устойчивая пероральная фармацевтическая композиция, содержащая агонисты рецепторов тиреоидных гормонов

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для предотвращения, ингибирования или лечения заболевания, связанного с нарушением метаболизма, или которое зависит от экспрессии гена, регулируемого трийодтиронином (Т₃), подходящая для перорального введения, включающая:

(i) соединение формулы 1А:



или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир;

(ii) по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый эксципиент; и

(iii) кишечно-растворимое покрытие.

2. Композиция по п.1, где инертное покрытие предоставлено между той частью композиции, которая содержит соединение (i) и энтеросолюбильное покрытие (iii).

3. Композиция по п.1, где энтеросолюбильное покрытие включает акрилатный полимер, метакрилатный полимер или сополимер акрилата-метакрилата.

4. Композиция по п.1, представленная в форме таблетки с энтеросолюбильным покрытием и содержащая следующие ингредиенты: маннит, микрокристаллическую целлюлозу, гипромеллозу, стеарат магния, воду, сополимер метакриловой кислоты-этилакрилата (1:1), тальк и триэтилцитрат.

5. Композиция по п.1, где 5% или менее соединения формулы I высвобождается, по меньшей мере, через один час, когда высвобождение измеряется в приборе II по Фармакопее США в 500 мл имитированной желудочной жидкости или 0,1 N HCl при 37°С при скорости перемешивания 50 об./мин.

6. Композиция по п.1, дополнительно содержащая антиоксидант.

7. Композиция по п.6, где антиоксидант выбран из аскорбиновой кислоты, фумаровой кислоты, яблочной кислоты, пропионовой кислоты, или соли любой из указанных кислот, монотиоглицерина, метабисульфита калия, бисульфита натрия, сульфита натрия, метабисульфита натрия, -токоферола, аскорбилпальмитата, бутилированного гидроксианизола, бутилированного гидрокситолуола, этилолеата и пропилгаллата.

8. Композиция по любому из пп.6 или 7, где соединение (i) и антиоксидант по существу однородно смешаны.

9. Фармацевтическая композиция для предотвращения, ингибирования или лечения заболевания, связанного с нарушением метаболизма, или которое зависит от экспрессии гена, регулируемого трийодтиронином (Т₃), подходящая для перорального введения и включающая:

(i) соединение формулы 1А:



или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир;

(ii) по меньшей мере, один антиоксидант; и

(iii) по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый эксципиент.

10. Композиция по любому из пп.1 или 9, дополнительно включающая фармакологически активный ингредиент, выбранный из гиполипидемических средств, противодиабетических средств, антидепрессантов, ингибиторов резорбции костной ткани, средств, подавляющих аппетит и/или средств против ожирения.

11. Способ стабилизации фармацевтической композиции, подходящей для перорального введения, причем фармацевтическая композиция включает:

(i) соединение формулы 1А, как определено в любом из пп.1-10, или его фармацевтически приемлемую соль или его сложный эфир; и

(ii) по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый эксципиент;

причем способ включает обеспечение композиции кишечно-растворимым покрытием.

12. Применение кишечно-растворимого покрытия в фармацевтической композиции, подходящей для перорального введения и содержащей соединение формулы 1А, как определено в любом из пп.1-10, или его фармацевтически приемлемую соль или его сложный эфир, для снижения или предотвращения нитрования указанного соединения.

13. Применение антиоксиданта в фармацевтической композиции, подходящей для перорального введения, содержащей соединение формулы 1А по любому из пп.1-10 или его фармацевтически приемлемую соль или его сложный эфир, для снижения или предотвращения нитрования указанного соединения.

14. Композиция по любому из пп.1 или 9 для применения в лечении.

15. Применение композиции по любому из пп.1-10 для получения лекарственного средства для профилактики, ингибирования или лечения заболевания, связанного с нарушением метаболизма, или которое зависит от экспрессии гена, регулируемого трийодтиронином (Т₃).

