способ получения сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота для культивирования клеток животных и человека

Формула изобретения

Способ получения сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота для культивирования клеток животных и человека, включающий взятие крови, отделение, сбор и 2-3-кратную стерилизующую фильтрацию сыворотки, отличающийся тем, что взятие крови проводят асептически только у бычков и только из сердца в поликарбонатные бутыли с гипертоническим раствором NaCl, отделение сыворотки осуществляют в течение 72 ч при +1 +2°С, проводят сбор и очистку сыворотки фильтрами EKS с последующим замораживанием в полиэтиленовых канистрах при -15 -20°С не менее 7 суток, затем размораживают и удаляют 5% нижних гемолизированных слоев, а светлую сыворотку подвергают 1-кратной стерилизующей фильтрации при +2 +6°С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при культивировании линии клеток животных, человека, а также гибридом.

В известных литературных источниках технология получения данной сыворотки крови описывается весьма поверхностно (Методы культуры клеток для биохимиков / Р.А.Адамс: Пер. с англ. - М.: Мир. - 1983. - 264 с.; Животная клетка в культуре / Под ред. проф. Л.П.Дьяконова. - М.: Изд-во «Спутник +». - 2009. - 656 с.), а источник в Интернете (http:wwwleitran.ru/page.php?al=sivorotka) вообще не несет никакой информации о ее производстве.

Известен способ получения сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота, который мы взяли в качестве близкого аналога: путем взятия крови у животных из сердца или яремной вены, отстоя, сбора и стерилизующей фильтрации конечного продукта, описанный в справочнике под редакцией Б.И.Антонова (Лабораторные исследования в ветеринарии: Справочник / Б.И.Антонов, В.Борисова, П.М.Волкова и др., под ред. Б.И.Антонова. - М.: Агропромиздат. - 1986. - 352 с.). Но в данном аналоге имеют место существенные недостатки:

1. Кровь берут, как у коров, так и бычков (общеизвестно, что сыворотка крови животных существенно отличается от их половой принадлежности);

2. Взятие крови проводят двумя методами: из сердца без соблюдения асептики и из яремной вены с соблюдением асептики, но продолжительность заполнения 10-литровых бутылей до 5-литровой отметки составляет 6-10 минут и более;

3. Кровью заполняют только стеклянные бутыли, которые часто бьются и являются потенциальным источником травматизма сотрудников, работающих с ними, кроме того, они дорогостоящие;

4. Отстой сыворотки проводят в холодильной камере 24-48 часов при температуре +6-+10°С, а при такой высокой температуре идет быстрое размножение вульгарной микрофлоры, ведущей к снижению качества конечной продукции;

5. Выход сыворотки незначителен (20-25% от объема взятой крови) по причине использования физиологического раствора NaCl для смачивания стенок бутылей и взятия крови из яремной вены;

6. Собранную сыворотку подогревают до +30-+37°С, для предварительной очистки через глубинные фильтры EKS, а затем стерилизущей фильтрации через мембранные миллипоровые фильтры. Принимая во внимание, что фильтрация сыворотки - продолжительный процесс, то при высокой температуре идет быстрое накопление в ней микрофлоры, что негативно отражается на ее качестве;

7. По причине выпадения белков и для более надежной стерилизации рекомендуют 2-3-кратную фильтрацию сыворотки, что увеличивает время приготовления конечного продукта и затраты на расходные материалы;

8. Сыворотка, получаемая по данной технологии, не соответствует по ряду физико-химических параметров и непригодна для культивирования клеток животного происхождения.

Другим аналогом, но только по качественным характеристикам, мы видим фетальную сыворотку крови плодов коров, которая до сих пор считается самой лучшей биологической добавкой в питательные среды для выращивания культур клеток животных и человека (ТУ ФС 42-7ВС-85), утвержденным Минздравом СССР 4 апреля 1985 года.

Для четкого представления цели изобретения в табл.1 приведены концентрации ингибиторов роста клеток и других качественных показателей в естественной сыворотке крови взрослого крупного рогатого скота по ТУ 49.24 б-82 и в нативной сыворотке крови плодов коров по ТУ ФС 42-7ВС-85, утвержденным Минздравом СССР 4 апреля 1985 года.

