способ прогнозирования почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом

Формула изобретения

Способ прогнозирования почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, отличающийся тем, что проводят выявление генотипов и аллелей гена параоксоназы-2 (S311C PON2) и прогнозируют снижение почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом при выявлении аллеля 311S PON2.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом.

Среди болезней почек хронический гломерулонефрит (ХГН) является одним из самых серьезных заболеваний по своей медицинской и социальной значимости, из-за высокой распространенности и прогрессирующего течения, приводящего к развитию хронической почечной недостаточности, требующей проведения программного гемодиализа или трансплантации почки [1, 2, 3]. Хронический гломерулонефрит занимает доминирующее место в группе хронических болезней почек и составляет более 35% [4]. Следует отметить также увеличение числа пациентов, получающих заместительную почечную терапию, что требует дополнительных экономических расходов на ее проведение [5, 6, 7].

Как свидетельствуют данные литературы, важное значение в развитии и прогрессировании ХГН отводится системе антиоксидантной защиты [8, 9], среди компонентов которой интерес вызывает гормон параоксоназы-2.

Уменьшение продукции данного фермента способствует снижению резервов антиоксидантной защиты, прогрессированию гломерулосклероза, а также снижению почечной функции [9].

Изучению генетических основ хронического гломерулонефрита посвящен ряд работ [10, 11, 12]. В России такие исследования затрагивают лишь узкий набор локусов: интегральных мембранных белков [13], факторов некроза опухоли [14], интерлейкинов [15, 16]. Следует отметить, что результаты исследований разных авторов не дают однозначного ответа о патогенетической роли отдельных полиморфизмов генов системы антиоксидантной защиты при хроническом гломерулонефрите. Это диктует необходимость проведения дальнейших исследований в данной области.

Наиболее близким аналогом по своим признакам, принятым за прототип, является «Способ оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом на основе данных о полиморфизме генов интерлейкинов» по заявке на патент РФ № 2009101480, опубликованной 27.07.2010 г. Способ оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, выявление аллелей и генотипов генов интерлейкинов, отличающийся тем, что делают вывод о снижении почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом в следующих случаях: выявлении носительства аллеля - 889С гена интерлейкина 1А - 889С/Т IL-1A или аллеля - 592А гена интерлейкина 10-592С/А IL-10 или выявлении носительства аллеля - 511 Т гена интерлейкина 1В - 511 С/Т IL-1B в сочетании с нефротическим синдромом на момент первого обследования и наличия артериальной гипертензии в течение ХГН, или выявления генотипа 4R/4R гена антагониста рецептора интерлейкина 1 VNTR IL-1Ra.

Недостатком данного способа является использование для прогнозирования почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом лишь данных о полиморфизме генов интерлейкинов (трех генов интерлейкинов IL-1A, IL-1B, IL-1Ra).

Задачей настоящего исследования является разработка способа прогнозирования почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом на основе данных о полиморфизме гена параоксоназы-2 (S311C PON2).

Технический результат использования изобретения - получение критериев прогноза характера течения хронического гломерулонефрита, позволяющих в кратчайшие сроки определить клинический прогноз и стратегию терапии данного заболевания.

Поставленная задача решается предлагаемым способом прогнозирования почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом, включающим выделение ДНК из периферической венозной крови, выявление генотипов и аллелей гена параоксоназы-2 (S311 С PON2) и прогнозирование снижения почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом при выявлении аллеля 311S PON2.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность определения особенностей течения хронического гломерулонефрита по наличию аллелей гена параоксоназы-2 (S311 C PON2).

Способ осуществлялся следующим образом.

Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 8-9 мл, взятая из локтевой вены пробанда. Забор венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0), тщательно перемешивали и хранили при температуре 4°С не более одной недели.

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществлялось методом фенольно-хлороформной экстракции в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляли 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-НСl (рН=7,6). Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при 4°С, 4000 об./мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензировали. Затем прибавляли 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубировали образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производили отбор водной фазы. ДНК осаждали из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяли в бидистиллированной, деионизованной воде и хранили при -20°С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Анализ локуса S311 С PON2 осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПНР) синтеза ДНК. ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик-МС4» производства компании "ДНК-технология" с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы "Силекс-М" и олигонуклеотидных праймеров, синтезированных фирмой «Синтол»:

F: 5'-аса tgc atg tac ggt ggt ctt ata-3'

R: 5'-agc aat tca tag aaa att aat tgt ta-3'

Реакция проводилась в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-НСl (рН=8,8), 1,25 мМ MgCl₂, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняли 35 циклов амплификации по схеме: денатурация - 1 мин при 95°С; отжиг праймеров - 1 мин при 63°С; элонгация - 1 мин при 72°С. Затем пробы выдерживали 6 мин при 72°С и охлаждали.