16. Способ профилактики, ингибирования или лечения заболевания, связанного с нарушением метаболизма, или которое зависит от экспрессии гена, регулируемого трийодтиронином (Т₃), причем способ включает введение композиции по любому из пп.1-10 субъекту, нуждающемуся в такой профилактике, ингибировании или лечении.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям. В частности, однако без исключений, оно относится к стратегиям составления композиций для стабилизации фармакологически активных ингредиентов фармацевтических композиций.

Для многих фармакологически активных средств предпочтительным является пероральный путь введения. Однако для того, чтобы такие средства достигали кровотока пациента, они должны обычно подвергаться воздействию содержимого, по меньшей мере, верхней части желудочно-кишечного тракта (т.е. желудка и тонкой кишки). Определенные средства чувствительны к кислотной среде желудка. Такая чувствительность обычно приводит к опосредованному кислотой гидролизу средства. Известно, что композиции, содержащие такие гидролитически чувствительные средства, обеспечиваются энтеросолюбильным покрытием. Такое покрытие в целом включает кислотный полимер, который является по существу незаряженным и нерастворимым при низком рН (т.е. в желудке), но ионизированным и более растворимым при более высоких величинах рН (т.е. после прохождения в тонкую кишку).

Соединение 1А, имеющее структуру:

Соединение 1А

описано в документе WO 01/60784 (название IUPAC 3-[[3,5-Дибром-4-[4-гидрокси-3-(1-метилэтил)фенокси]фенил]амино]-3-оксипропаноевая кислота). Соединение 1А и серия родственных соединений описаны в качестве агонистов рецепторов гормонов щитовидной железы, в частности рецептора TR . Такие соединения должны использоваться при лечении или профилактики заболеваний, связанных с метаболической дисфункцией, или которые зависят от экспрессии гена, регулирующего трийодтиронин (Т₃). Такие заболевания включают, например, ожирение, гиперхолестеринемию, атеросклероз, сердечные аритмии, депрессию, остеопороз, гипотиреоз, подагру, рак щитовидной железы, а также глаукому и застойную сердечную недостаточность.

При проведении работы по разработке препаративной формы, содержащей соединение 1А, заявители неожиданно обнаружили, что в соединении происходила нежелательная трансформация. Происходило получение продукта реакции, содержащего нитро (-NO₂) группу в орто-положении относительно гидроксильной группы на фенольном кольце (т.е. левом кольце, как изложено выше). После исследования было обнаружено, что этот продукт реакции имел измененные свойства по сравнению с не трансформированным соединением 1А, включая, к удивлению, возможность генотоксичности. После дальнейшего исследования было обнаружено, что продукт реакции мог образовываться in vivo после перорального введения. Поэтому заявители решили исследовать способ, ведущий к получению нитрованного продукта реакции, с целью ингибирования его образования после перорального введения.

Известно (например, из документа Oldrieve et al., Chem. Res. Toxicol. 1998, 11, 1574), что определенные флавоноидные соединения способны ингибировать нитрование тирозина или образование продуктов деаминирования оснований из оснований ДНК, которое происходит в кислотных условиях в присутствии нитрита. Было показано, что нитрование гидроксифенилуксусной кислоты и белков в присутствии нитрита и пероксида водорода в слюне человека in vitro может ингибироваться определенным типом восстановителя (Takahama et al., Arch. Oral Biol. 2003, 48, 679). Однако эти документы не дают возможность специалисту в данной области прогнозировать, могут ли такие реакции нитрования происходить с другими соединениями, такими как структурно отличными агонистами рецепторов тиреоидных гормонов, иллюстрируемых соединением 1А. Кроме того, они не указывают на то, что такие реакции могут иметь значение in vivo, и не предполагают прогноз возможных свойств (т.е. генотоксичности) таких нитрованных продуктов реакции.

В предшествующем уровне техники не раскрыто или не высказано предположение, что соединения, связывающие рецепторы тиреоидных гормонов, такие как указанное выше соединение 1А, могут превратиться в потенциально токсичные продукты реакции после перорального введения, не идет речь о том, как может произойти такое превращение, ни о том, как можно разрешить такую проблему.