Таблица 1
Показатель	Сыворотка крови взрослого крупного рогатого скота по ТУ 49.24 б-82	Сыворотка крови эмбрионов коров по ТУ ФС 42-7ВС-85
Прозрачность (535 нм)	Не более 0,450 ед. оптической плотности	Не более 0,300 ед. оптической плотности
РН	7,0-7,8	7,6±0,2
Свободный гемоглобин	Не более 60 мг/дл	Не более 50 мг/дл
Общие липиды	40-200 мг/дл	30-50 мг/дл
Холестерин	90-170 мг/дл	10-20 мг/дл
Общий белок, в том числе:	6,3-7,7 г/дл	4,5±2,5 г/дл
альбумины		55±5%
-глобулины		35±5%
-глобулины		10±5%
-глобулины		Ниже 1%
Ростстимулирующая активность на перевиваемых линиях клеток по индексу пролиферации	Не менее 4,0-5,0	Не менее 6,0-7,0

Наиболее близким по техническому решению является способ получения сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота, который описан в патенте РФ № 1813783 «Способ получения сыворотки крови животных для культивирования клеток животных тканей» от 5 марта 1994 года, который взят нами в качестве прототипа предлагаемого изобретения.

Технологический процесс по данному патенту включает заморозку нативных сывороток крови животных при -(15-20)°С в течение 24-48 часов с последующим оттаиванием их при комнатной температуре, сбор светлых слоев сыворотки, начиная сверху, до границы раздела их с гемолизированными фракциями, стерилизующую фильтрацию и контроль качества полученных препаратов.

Задачей предлагаемого изобретения является существенное увеличение выхода сыворотки к объему взятой крови, улучшение ее качества, а также получение сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота, пригодной для культивирования клеток животных и человека, в том числе гибридом, за счет удаления из нативной сыворотки крови бычков отдельных ингибиторов роста клеток.

Поставленная задача решается нами тем, что в способе получения сыворотки крови от взрослого крупного рогатого скота проведены существенные, прямо противоположные существующим литературным источникам, изменения в технологии ее получения.

В отличие от данного изобретения, в предлагаемом нами проекте, процент удаляемых при размораживании сыворотки крови бычков компонентов снижается до 5-10%, кроме того, сыворотка крови предварительно фильтруется при +2-+6°С через фильтры EKS, а затем - через стерилизующие мембранные фильтры любой надежной фирмы, например: «Millipore Intertec» США, ее филиала в Ирландии, или «Владисарт» Россия. Данный способ получения сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота для культивирования клеток животного происхождения включает два этапа:

1-й этап заключается в кардинальном изменении получения нативной сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота, что является весьма существенным моментом в изменении технологического процесса: взятие крови проводят только у бычков и только из сердца асептически специальными системами в стеклянные или поликарбонатные бутыли емкостью 10-20 литров, в которые предварительно налит 5%-ный раствор натрия хлористого в объеме 100-200 мл. Бутыли наполняют кровью, примерно наполовину их объема, оставляют стоять в вертикальном положении на 2-3 часа в убойном цехе, а затем переносят в холодильную камеру с температурой +1-+2°С и укладывают их под углом 35° на 72 часа, после чего специальной системой проводят сбор отстоявшейся сыворотки (выход ее к объему взятой крови превышает 40%), ее предварительную очистку фильтрами EKS при температуре +2-+6°С, которой заполняют полиэтиленовые канистры емкостью 20 литров и выдерживают их при температуре -(15-20)°С не менее недельного срока.

2-й этап состоит в удалении из нативной сыворотки крови бычков ингибирующих рост клеток веществ (остаточного гемоглобина, общих липидов, -глобулинов и др.) методом замораживания-оттаивания, сбора верхних светлых слоев сыворотки, начиная сверху, до границы ее с гемолизированными фракциями, предварительной очистке через глубинные фильтры EKS, а затем стерилизующей фильтрации через мембранные фильтры с расфасовкой ее по 400-450 мл во флаконы емкостью 500 мл, контроле стерильности и биологической активности.

Существенным отличием способа получения сыворотки крови крупного рогатого скота является то, что мы используем прямопротивоположную существующим методикам технологию ее получения, обоснование которой дано ниже на ряде примеров.