После проведения ПЦР анализировали фрагменты длиной 265 п.н. Нуклеотидная последовательность полученного амплификата представлена ниже:

acatgcatgt acggtggtct tatattcata ctttgtatcc cctgaatagg ttctccgcat ccagaacatt ctat c^{^} tgag a agcctacagt gactacagtt tatgccaaca atgggtctgt tctccaagga agttctgtag с c^{^}tcag tgta tgatgggaag ctgctcatag gcactttata ccacagagcc ttgtattgtg aactctaaat tgtacttttg gcatgaaagt gcgataact taacaattaattttctatgaa ttgct

При ПДРФ-анализе использовалась рестриктаза BstDEI (сайт рестрикции C TNAG), продукты рестрикции анализировали в 2%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в течение 20 мин при 200V.

Был исследован полиморфизм (S311 С PON2), связанный с заменой аминокислоты серина на цистеин в 311 кодоне полипептида. В качестве электрофорезного буфера применяли 1xTAE (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицировали в проходящем УФ-свете. Фрагменты длиной 142 и 123 п.н. соответствовали аллелю 311 C гена PON2; 123, 75 и 67 п.н. - аллелю 311S, фрагменты длиной 142, 123, 75 и 67 п.н. наблюдались у гетерозигот 311SC. На фиг.1. показано электрофоретическое разделение продуктов амплификации локуса S311 С PON2, где 1, 3, 4, 6, 8, 11 - гомозиготы 311SS; 2, 5, 7, 10, 13 - гомозиготы 311СС; 9, 12 - гетерозиготы 311SC.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляли с использованием программы «STATISTICA 6.0» [19]. Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использовали критерий ², наблюдаемую гетерозиготность, ожидаемую гетерозиготность, индекс фиксации Райта. Влияние генетических и средовых факторов на почечную выживаемость изучали с помощью метода множительных оценок Каплан-Майера и монофакторного анализа с использованием регрессионной модели Кокса.

Метод Каплан-Майера использовали для анализа точных интервалов до наступления исхода в каждом наблюдении. В анализ включали значения двух столбцов таблицы данных: зависимым признаком являлось время до наступления изучаемого исхода, а независимым - показатель законченности наблюдения (индикатор цензурирования) [17, 18]. Результаты получали в виде медианы времени до наступления изучаемого исхода в сопоставляемых группах (пациенты с генотипами 311SC, 311SS и 311СС PON2) и точного значения уровня значимости р.

С использованием метода множительных оценок Каплан-Майера [17] установлено, что почечная выживаемость больных ХГН, являющихся носителями аллеля 311S PON2 (генотипы 311SS и 311SC PON2) ниже, чем у пациентов с генотипом 311СС PON2 (р=0,05).

Монофакторный анализ почечной выживаемости с использованием регрессионной модели Кокса выявил, что аллель 311S PON2 является независимым фактором, снижающим почечную выживаемость (р=0,01).

В качестве конкретного примера проведен анализ результатов наблюдений 238 больных хроническим гломерулонефритом. Среди больных ХГН мужчин было 127 человек (53,4%), женщин - 111 (46,6%). Средний возраст больных составил 39,58±14,58 лет (варьировал от 15 до 76 лет).

При оценке почечной выживаемости у больных ХГН в зависимости от генетического полиморфизма гена параоксоназы-2 (S311 С PON2), проведенной с использованием метода множительных оценок Каплан-Майера [17], найдены статистически значимые взаимосвязи со скоростью прогрессирования заболевания по данному локусу. Нами установлено, что почечная выживаемость больных ХГН с генотипами 311SC и 311SS PON2 (р=0,05) ниже, чем у носителей генотипа 311СС PON2. На фиг.2. отражена зависимость почечной выживаемости у больных ХГН от генотипов полиморфного маркера S311 С PON2 (р=0,05). Медиана времени до наступления изучаемого исхода пациентов с аллелем 311S PON2 (генотипы 311SS и 311SC PON2) составила 72,00 месяца, а для больных с генотипом 311СС PON2 - 276,00 месяцев (р=0,05).

