способ кардиопротекции

Формула изобретения

Способ кардиопротекции путем направленной доставки в подвергшийся ишемии-реперфузии миокард лекарственного препарата, отличающийся тем, что в качестве носителя лекарственного вещества используют аминированные кремнеземные наночастицы диаметром 10 нм, к которым прививают спейсер, на каждую функциональную группу которого иммобилизируют лекарственный препарат одним из методов: ковалентное связывание, координационно-ионное взаимодействие, адсорбционная иммобилизация.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для защиты миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения у пациентов с ишемической болезнью сердца.

Эффективность защиты миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения может быть существенно повышена при обеспечении направленной доставки лекарственных препаратов с кардиопротективной активностью в ишемизированный миокард при помощи наноразмерных носителей. Направленная доставка лекарственных препаратов с использованием таких носителей решает несколько актуальных задач. Она приводит к понижению токсичности, увеличению биодоступности, растворимости и стабильности препарата (Singh R., Lillard J.W. Jr. Nanoparticle-based targeted drug delivery. Exp Mol Pathol 2009; 86(3): 215-223). Целый ряд препаратов с доказанной в эксперименте кардиопротективной активностью не нашел широкого применения в клинической практике вследствие наличия серьезных побочных эффектов, которые могут быть ослаблены или полностью устранены при направленной доставке. Внутривенное введение таких ангиогенных факторов роста, как сосудистый эндотелиальный фактор роста и фактор роста фибробластов, сопряжено с развитием вазодилатации и артериальной гипотензии (Epstein S.Е., Kornowski R., Fuchs S., Dvorak H.F. Angiogenesis therapy: amidst the hype, the neglected potential for serious side effects. Circulation 2001; 104(1): 115-119). Системное введение триггера прекондиционирования миокарда брадикинина сопровождается наступлением артериальной гипотензии и бронхоспазма (Cyr М., Eastlund Т., Blais С. Jr., Rouleau J.L., Adam A. Bradykinin metabolism and hypotensive transfusion reactions. Transfusion 2001; 41(1): 136-150).

Среди различных наночастиц в качестве переносчиков лекарственных препаратов в настоящее время наиболее активно изучаются липосомы, фосфолипидные и полимерные мицеллы, наноэмульсии, полимерные биодеградируемые наночастицы, дендримеры и наночастицы кремнезема.

Существуют два метода направленной доставки - пассивный и активный перенос. Активная доставка лекарственных препаратов в поврежденные ткани предполагает маркирование поверхности наночастиц антителами или иными распознающими элементами, которые обеспечивают высокоизбирательное связывание наночастиц с антигенами, экспрессирующимися на поверхности поврежденных клеток (McNeeley К.М., Karathanasis E., Annapragada A.V., Bellamkonda R.V. Masking and triggered unmasking of targeting ligands on nanocarriers to improve drug delivery to brain tumors. Biomaterials 2009; 30(23-24): 3986-3995).

Известен способ направленной активной доставки в поврежденный миокард упакованного в липосомы сосудистого эндотелиального фактора роста за счет присоединения к поверхности липосом моноклональных антител против Р-селектина (Scott R.С., Rosano J.М., Ivanov Z., Wang В., Chong P.L., Issekutz А.С., Crabbe D.L., Kiani М.F. Targeting VEGF-encapsulated immunoliposomes to MI heart improves vascularity and cardiac function. FASEB J 2009; 23(10): 3361-3367). Описан способ активной направленной доставки АТФ в миокард с помощью липосом, имеющих на своей поверхности моноклональные антитела против миозина (Liang W., Levchenko Т., Khaw В.A., Torchilin V. ATP-containing immunoliposomes specific for cardiac myosin. Curr Drug Deliv 2004; 1(1): 1-7).

Недостатки этих способов следующие.

1. Указанные способы кардиопротекции применялись только на модели перманентной окклюзии коронарной артерии, которая не соответствует современным стандартам лечения острого коронарного синдрома, предусматривающим скорейшее восстановление кровотока по инфаркт-зависимой артерии. Полученные результаты невозможно сравнивать с современными результатами лечения острого коронарного синдрома (Brodie В.R., Webb J., Сох D.A., Qureshi М., Kalynych A., Turco М., Schultheiss H.P., Dulas D., Rutherford В., Antoniucci D., Stuckey Т., Krucoff M., Gibbons R., Lansky A., Na Y., Mehran R., Stone G.W., EMERALD Investigators. Impact of time to treatment on myocardial reperfusion and infarct size with primary percutaneous coronary intervention for acute myocardial infarction (from the EMERALD Trial). Am J Cardiol 2007; 99(12): 1680-1686).