Пример 1. Взятие крови у бычков и отделение сыворотки.

Забор крови у бычков, с целью получения сыворотки, проводили с соблюдением асептики двумя асептическими методами: из яремной вены и сердца в 10-литровые стеклянные или 20-литровые поликарбонатные бутыли, в которые наливают по 100-200 мл 5%-ного раствора натрия хлористого.

Нами установлено, что время заполнения 10-литровых бутылей до 5-литровой отметки при взятии крови из сердца бычков составляло 1-2 минуты, а при взятии из яремной вены - 8-10 минут.

После взятия крови в бутыли их оставляли стоять в вертикальном положении при комнатной температуре 2 часа, а затем помещали в холодильную камеру на стеллажи под углом 35° на 72 часа при температуре +1-+2°С. Расположение бутылей с кровью под углом 35° способствует лучшей ретракции сгустков, а температура отстоя сыворотки +1-+2°С препятствует размножению случайно попавшей в кровь микрофлоры.

Пример 2. Сравнительное изучение отделения сыворотки бычков в зависимости от места взятия крови и процентного содержания натрия хлористого в растворе.

Результаты данного опыта приведены в таблице 2. В опыте три варианта. В каждом варианте по 20 бутылей с объемом крови от 4,65 до 5,10 литра. В варианте 1 кровь брали из яремной вены в 10-литровые бутыли, в которых находилось по 100 мл 1%-ного раствора NaCl. В варианте 2 кровь брали из сердца в бутыли с 1%-ным раствором NaCl по 100 мл, а в варианте 3 кровь брали также из сердца, но в бутыли был налит 5%-ный раствор NaCl по 100 мл.

Таблица 2
Вариант опыта	Объем крови в бутылях, л	Отсосано сыворотки
литров	%	достоверность, Р
№	М±м	М±м	М±м
1	4,65±0,32	1,17±0,13	25,06±1,28
2	5,10±0,24	1,80±0,15	35,30±1,62	0,01
3	4,95±0,20	2,07±0,19	41,82±1,70	0,001

Как следует из таблицы 2, выход сыворотки из крови, взятой из сердца бычков в бутыли с 1%-ным раствором NaCl достоверно выше, чем из крови, взятой из яремной вены. Использование же гипертонического 5%-ного раствора NaCl, наливаемого в бутыли для смачивания их стенок, способствует еще большему выходу сыворотки из крови, взятой из сердца бычков. Высокий выход сыворотки по предлагаемому способу имеет место и в производственных условиях. Так, например, в 30 бутылей было взято 150 литров крови, а после отстоя отсосано 63 литра сыворотки или 42% от объема крови.

Пример 3. Качественные показатели сыворотки крови бычков и коров.

Изучение сыворотки крови бычков и коров проведено по следующим качественным показателям: оптическая плотность, содержание общего белка и остаточного гемоглобина, ростстимулирующая активность на перевиваемых культурах клеток. У бычков массой тела 300-400 кг и коров - 400-450 кг кровь брали из сердца в 10-литровые бутыли, содержащие по 100 мл 5%-ного раствора NaCl, до 5-литровой отметки сыворотку отстаивали 72 часа в холодильной камере при температуре +1-+2°С, после чего отбирали пробы сыворотки, которые замораживали, оттаивали и стерилизовали через мембранные фильтры.

Прозрачность (оптическая плотность), общий белок и остаточный гемоглобин сыворотки крови отдельных животных устанавливали непосредственно после взятия проб сыворотки, а также после центрифугирования ее при 1500 об/мин в течение 10 минут. Общий белок определяли по биуретовой реакции, а остаточный гемоглобин - гемиглобинцианидным методом после центрифугирования сыворотки. Ростстимулирующую активность сыворотки крови оценивали на культурах клеток SPEV и MDBK по индексу пролиферации после 72-часового роста при плотности посева 40000 кл./см² и по кратности увеличения клеточной популяции после 5-суточного роста при плотности посева 20000 кл./см². Клетки культивировали во флаконах Карреля с посевной площадью 8 см² в среде Игла MEM с глутамином, канамицином и 10%-ной сыворотки крови.