С помощью монофакторного анализа почечной выживаемости (регрессионная модель Кокса) установлено, что наличие аллеля 311S гена PON2 ухудшает почечную выживаемость (р=0,01).

Таким образом, наличие аллеля 311S PON2 у больных хроническим гломерулонефритом ассоциировано со снижением почечной выживаемости.

Литература

1. Корякова Н.Н., Рождественская Е.В., Валамина И.Е. Прогнозирование развития хронической почечной недостаточности при хроническом гломерулонефрите // Врач. - 2006. - № 6. - С.63-65.

2. Макарова Ю.А., Шишкин А.Н., Эрман М.В. и др. Ретроспективная оценка течения хронического гломерулонефрита, дебютировшего в детском возрасте // Нефрология. - 2006. - Т.8, № 3. - С.38-42.

3. Мовчан Е.А. Дисфункция эндотелия и тромбоцитов при хронической болезни почек: новый взгляд на старую проблему нарушений в системе гемостаза у больных гломерулонефритом // Бюллетень сибирской медицины, Приложение № 2. - 2008. - С.88-96.

4. Кутырина И.М. Применение ингибитора ангиотензин-превращающего фермента при первичных поражениях почек и диабетической нефропатии // Consilium Medicum. - 2002. - т.7, № 4. - С.331-333.

5. Бадаева С.В., Томилина Н.А., Бикбов Б.Т. и др. Структурно-функциональные изменения миокарда при прогрессирующей хронической почечной недостаточности // Нефрология и диализ. - 2006. - Т.8, № 3. - С.232-239.

6. Ткалич Л.М., Зибницкая Л.И., Калюжина Е.В. Факторы, влияющие на качество жизни больных с хронической почечной недостаточностью // Нефрология. - 2006. - Т.10, № .1. - С.40-44.

7. Rutkowski В. Highlights of the epidemiology of renal replacement therapy in Central and Eastern Europe // Nephrol Dial Transplant. - 2006. - V.21. - P.4-10.

8. Смирнов А.В. Факторы, определяющие уровень показателей липидного обмена у больных гломерулонефритом без нарушения функции почек и при ХПН на фоне консервативной терапии // Нефрология. - 2000. - Т.4, № 1. - С.24-43.

9. Нефрология: Руководство для врачей / Под ред. И.Е.Тареевой. - М.: Медицина, 2000. - 668 с.

10. Белянская Т.В., Петросян.Э.К., Ильенко Л.И. Полиморфизм гена PAI-1 у детей с хроническим гломерулонефритом // Материалы четвертого Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - Москва. - 2005. - С.179-180.

11. Shu К.Н., Cheng С.Н., Wu M.J. et al. Interleukin 1 Receptor Antagonist and Tumor Necrosis Factor- Gene Polymorphism in Patients with End-Stage Renal Failure // Renal Failure. - 2005. - Vol.27, № 1. - P.53-57.

12. Шестаков А.Е., Камышова B.C., Кутырина И.М. и др. Ассоциация полиморфных маркеров D6S2414 и D6S1271, расположенных в локусе МНС (6р21.31), с хроническим гломерулонефритом среди русских г.Москвы // Генетика. - 2006. - Т.42, № 12. - С.1727-1730.

13. Шестаков А.Е. Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом // Автореферат дисс к.м.н. - М., 2006. - 25 с.

14. Некипелова Е.В., Калмыкова Е.В., Чурносов М.И. Клиническое и молекулярно-генетическое исследование больных с хроническим гломерулонефритом // Вестник новых медицинских технологий. - 2006. - Т.13, № 6. - С.170-173.

15. Петросян Э.К., Ильенко Л.И., Цыгин А.Н. и др. Полиморфизм гена CTLA-4 у детей с хроническим гломерулонефритом // Иммунология. - 2007. - Т.28, № 1. - С.7-9

16. Калмыкова Е.В. Исследование ассоциаций полиморфных маркеров генов интерлейкинов с хроническим гломерулонефритом // Автореферат дисс к.б.н. - М., 2009. - 18 с.

17. Боровиков В. Statistica. Искусство анализа данных на компьютере. - СПб.: «Питер». - 2003. - 502 с.

18. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. - М.: Медиасфера. - 2002. - 311 с.

19. http://xfun.ru/soft/12288-statistica-6.0.html.