Поэтому целью настоящего изобретения является предоставление фармацевтических композиций, при которых ослабляется указанная выше проблема нитрования определенных связывающих рецепторы тиреоидных гормонов рецепторы после перорального введения.

Соответственно, первый аспект настоящего изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, подходящую для перорального введения, включающую:

(i) соединение формулы I:

Формула I

где:

Z представляет Н или альтернативную группу, способную быть замещенной NO₂ посредством реакции нитрования на основе нитрита;

R₁ выбран из водорода, галогена, трифторметила или алкила из 1 до 6 атомов углерода или циклоалкила из 3 до 7 атомов углерода;

Х представляет кислород (-О-), серу (-S-), карбонил (-СО-), метилен (-СН ₂-) или -NH-;

R₂ и R₃ являются одинаковыми или различными и представляют водород, галоген, алкил из 1-4 атомов углерода или циклоалкил из 3-6 атомов углерода, причем, по меньшей мере, один из R₂ и R ₃ не является водородом;

R₄ представляет водород или низший алкил;

А представляет кислород (-О-), метилен (-СН₂-), -CONR₅-, -NR ₅- или -NR₅CO-;

R₅ представляет H или низший алкил;

R₆ представляет карбоновую кислоту (-СО₂Н), или ее сложный эфир, или ее пролекарство;

Y представляет -(CH ₂)_n, где n=0, 1, 2, 3, 4 или 5, и где одна или несколько из CH₂ групп может быть необязательно замещена галогеном, или Y представляет -С=С-, которая может быть цис или транс; и

R₇ представляет водород или алканоильную или ароильную группу, или другую группу, способную к биопревращению для генерирования свободной фенольной структуры (где R₇ = H);

включая все его стереоизомеры или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир;

(ii) по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый эксципиент; и

(iii) энтеросолюбильное покрытие.

Соединения формулы I , в частности, можно применять в качестве агонистов рецепторов тиреоидных гормонов. В частности, многие такие соединения проявляют повышенную активность на рецепторе TR (а не TR ).

Композиция по первому аспекту изобретения основана на удивительной находке заявителей в результате указанных выше исследований, что нитропродукт реакции соединения 1А образуется после перорального введения посредством реакции нитрования на основе нитрита. Реакция нитрования на основе нитрита требует для своего протекания умеренно низкого рН (примерно 2). Путем обеспечения композиции энтеросолюбильным покрытием (т.е. покрытием, которое остается интактным в кислотной среде желудка и растворяется только после прохождения композиции в тонкую кишку, где рН ближе к нейтральному), реакция нитрования значительно ингибируется. Присутствие энтеросолюбильного покрытия предотвращает воздействие на фармакологически активное соединение формулы I кислотной среды желудка, посредством этого предотвращая образование нитритного реагента вблизи указанного активного соединения. Поэтому следствием энтеросолюбильного покрытия является то, что после перорального введения соединения формулы I реакция нитрования ослабляется. Следует подчеркнуть, что мотивация заявителей понять и попытаться ослабить реакцию нитрования привела к неожиданному получению нитрированного продукта реакции соединения 1А во время работы по разработке препаративной формы. Такая реакция нитрования также происходит у других соединений формулы (I), включая, например, соединение GC-1, показанное ниже. Если бы этот нитрированный продукт реакции не был выявлен, не было бы причины определять его потенциальную генотоксичность. Конечно, без знания потенциальной токсичности (или других нежелательных свойств) такого продукта реакции не было бы побуждения предпринять попытку предотвращения его образования.