Кровь взяли у 40 бычков и 40 коров. Результаты данных опытов приведены в таблице 3. Через 72-часового отстоя оптическая плотность сыворотки крови коров превышала таковую бычков более чем в 2 раза. Почти такое же соотношение отмечено и по вариабельности данного показателя. После центрифугирования оптическая плотность сыворотки крови коров снижалась, хотя и оставалась несколько выше, чем у бычков. В сыворотке крови коров регистрировали более высокие концентрации общего белка и остаточного гемоглобина по сравнению с этими показателями сыворотки крови бычков. Коэффициент вариации по остаточному гемоглобину сыворотки крови коров превышал 54%. Высокие оптическая плотность и концентрация остаточного гемоглобина сыворотки крови коров, по-видимому, связаны с меньшей резистентностью к разрушению у них эритроцитов. Ростстимулирующая активность сыворотки крови коров (по индексу пролиферации и кратности увеличения клеточной популяции) на культурах клеток SPEV и MDBK уступает биологической активности таковой, полученной из крови бычков.

Таблица 3
Показатель	Сыворотка крови
бычков М±м	коров М±м
Прозрачность, ед. оптической плотности, после:
сбора сыворотки:	0,258±0,015	0,538±0,035
коэффициент вариации, %	22,02	38,07
достоверность	Р<0,001
центрифугирования сыворотки:	0,152±0,006	0,201±0,009
коэффициент вариации, %	20,30	22,52
достоверность	Р<0,001
Общий белок, г/дл:	7,04±0,12	7,62±0,17
коэффициент вариации, %	6,30	9,24
достоверность	Р<0,001
Остаточный гемоглобин, мг/дл:	54,1±3,2	101,2±10,8
коэффициент вариации, %	27,25	54,03
достоверность	Р<0,001
Ростстимулирующая активность сыворотки крови на культурах клеток по:
индексу пролиферации,	6,40-6,96	5,85-6,47
кратности увеличения клеточной популяции	10,3-11,2	9,5-10,2

Пример 4. Преимущество взятия крови из сердца бычков для получения сыворотки, предназначенной для культивирования клеток.

Цель исследования - выявить особенности биохимического состава сывороток, полученных из крови, взятой из яремной вены, сонной артерии и сердца бычков, а также оценить их ростовые свойства на перевиваемых культурах клеток. Для получения сыворотки у 18 бычков массой тела 300-400 кг асептически брали по 300 мл крови из яремной вены, сонной артерии и сердца во флаконы емкостью 500 мл с 5 мл 5%-ного раствора NaCl (из расчета 2 флакона на животное) и помещали их под углом 35° в холодильную камеру с температурой +2°С на 48 часов. Отстоявшуюся сыворотку из каждой пары флаконов собирали отдельно, центрифугировали и замораживали при -15°С, предварительно взяв пробы для проведения физико-биохимических исследований. Перед стерилизующей фильтрацией через мембранные фильтры, получаемые сыворотки крови из сердца, сонной артерии и яремной вены, смешивали отдельно по 200 мл.

Определение рН и оптической плотности, контроль на стерильность, а также оценку ростстимулирующих свойств сыворотки крови осуществляли общепринятыми методами. Общий белок определяли по биуретовой реакции, остаточный гемоглобин - гемиглобинцианидным методом, холестерин - с реактивами фирмы «Konelab» (Финляндия), кроме того, контролировали низкомолекулярные азотистые вещества (креатинин, мочевина и мочевая кислота), пигменты (прямой и общий билирубин), ферменты (ЛДГ, КФК, глутаминтрансфераза, амилаза, АсАТ, щелочная фосфатаза, АлАТ), неорганические вещества (кальций, железо, фосфор), глюкозу с использованием реактивов фирмы «Rendox» на приборе Daytona Rendox (Великобритания) и проводили электрофорез сывороточных белков на ацетатцелюлозных фильтрах Владисарт тип - ФМАЦ-0,45-(80·100)-11106 с размерами пор 0,45 мкм. Цифровой материал подвергали компьютерной статической обработке с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (м), среднеквадратического отклонения ( ), коэффициента вариации (C_V) и достоверности различий (Р) результатов с использованием программы Microsoft Excel. Результаты перечисленных исследований сывороток крови бычков приведены в таблице 4.