2. Положительный эффект заключается только в улучшении сократимости миокарда левого желудочка и уменьшении площади постинфарктного рубца, а не с прямым предотвращением гибели кардиомиоцитов в зоне ишемии (Scott R.С., Rosano J.М., Ivanov Z., Wang В., Chong P.L., Issekutz А.С., Crabbe D.L., Kiani М.F. Targeting VEGF-encapsulated immunoliposomes to MI heart improves vascularity and cardiac function. FASEB J 2009; 23(10): 3361-3367). Это связано с накоплением лекарственных наночастиц в периинфарктной зоне, а не в зоне ишемии.

3. Использование моноклональных антител в качестве направляющих лигандов редко позволяет создать воспроизводимый результат. Это связано со специфичностью антител, существенно отличающейся от партии к партии (Fernandes D. Demonstrating comparability of antibody glycosylation during biomanufacturing. Eur Biopharm Rev 2005; 106-110).

4. Применение моноклональных антител в качестве направляющего лиганда существенно удорожает технологию производства описанных лекарственных форм.

Пассивный перенос в настоящее время хорошо описан применительно к опухолям и происходит за счет преимущественного выхода лекарственных наночастиц в ткань опухоли вследствие локального повышения проницаемости опухолевых микрососудов (Matsumura Y., Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res 1986; 46: 6387-6392). Для дополнительного повышения проницаемости микрососудов в ткани-мишени могут применяться такие физические факторы, как ультразвук и гипертермия.

Известен способ получения наноразмерной системы доставки лекарственных средств с добавлением поверхностно активных веществ для создания медицинских и ветеринарных препаратов, используемых в качестве систем целевой доставки лекарственных средств и преодоления гематоэнцефалического барьера, отличающийся тем, что в качестве носителя используются наночастицы кремнезема (заявка на изобретение 2007136310). Однако эта система не позволяет достичь желаемого кардиопротективного эффекта, поскольку лекарственное вещество адсорбируется непосредственно на носителе, что может приводить к нежелательным побочным эффектам (Epstein S.Е., Kornowski R., Fuchs S., Dvorak H.F. Angiogenesis therapy: amidst the hype, the neglected potential for serious side effects. Circulation 2001; 104(1): 115-119)

Известен способ направленной доставки лекарственных препаратов в миокард, выбранный нами в качестве прототипа, основанный на использовании нагруженных аденозином липосом с диаметром 134 нм на модели ишемии-реперфузии миокарда у крысы (Takahama H., Minamino Т., Asanuma H. et al. Prolonged targeting of ischemic/reperfused myocardium by liposomal adenosine augments cardioprotection in rats. J Am Coll Cardiol 2009; 53(8): 709-717). Суспензия нагруженных аденозином липосом в физиологическом растворе вводилась животным однократно внутривенно в дозах (в пересчете на аденозин) 50, 150 и 450 мкг/кг×мин в течение 10 минут, начиная с 25-й минуты ишемии. Таким образом, инфузия продолжалась в течение последних 5 минут ишемии и первых 5 минут реперфузии миокарда. Применение данного способа сопровождалось менее выраженными побочными гемодинамическими эффектами и более выраженным инфаркт-лимитирующим действием, чем использование эквивалентной дозы свободного аденозина.

Этот способ имеет ряд недостатков.

1. Быстрая элиминация наночастиц-носителей из кровотока элементами ретикуло-эндотелиальной системы, что связано с их диаметром, превышающим 100 нм (Wang A.Z., Gu F., Zhang L. et al. Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications. Expert Opin Biol Ther. 2008; 8(8): 1063-1070).

2. Отсутствие возможности одновременной направленной доставки препаратов различного химического строения.

3. Высокая стоимость материала носителя.

4. Невысокий кардиопротективный эффект вследствие низкого высвобождения лекарственного препарата из материала носителя.

5. Невозможность управления процессом высвобождения лекарственного препарата из материала носителя за счет варьирования способа их связывания.

Целью изобретения является повышение эффективности способа.