Применимость настоящего изобретения не ограничивается стабилизацией соединения 1А. Скорее, все соединения в соответствии с данным первым аспектом изобретения должны приобрести некоторую степень стабилизации посредством ослабления реакции нитрования, которая склонна к протеканию после перорального введения. Нитрование любого соединения формулы I может привести к изменениям фармакологического и/или токсикологического профилей соединения или равным образом может воздействовать на его фармакокинетику. Нитропродукты реакции таких соединений могут быть потенциально генотоксичными. В определенных случаях можно также предотвратить дополнительные реакции в кислотной среде (например, освобождение анилина, который сам является потенциально генотоксичным). Кроме того, могут также происходить реакции нитрования в не первичном (например, правом, как представлено выше) кольце при низком рН посредством электрофильного ароматического замещения. Энтеросолюбильное покрытие также ингибирует или предотвращает образование этих нитропродуктов реакции. В любом случае способность регулировать и/или предотвращать такие химические модификации соединений формулы I будет в целом полезным инструментом для специалиста, составляющего препаративную форму.

Композиции в соответствии с первым аспектом изобретения обеспечивают возможность высвобождения соединений формулы I из композиции только после того, как оно прошло из желудка в кишечник, и в этот момент энтеросолюбильное покрытие начинает растворяться и/становиться проницаемым. Однако поскольку рН в кишечнике недостаточно низкий для того, чтобы в какой-либо значительной степени происходило нитрование на основе нитрита, нитрование соединений формулы I после перорального введения значительно ослабляется.

Используемый в настоящем документе термин «алканоил» отдельно или как часть другой группы обозначает алкил, связанный с карбонильной группой. Используемый в настоящем документе термин «ароил» отдельно или как часть другой группы обозначает арил, связанный с карбонильной группой. Пока нет других указаний, используемый в настоящем документе термин «алкил» или «алк» отдельно или как часть другой группы включает и прямо- и разветвленноцепочечные углеводороды, содержащие 1-12 атомов углерода в нормальной цепи, предпочтительно, 1-4 атома углерода (в этом случае можно использовать термин «низший алкил»), такой как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, трет-бутил, или изобутил, пентил, гексил, изогексил, гептил, 4,4-диметилпентил, октил, 2,2,4-триметилпентил, нонил, децил, ундецил, додецил. Используемый в настоящем документе термин «арил» отдельно или как часть другой группы относится к моноциклическим и бициклическим ароматическим группам, содержащим 6-10 атомов углерода в кольцевой части (такой как фенил или нафтил, содержащий 1-нафтил и 2-нафтил), и может быть необязательно замещен через имеющиеся атомы углерода 1, 2 или 3 группами, выбранными из водорода, галоида, алкила, галоидалкила, алкокси, галоидалкокси, алкенила, трифторметила, трифторметокси, алкинила, гидрокси, амино, нитро, циано и/или карбоксила или его сложного алкилового эфира. Пока нет других указаний, используемый в настоящем документе термин «циклоалкил» отдельно или как часть другой группы включает насыщенные циклические углеводородные группы или частично ненасыщенные (содержащие 1 или 2 двойные связи) циклические углеводородные группы, содержащие одно кольцо, и всего от 3 до 7 атомов углерода, предпочтительно, 3-6 атомов углерода, образуя кольцо, которое включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклопентенил и циклогексенил. Используемый в настоящем документе термин «галоген» или «галоид» отдельно или как часть другой группы относится к хлору, брому, фтору и йоду, а также CF₃, причем предпочтительны хлор или бром.

Альтернативную группу, способную к замещению NO ₂, посредством реакции нитрования на основе нитрита, можно, например, выбрать из галоида (например, йод-, хлор-, бром- или фтор-, при предпочтительном первом из них) и псевдогалогенов (например, SCN, OCN, NCS, NCO и N₃).

Энтеросолюбильное покрытие предпочтительно образовано с использованием любого имеющегося в продаже полимера, полученного для такого назначения. В качестве примеров таких полимеров можно указать полимеры на основе акрилатов, метакрилатов или их сополимеров (таких как диапазон полимеров энтеросолюбильного покрытия, поступающих в продажу под названием Eudragit®) от компании Degussa/Roehm), ацетатфталата поливинила, ацетатфталата целлюлозы, ацетатсукцината гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы, ацетатсукцината гидроксметилцеллюлозы и карбоксиметилэтилцеллюлозы. В определенном варианте осуществления энтеросолюбильное покрытие включает сополимер метакриловой кислоты-этилакрилата. Составляющие мономеры такого сополимера могут присутствовать в соотношении 1:1. Энтеросолюбильное покрытие также предпочтительно содержит глянцующий компонент, такой как тальк. Также может быть включен обеспечивающий преимущество пластификатор. Подходящим пластификатором является триэтилцитрат.