Таблица 4
Показатели	Сердце	Артерия	Вена
М±м	CV, %	М±м	CV, %	Р	М±м	CV, %	Р
рН	7,6±0,02	0,8	7,71±0,02	0,68	0,01	7,56±0,02	0,58	0,05
Прозрачность, ед. опт. пл.	0,267±0,01	4,9	0,279±0,01	4,16	0,01	0,310±0,01	5,52	0,01
Неорганические вещества:
фосфор, мМ/л	1,64±0,09	15,4	1,40±0,11	22,39	0,01	1,63±0,14	23,51	>0,05 Н.Д
кальций, мМ/л	2,01±0,06	9,0	1,82±0,07	9,97	0,05	1,99±0,07	9,53	>0,05 Н.Д
железо, мкМ/л	9,60±0,53	15,6	9,75±0,43	12,37	Н.Д.	10,91±0,52	13,5	0,05
Остаточный гемоглобин, мг/дл	54,8±1,4	7,2	61,2±2,07	9,57	0,05	70,4±1,80	7,21	0,05
Общие липиды, г/л в том числе:	1,98±0,08	10,8	2,26±0,09	10,29	0,01	1,84±0,07	10,47	0,01
холестерин, мМ/л	2,64±0,24	25,6	2,97±0,25	23,49	0,01	3,18±0,26	23,54	0,05
триглицериды, мМ/л	0,34±0,03	23,2	0,40±0,03	21,10	0,05	0,47±0,04	22,75	0,05
Общий белок, г/л в том числе белковые фракции, %	73,4±2,85	10,9	82,3±3,07	10,54	0,05	79,99±2,91	9,48	0,05
Альбумины	44,47±1,12	7,1	42,99±1,19	7,85	0,01	42,40±1,11	7,41	0,05
глобулины:
-	8,63±0,18	5,8	9,40±0,22	6,69	0,01	9,04±0,29	8,93	0,05
-	10,56±0,22	5,8	10,51±0,34	8,39	0,05	10,22±0,16	4,42	0,05
-	36,4±1,12	8,9	37,1±1,23	9,66	0,05	38,30±1,21	8,89	0,05
Ферменты, Ед/л:
ЛДГ	2191±119	15,4	2250±47	10,63	0,01	1918±261	38,52	0,05
КФК	170±6	9,2	179±12	19,03	0,05	169±11	17,89	>0,05 Н.Д.
глутамин-трансфераза	21,02±1,1	15,5	21,80±1,46	18,96	0,05	22,17±1,31	16,72	0,05
амилаза	17,58±1,4	23,0	19,87±1,26	17,15	0,05	21,58±1,15	15,10	0,05
АсАТ	91,88±6,69	20,6	103,90±9,13	24,86	0,05	99,13±7,06	20,15	0,01
щелочная фосфатаза	96,92±10,06	29,4	98,53±9,15	26,27	0,01	106,91±10,4	27,53	0,01
АлАТ	34,66±1,97	16,1	39,73±1,93	13,75	0,05	36,67±1,86	14,35	0,01
Билирубин, мкМ/л:
прямой	0,63±0,07	33,2	0,55±0,07	38,24	0,05	0,48±0,09	53,0	0,01
общий	3,42±0,29	24,2	3,71±0,17	13,13	0,01	3,19±0,27	24,16	0,05
Глюкоза, мМ/л	27,58±1,41	14,4	11,28±0,91	22,73	0,01	12,38±1,06	24,32	0,01
Низкомолекулярные азотистые вещества:
креатинин, мкМ/л	138,11±8,66	17,7	150,79±8,3	15,56	0,01	161,71±6,5	11,36	0,05
мочевина, Ед/л	4,78±0,25	14,5	4,56±0,24	14,93	0,01	4,95±0,23	13,05	0,01
мочевая кислота, М/л	220,0±14,8	9,1	170,0±16,9	28,18	0,05	156,0±10,5	18,96	0,05