Это достигается тем, что в качестве носителя берутся наночастицы аминированного кремнезема диаметром 10 нм, к которым прививаются молекулы-вставки (спейсеры). Лекарственный препарат иммобилизируется на спейсер. На каждую функциональную группу спейсера иммобилизируют молекулу лекарственного препарата. Лекарственные препараты могут иметь разное химическое строение. Скорость высвобождения препарата из поверхностного слоя носителя зависит от способа иммобилизации. Используются три варианта иммобилизации лекарственного препарата: ковалентное связывание, координационно-ионное взаимодействие, адсорбционная иммобилизация. Комплекс «лекарственный препарат-носитель» вводят внутривенно непосредственно перед реперфузией.

Положительный эффект от внедрения предлагаемого способа заключается в повышении кардиопротективного эффекта и снижении побочных эффектов комплекса «лекарственный препарат-носитель» на интактные органы и ткани. Способ позволяет управлять скоростью высвобождения лекарственного препарата из материала носителя, а также сочетать применение препаратов с различным механизмом действия. В клинической практике способ может применяться у пациентов с нестабильной стенокардией, а также у пациентов с острым коронарным синдромом в дополнение к проведению чрескожного коронарного вмешательства.

Способ осуществляется следующим образом.

Для достижения результата проводится модификация поверхности кремнезема аминогруппами по методу хемосорбции 3-аминопропилтриэтоксисилана из газовой фазы в проточном реакторе. Конструкция реактора обеспечивает испарение реагента при температуре 220°С, хемосорбцию, удаление избытка реагента и побочных продуктов реакции. Во избежание уноса кремнезема потоком газа-носителя, реакционная зона верхней части реактора ограничена пористым фильтром.

Методика синтеза включает удаление физически связанной воды с поверхности кремнезема при температуре 220°С в течение 2 часов, хемосорбцию 3-аминопропилтриэтоксисилана при температуре 220°С в течение 3 часов, удаление избытка реагентов и побочных продуктов реакции при той же температуре в течение 2 часов.

Гидролиз непрореагировавших с поверхностью кремнезема алкоксигрупп проводится обработкой образца парами воды в течение часа при температуре 200°С.

Синтез спейсера проводится следующим образом. Навеска 100 мг аминированного кремнезема обрабатывается раствором симметричного ангидрида 3-(восамино)октановой кислоты в хлористом метилене.

Симметричный ангидрид получается карбодиимидным методом по следующей методике. Смешивается в эквимолярном соотношении дициклогексилкарбодиимид и 3-(восамино)октановая кислота, оставляется раствор на 10 минут, затем отфильтровывается осадок дициклогексилмочевины. В растворе получается симметричный ангидрид 3-(восамино)октановой кислоты.

При синтезе используется 10-ти кратный избыток ангидрида 3-(восамино)октановой кислоты по отношению к доступным аминогруппам. Далее проводится деблокирование привитой аминокислоты в течение 1 часа с помощью муравьиной кислоты. Депротонирование осуществляется, используя 10% раствор триэтиламина в хлористом метилене. На заключительной стадии образец сушится под вакуумом при температуре 60°С.

Затем проводится иммобилизация лекарственного препарата с помощью одного из трех методов: ковалентное связывание, координационно-ионное взаимодействие или адсорбция. В качестве модельного объекта был использован брадикинин, который ковалентно иммобилизировали на поверхности аминированного кремнезема с привитым спейсером карбодиимидным методом.

0,5 мг брадикинина заливается 1 мл янтарного ангидрида, отфильтровывается, полученный раствор помещается в пробирку, содержащую 50 мг аминированного кремнезема и оставляется на 2 часа для протекания реакции.

Суспензия препарата в гидрохлориде натрия готовится в концентрации 2 мг/мл. Берется 20 мг препарата, помещается в стеклянный стаканчик и заливается 10 мл физиологического раствора. Полученная смесь взбалтывается и помещается в ультразвуковой диспергатор на 2 минуты. Полученный раствор препарата хранится в холодильнике при температуре 4°С. Раствор применяется для внутривенных инъекций.

Для подтверждения возможности получения технического результата заявленного способа были проведены эксперименты на модели ишемии-реперфузии миокарда с количественной оценкой биораспределения и биосовместимости наночастиц кремнезема. Все эксперименты были проведены в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (публикация Национального Института Здоровья, США № 85-23).

Материал исследования. Эксперименты выполнялись на крысах-самцах линии Wistar массой 220-300 г (питомник «Рапполово»), содержавшихся в условиях 12/12 часового светового режима и получавших стандартный корм и питьевую воду ad libitum.