Композиция с энтеросолюбильным покрытием предпочтительно составляется так, что высвобождается 5% или менее соединения формулы I, предпочтительнее, оно по существу совсем не высвобождается, по меньшей мере, через 1 час, предпочтительнее, через 2 часа, наиболее предпочтительно, через 3 часа, когда высвобождение измеряется в аппарате II для определения растворения по Фармакопее США или в 900 мл, или в 500 мл имитированной желудочной жидкости или 0,1 N HCl при 37ºС при скорости перемешивания 50 оборотов в минуту. В предпочтительных вариантах осуществления, высвобождается, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, предпочтительнее, по меньшей мере, 95% и наиболее предпочтительно, по существу все соединение формулы I, предпочтительно, в пределах 1 часа, предпочтительнее, в пределах 45 минут, когда измерение проводится в забуференной среде с рН 6,8 (например, имитированной кишечной жидкости с рН 6,8).

В некоторых обстоятельствах может быть предпочтительно, чтобы инертное покрытие было предоставлено между той частью композиции, которая содержит соединение формулы I, и энтеросолюбильным покрытием (iii). Энтеросолюбильные покрытия обычно составлены из кислотных полимеров и, следовательно, по самой их природе могут привести к вредным изменениям в определенных активных ингредиентах. Вставленное инертное покрытие (изготовленное, например, из производного целлюлозы, такого как гидроксипропилцеллюлоза или гидроксипропилметилцеллюлоза) имеет тенденцию ингибировать такие взаимодействия. Инертное покрытие, конечно, должно быть растворимым (или диспергируемым иным образом) в кишечной среде для обеспечения возможности высвобождения соединения формулы I.

Используемый в настоящем документе термин «энтеросолюбильное покрытие» предназначен для включения покрытий, наносимых на композицию/лекарственную форму (например, таблетку), в случае, если лекарственная форма приготовлена существенно другим образом, и покрытий, наносимых на промежуточных стадиях изготовления лекарственной формы. Таким образом, включены композиции, в которых соединение формулы I составлено с эксципиентами в гранулы, которые затем покрываются энтеросолюбильным покрытием перед дальнейшей переработкой, такой как прессование в таблетки или заполнение в капсулы, например желатиновые капсулы. В равной степени, для получения композиций в соответствии с первым аспектом изобретения для определенных соединений формулы I может использоваться подход, такой как описанный в документе WO 00/22909, хотя он менее предпочтителен. При таком подходе комплексы между фармакологически активными ингредиентами и относительно гидрофобными карбоновыми кислотами (например, С₉-С₃₀ алифатическими карбоновыми кислотами) получают совместным осаждением из раствора регулировкой рН.

В определенных соединениях формулы I Х представляет кислород или -СН₂-. Альтернативно, или в дополнение, А может представлять -NH-, -O-, -CH₂- или -CONR ₅-. В некоторых предпочтительных соединениях формулы I, R₁ представляет изопропил, йод- или Н. В дополнение или альтернативно, может быть предпочтительно, чтобы R₂ и R₃ каждый независимо представляли галоген или алкил. В таком случае R₂ и R₃ предпочтительно каждый независимо представляют Cl, Br, I или метил. В определенных предпочтительных вариантах осуществления R₂ = R ₃. Особенно предпочтительно, R₂ = R₃ = Br или Cl.

В соединениях формулы I R₄ предпочтительно представляет Н или метил, при особенно предпочтительном Н.

В определенных соединениях формулы I Y представляет -(CH₂)_n- и n=1 или 2. Альтернативно или в дополнение, А может представлять -NR₅CO-, причем R₅ представляет Н. В особенно предпочтительных соединениях формулы I Y представляет -(CH₂)_n- при n=1, А представляет NHCO или CONH и R₆ представляет COOH или соответствующую солевую, сложноэфирную или пролекарственную форму COOH.