Для оценки ростстимулирующих свойств сывороток крови бычков в качестве клеточных моделей использовали перевиваемые почечные линии SPEV (эмбриона свиньи) и MDBK (эмбриона коровы). Стерильные сыворотки крови из яремной вены, сонной артерии и сердца бычков добавляли в 10%-ной концентрации в среду Игла MEM с глутамином и канамицином. Для вычисления индекса пролиферации (ИП) клеточную взвесь рассевали по 2 мл с посевной площадью 3 см² при плотности посева 42000 кл./см². После 72-часового роста подсчитывали количество клеток в образовавшемся монослое. Проведено по 8 опытов с каждой культурой, в опытах количество клеток подсчитывали в камере Горяева по 4 раза. Результаты пролиферативной активности клеток SPEV и MDBK на средах сыворотками крови бычков из разных участков кровеносной системы приведены в таблице 5.

Таблица 5
Кровь из	Культуры клеток
SPEV	MDBK
ИП	CV, %	Р	ИП	CV, %	Р
Сердца	4,83±0,15	3,3	-	5,05±0,10	1,6	-
Сонной артерии	4,42±0,18	4,5	0,05	4,71±0,13	2,2	0,05
Яремной вены	4,01±0,14	5,2	0,05	4,16±0,15	2,5	0,05

Пролиферация культур клеток, выращенных на средах с сыворотками, полученными из крови, взятой из сонной артерии, яремной вены, была ниже, чем у клеток, выращенных на среде с сывороткой крови из сердца, что, несомненно, связано с их различным биохимическим составом.

Пример 5. Удаление из нативной сыворотки крови бычков веществ, ингибирующих рост клеток, методом замораживания - оттаивания. Отдельные образцы сыворотки имеют различный биохимический состав, зависящий от ряда факторов: кормления и содержания животных, сезона года, породы, пола и др. Замораживание и оттаивание позволяют получать сыворотку крови для культур клеток с прогнозируемым биохимическим составом.

Из всего разнообразия получения сыворотки методом замораживания - оттаивания нами отдано предпочтение варианту, включающему: одну заморозку нативных сывороток крови бычков при -(15-20)°С в течение не менее 7 суток с последующим оттаиванием их при +20-+40°С, сбор светлых слоев сывороток, начиная сверху, до границы раздела их с гемолизированными слоями, предварительную, а затем стерилизующую фильтрацию и контроль качества полученных препаратов.

Основные физико-химические показатели сыворотки крови бычьей в сравнении с нативной сывороткой ниже, а именно: концентрация белка - в 1,19-1,94; свободного гемоглобина - в 1,32-2,94; общих липидов - в 1,56-2,64, в том числе общего холестерина - в 1,37-2,53 раза.

Согласно результатам электрофореза сывороточных белков в полиакриламидном геле, в сыворотках крови, получаемых методом замораживания - оттаивания, в сравнении с нативными сыворотками крови возрастает относительная концентрация альбуминов и снижается концентрация -глобулинов, тогда как концентрация - и -глобулинов остается практически без изменения.

Показатели состава сыворотки крови бычьей, получаемой методом замораживания - оттаивания, представлены в таблице 6.

Таблица 6
Показатели	Сыворотка крови бычья
Внешний вид	Прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета
Прозрачность, ед. оптич. плотности	0,183±0,027
рН	7,82±0,04
Остаточный гемоглобин, мг/дл	39,2±5,1
Общие липиды, мг/дл	78,1±10,1
Холестерин, мг/дл	34,0±3,3
Общий белок, г/дл	4,94±0,43
в том числе:
альбумины	1,87±0,28
-глобулины	1,60±0,13
-глобулины	0,67±0,18
-глобулины	1,80±0,20
Ростстимулирующая активность по

индексу пролиферации на перевиваемых линиях клеток	7,32-7,81
Возможные контаминанты:
бактерии	отсутствуют
микоплазмы	отсутствуют
вирусы	отсутствуют

Следует отметить, что индекс пролиферации перевиваемых культур клеток PK-15, NGUK-1, VERO, MDBK, LEK, выращиваемых на средах ГЛА и Игла MEM с сывороткой крови бычьей, полученной методом замораживания - оттаивания на 0,50-2,40 (чаще на 1,5-2,0) больше, чем с нативной сывороткой крови бычков.