Методика регионарной ишемии-реперфузии миокарда. Для наркоза использовался хлоралгидрат в дозе 450 мг/кг внутрибрюшинно, с последующей поддерживающей внутривенной инфузией через катетер, помещенный в бедренную вену. В ходе эксперимента проводилась искусственная вентиляция легких через трахеостому (частота дыхания - 50/мин, дыхательный объем - 3 мл/100 г массы тела) и измерение параметров системной гемодинамики (пульсовое артериальное давление (АД) и частота сердечных сокращений (ЧСС)) датчиком давления (Baxter, США) через катетер, введенный в аорту через общую сонную артерию, и регистрировали на компьютере с помощью программного обеспечения PhysExp Gold. Доступ к сердцу производили путем торакотомии в четвертом межреберье слева. Тупо вскрывали перикард, определяли локализацию общего ствола левой коронарной артерии (ЛКА), под который с помощью атравматической иглы (6-0) подводили тонкую полипропиленовую лигатуру. Общий ствол ЛКА определяли, ориентируясь слева на ушко левого предсердия, а справа - на конус легочной артерии. Для создания обратимой ишемии миокарда формировали окклюдер.

Протокол экспериментов и измерения. Животные были рандомизированы на три группы:

1. Первая группа животных (n=3) включала в себя крыс, подвергшихся изъятию органов (сердце и печень) без предварительного проведения хирургических манипуляций.

2. Животным из второй группы (n=5) также производилось вскрытие грудной клетки без подведения лигатуры. На 25-й минуте торакотомии начинали внутривенную капельную инфузию суспензии наночастиц кремнезема в концентрации 2 мг/мл 0,9% раствора натрия хлорида, причем длительность инфузии составляла 10 минут. Через 55 минут после окончания введения суспензии наночастиц производили забор органов - сердца и печени.

3. Третья группа животных (n=3) включала в себя крыс, которым осуществляли механическую окклюзию ЛКА с помощью подведенной полипропиленовой лигатуры. Длительность ишемии составляла 30 минут. Затем лигатуру снимали для восстановления кровотока. Длительность периода реперфузии - 60 минут. На 25-й минуте ишемии начинали внутривенное капельное введение раствора наночастиц той же концентрации, что и в группе 2, причем введение заканчивали на 5-й минуте реперфузии. После окончания периода реперфузии затягивали лигатуру и внутривенно струйно вводили 5%-ный раствор синего Эванса в объеме 1 мл, далее производили забор органов - сердца и печени.

Гемодинамические параметры регистрировали в исходном состоянии, после подведения лигатуры под ЛКА, через 30 минут после подведения лигатуры, а также через 30 и 60 минут после начала реперфузии.

Оценка биораспределения. После изъятия органов совершали их однократное промывание дистиллированной водой. В третьей группе животных образцы миокарда для последующего анализа выбирали с учетом окрашивания синим Эванса (вырезали участки миокарда, не окрашенные красителем, т.е. относящиеся к анатомической зоне риска). В первой и второй экспериментальных группах для дальнейших манипуляций выделяли весь объем левого желудочка. Во всех экспериментах в качестве образцов печени выбирались аналогичные ее доли. После забора органов проводилось высушивание полученных тканей в термостате при температуре 90°С в течение 24 часов с доведением образцов до постоянной массы.

Следующим этапом был анализ содержания кремния в образцах с помощью метода атомно-абсорбционной спектроскопии, суть которого заключается в просвечивании атомизированной пробы монохромным светом с последующим разложением прошедшего через пробу света световым диспергатором и фиксацией спектра поглощения. Высушенный образец ткани взвешивался, далее проводилась его мокрая минерализация по одной из двух схем:

1) Разложение концентрированной азотной кислотой под давлением во фторопластовом стакане (СВЧ-система «Минотавр»);

2) Разложение в открытой системе смесью концентрированной азотной кислоты и перекиси водорода (1:1) в стеклоуглеродном тигле.

Полученный минерализат анализировали на атомно-абсорбционном спектрометре с электротермической атомизацией и Зеймановской коррекцией неселективного поглощения МГА-915 (лампа с полым катодом на кремний =251,6 нм; в качестве химического модификатора применяется концентрированный раствор аммиака). Далее концентрацию кремния, найденную в минерализате, пересчитывали на сухую массу пробы и выражали в мкг/г.

Гемодинамические данные, а также уровни содержания кремния в тканях представляли в виде «среднее ± стандартное отклонение».