Соединение (i) в выбранных вариантах осуществления настоящего изобретения может иметь формулу, выбранную из следующих:

или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир.

Как было бы понятно специалисту в данной области, описанная выше реакция нитрования привела бы к введению нитрогруппы в самое нижнее положение левого бензольного кольца, как представлено в приведенных выше структурах, или в орто- положении относительно ОН. Соответственно, хотя в большинстве случаев замещенной группой был бы Н, предусмотрены также альтернативные группы, способные быть замещенными посредством реакции нитрования на основе нитрита, например группа йод-, находящаяся в орто-положении относительно фенольной гидроксильной группы. Заявители показали, что это легко достижимая реакция, хотя она протекает медленнее, чем замещение водорода.

Когда соединение формулы I присутствует в форме сложного эфира, то предпочтителен его сложный алкиловый эфир. Когда соединение формулы I присутствует в форме фармацевтически приемлемой соли, то, когда соединение имеет, по меньшей мере, один основный центр, такие соли могут включать кислотно-аддитивные соли, например, с сильными неорганическими кислотами, такими как минеральные кислоты, например серная кислота, фосфорная кислота и/или хлористоводородная кислота, с сильными органическими карбоновыми кислотами, такими как алканкарбоновыми кислотами из 1-4 атомов углерода, которые являются незамещенными или замещенными, например, галогеном, например уксусная кислота, такими как насыщенные или ненасыщенные дикарбоновые кислоты, например щавелевая, малоновая, янтарная, фумаровая, фталевая или терфталиевая кислота, такими как гидроксикарбоновые кислоты, например аскорбиновая, гликолевая, молочная, яблочная, винная или лимонная кислота, такими как аминокислоты (например, аспарагиновая или глутаминовая кислота или лизин или аргинин), или бензойной кислотой, или с сульфоноорганическими кислотами, такими как (С₁-С₄)алкил, или арилсульфоновыми кислотами, которые являются незамещенными или замещенными, например, галогеном, например метансульфоновая кислота или п-толуолсульфоновая кислота.

Могут также образовываться соответствующие кислотно-аддитивные соли, имеющие, при желании, дополнительно присутствующий основный центр.

Когда соединение формулы I имеет, по меньшей мере, одну кислотную группу (например, СООН), оно может также образовывать соли с основаниями. Подходящие соли с основаниями представляют собой, например, соли металлов, такие как соли щелочных металлов или щелочноземельных металлов, например соли натрия, калия или магния, или соли с аммиаком или органическим амином, таким как морфолин, тиоморфолин, пиперидин, пирролидин, моно-, ди- или три-низший алкиламин, например этил, трет-бутил, диэтил, диизопропил, триэтил, трибутил или диметилпропиламин, или моно-, ди- или тригидрокси низший алкиламин, например моно-, ди- или триэтаноламин. Кроме того, могут образовываться соответствующие внутренние соли.

Предпочтительные соли соединений формулы I, которые включают основную группу, включают моногидрохлорид, гидросульфат, метансульфонат, фосфат или нитрат. Предпочтительные соли соединений формулы I, которые включают кислотную группу, включают соли натрия, калия и магния и фармацевтически приемлемые органические амины.

Конечно, соединения (i) могут быть при желании сольватированы, например, в настоящем изобретении могут использоваться гидраты.

В определенных вариантах осуществления первого аспекта изобретения композиция также включает антиоксидант. Такие варианты осуществления основаны на неожиданной находке заявителей в результате указанных выше исследований, что нитропродукт реакции соединения 1А образуется после перорального введения посредством реакции на основе нитрита, которая опосредована свободными радикалами. Заявители также определили, что не биариловое простое эфирное соединение GC-1, также описанное выше, легко становится нитрованным в физиологически релевантных условиях. Включение антиоксиданта в композицию по первому аспекту изобретения ингибирует образование свободных радикалов и/или «тушит» образующиеся свободные радикалы, вследствие чего ослабляется любая реакция нитрования, которая происходит, несмотря на энтеросолюбильное покрытие.

