной и промежуточной зоны не наблюдалось. В среднем и глубоком слоях хрящевой ткани определялись клеточные скопления хондроцитов и хондробластов. Деструкции и склероза субхондральных костных балок обнаружено не было.

Предлагаемый способ позволяет диагностировать активность деструктивных процессов в пораженном суставе до их рентгенологического проявления и обосновать оптимальную схему лечения пораженного сустава, определяя необходимый комплекс лечебных воздействий, что приводит к снижению активности прогрессирования посттравматического остеоартроза в начальных стадиях заболевания.