Гемодинамические показатели. Исходное значение среднего артериального давления составило 113±11 мм рт. ст. (таблица 1) в группе № 2 и 120±8 мм рт. ст. в группе № 3. Достоверных различий в величине среднего артериального давления между двумя группами экспериментов не наблюдалось. В ходе экспериментов в обеих группах отмечалось постепенное снижение величины артериального давления. Введение наночастиц кремнезема не вызывало значимых изменений уровня артериального давления. Исходная величина частоты сердечных сокращений составляла 359±39 уд./мин. (таблица 2) в группе № 2 и 315±16 уд./мин. в группе № 3. Величины частоты сердечных сокращений достоверно не различались между группами в соответствующих точках. Внутривенная инфузия суспензии наночастиц кремнезема не сопровождалась достоверными изменениями величины частоты сердечных сокращений.

Таблица 1
Значения среднего артериального давления в экспериментах с введением наночастиц кремнезема (среднее значение ± стандартное отклонение)
	Введение наночастиц кремнезема (n=5)	Ишемия-реперфузия + введение наночастиц кремнезема (n=3)
Среднее артериальное давление, мм рт. ст.
Исходно	113±11	120±8
После подведения лигатуры/лигирования ЛКА	91±20	104±11
Через 30 минут после подведения лигатуры	86±3	99±7
Через 60 минут после подведения лигатуры	88±15	96±2
Через 90 минут после подведения лигатуры	78±21	78±13

Таблица 2
Значения частоты сердечных сокращений в экспериментах с введением наночастиц кремнезема (среднее значение ± стандартное отклонение)
	Введение наночастиц кремнезема (n=5)	Ишемия-реперфузия + введение наночастиц кремнезема (n=3)
Среднее значение частоты сердечных сокращений
Исходно	359±39	315±16
После подведения лигатуры/лигирования ЛКА	313±30	305±24
Через 30 минут после подведения лигатуры	284±60	298±32
Через 60 минут после подведения лигатуры	278±53	282±22
Через 90 минут после подведения лигатуры	303±59	298±34

Биораспределение. На фиг. приведено содержание кремния в миокарде и печени животных различных экспериментальных групп по данным атомно-абсорбционной спектроскопии: 1 - фоновое содержание; 2 - введение наночастиц; 3 - введение наночастиц после ишемии-реперфузии. Фоновое содержание кремния в печени составляло 3,8±2,25 мкг/г. В экспериментах с внутривенной инфузией наночастиц кремнезема отмечалось резкое увеличение содержания кремния в печени, по уровню значительно превосходящее его содержание в сердце, что свидетельствует об активном захвате наночастиц элементами ретикуло-эндотелиальной системы печени, в частности, клетками Купфера. Так, например, уровень кремния в печени в группе ложнооперированных животных составлял 229±80 мкг/г, а в группе с ишемией-реперфузией миокарда - 306±56 мкг/г. При этом разница между указанными группами была недостоверной. С другой стороны, введение наночастиц кремнезема не сопровождалось достоверным увеличением содержания кремния в сердце по сравнению с фоновым значением у интактных животных (фиг.). Напротив, при этом отмечалась тенденция к уменьшению содержания кремния в ткани сердца. Введение наночастиц кремнезема на фоне ишемии-реперфузии миокарда приводило к значительному возрастанию содержания кремния в 2-х из 3-х экспериментов группы № 3.

Выводы:

1. При внутривенном введении наночастиц кремнезема со средним диаметром 10 нм животным с ишемией-реперфузией миокарда наблюдается их преимущественное накопление в зоне повреждения, что обосновывает перспективы использования данного носителя для пассивной направленной доставки лекарственных средств в ишемизированный миокард.

2. Эффективность предложенного способа кардиопротекции существенно превосходит существующие, поскольку внутривенное введение системы направленной доставки животным с ишемией-реперфузией миокарда сопровождается увеличением содержания материала носителя в зоне ишемии-реперфузии более чем в 10 раз (фиг.), тогда как при использовании прототипа в зоне повреждения наблюдалось только 5-и кратное превышение содержания комплекса «препарат-носитель» над контролем.

3. Предложенный носитель для направленной доставки лекарственных средств в ишемизированный миокард, а именно, наночастицы кремнезема диаметром 10 нм, обладает хорошей биосовместимостью и биодеградируемостью.

4. Использование различных способов химического связывания лекарственного средства с поверхностью наночастиц кремнезема дает возможность управлять процессом высвобождения лекарственного средства из поверхностного слоя носителя.

5. Функционализация поверхности наночастиц кремнезема обеспечивает возможность присоединения лекарственных средств разного химического строения в различных соотношениях.