Антиоксидант является предпочтительно растворимым в воде. Такие антиоксиданты включают аскорбиновую кислоту, фумаровую кислоту, яблочную кислоту, пропионовую кислоту или соль любой из указанных кислот, монотиоглицерин, метабисульфит калия, бисульфит натрия, сульфит натрия и метабисульфит натрия. Предпочтительным антиоксидантом является аскорбиновая кислота или ее натриевая соль, которая, как было обнаружено, оказывает особенно значительные ингибирующие эффекты на реакцию нитрования.

Альтернативно, антиоксидант может быть нерастворим в воде. Такой антиоксидант можно выбрать из -токоферола, аскорбилпальмитата, бутилированного гидроксианизола, бутилированного гидрокситолуола, этилолеата и пропилгаллата.

Хотя это и несущественно, может быть предпочтительно, чтобы соединение (i) и антиоксидант (ii) были по существу однородно смешаны. Это помогает обеспечению того, что после любого контакта соединения (i) с нитритом (и/или азотистой кислотой, и/или любым содержащим азот и кислород видом свободных радикалов) более вероятно, что антиоксидант будет находиться вблизи такого контакта и, следовательно, сможет лучше ослабить любую реакцию нитрования, которая может произойти.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, подходящая для перорального введения и включающая:

(i) соединение формулы I, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сложный эфир, как описано выше;

(ii) по меньшей мере, один антиоксидант; и

(iii) по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый эксципиент.

В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения композиция представляет собой твердую композицию. Предпочтительные признаки соединения формулы I, описанные в отношении первого аспекта изобретения, также применимы в отношении второго аспекта (и, в случае целесообразности, тех других аспектов, которые описаны ниже).

Композиция по второму аспекту изобретения предпочтительно также включает энтеросолюбильное покрытие. Энтеросолюбильное покрытие может быть таким, как описано в связи с первым аспектом изобретения.

В третьем аспекте настоящее изобретение кроме того, предоставляет способ стабилизации фармацевтической композиции, подходящей для перорального введения, причем фармацевтическая композиция включает:

(i) соединение формулы I, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сложный эфир, как описано выше;

(ii) по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый эксципиент;

причем способ включает обеспечение композиции энтеросолюбильным покрытием.

В еще одном аспекте изобретение предоставляет в фармацевтической композиции, подходящей для перорального введения, содержащей соединение формулы I, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сложный эфир, как описано выше, применение энтеросолюбильного покрытия или антиоксиданта и/или энтеросолюбильного покрытия, и антиоксиданта для снижения или предотвращения нитрования указанного соединения.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию в соответствии с изобретением для применения при лечении.

Настоящее изобретение также предоставляет применение композиции в соответствии с изобретением при изготовлении лекарственного средства для предотвращения, ингибирования или лечения заболевания, связанного с нарушением метаболизма, или которое зависит от экспрессии гена, регулируемого трийодтиронином (T₃). Заболевание можно выбрать из ожирения, гиперхолестеринемии, дислипидемии, атеросклероза, сердечных аритмий, депрессии, остеопороза, гипотиреоза, подагру, рака щитовидной железы, а также глаукомы и застойной сердечной недостаточности.

Аналогичным образом, настоящее изобретение также предоставляет способ профилактики, ингибирования или лечения заболевания, связанного с нарушением метаболизма, или которое зависит от экспрессии гена, регулируемого трийодтиронином (T₃), причем способ включает введение композиции в соответствии с изобретением субъекту, нуждающемуся в такой профилактике, ингибировании или лечении.

В применении и способе, описанных выше, лекарственное средство или композицию можно ввести с интервалами между введениями от 30 минут до одного месяца. Предпочтительнее, интервал между введениями составляет от одного до семи дней, еще предпочтительнее, от одного до трех дней. Обычный диапазон доз для соединений (i), вводимых взрослому человеку, должен был бы составлять от примерно 1 мкг до примерно 2000 мкг в день. Для многих соединений (i) суточная доза составляла бы менее чем 300 мкг. Предпочтительно, доза соединения (i) составляет от примерно 1 мкг до примерно 200 мкг в день, предпочтительнее, от примерно 1 до примерно 100 мкг в день. Например, соединение (i) можно вводить одной дозой, двумя дозами, тремя дозами или четырьмя дозами в день. Предпочтительно, количество соединения (i) на единицу дозы композиции составляет от 1 до 200 мкг, предпочтительнее, от 1 до 100 мкг, предпочтительнее, 1, 5, 10, 20, 25 или 50 мкг. Например, количество соединения (i) на единицу дозы композиции может составлять от 10 до 100, например от 20 до 80, обычно от 25 до 50 мкг.

Композиция в соответствии с первым или вторым аспектом изобретения может также включать еще один фармакологически активный ингредиент, выбранный из гиполипидемических средств, противодиабетических средств, антидепрессантов, ингибиторов резорбции костной ткани, средств, подавляющих аппетит и/или средств против ожирения.

Дополнительные фармакологически активные ингредиенты имеют тенденцию оказывать аддитивные или синергические эффекты с соединениями (i) с тем, чтобы усилить их метаболические эффекты.

В описанных выше композициях, содержащих антиоксидант, количество антиоксиданта может варьироваться в очень широком диапазоне. Предпочтительно, присутствует, по меньшей мере, 0,0001 ммоль антиоксиданта, например, 0,0005 ммоль. Предпочтительнее, по меньшей мере, 0,01 ммоль. Количество антиоксиданта может, например, составлять от 0,0001 до 15 ммоль, например от 0,0005 до 10 ммоль, обычно от 0,01 до 4 ммоль на дозу композиции.

Как будет детальнее описано ниже, средний человек проглатывает примерно 0,1 ммоль слюнного нитрита в час. Присутствие указанных выше количеств антиоксиданта в композиции должно обеспечить полезный стабилизирующий эффект для соединения (i), даже если композиция по изобретению находится в желудке в течение относительно продолжительного периода.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение предоставляет комбинированное лекарственное средство, подходящее для перорального введения, включающее:

(1) первую фармацевтическую композицию, включающую соединение формулы I, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сложный эфир, как описано выше; и

(2) вторую фармацевтическую композицию, включающую, по меньшей мере, один антиоксидант,

где каждая из первой и второй фармацевтических композиций содержит, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый эксципиент и где первую и вторую фармацевтические композиции можно вводить одновременно, последовательно или отдельно.

Комбинированное лекарственное средство по настоящему изобретению использует преимущество того обстоятельства, что для осуществления стабилизации соединения (i) антиоксидант должен только присутствовать, когда образец вступает в контакт с кислотой и источником нитрита. При условии, что две композиции комбинированного лекарственного средства вводятся через такой короткий интервал времени, что периоды их нахождения в желудке перекрываются, соединение (i) должно обладать, по меньшей мере, некоторой степенью стабилизации против реакции нитрования. Эти композиции или, по меньшей мере, первая композиция представляют собой предпочтительно твердые композиции.

Далее изобретение будет подробно описано только за счет примеров и со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых:

на Фиг.1 показана серия стандартных следов ВЭЖХ соединения 1А в присутствии различных концентраций его продукта 5'-нитрореакции и

Фиг.2 иллюстрирует способ изготовления таблеток с энтеросолюбильным покрытием, содержащих соединение 1А.

Как указано выше, во время разработки соединения 1А было определено, что образование продукта 5'-нитрореакции происходило по абиотическому (т.е. не ферментному) пути. Было определено, что токсикологические свойства продукта нитрореакции были изменены в релевантной степени, по сравнению с материнским соединением. Поэтому было важно определить, как происходила реакция нитрования, и разработать подходы для борьбы или предотвращения этого in vivo.

Пример 1 - Генотоксичность продукта реакции соединения 1А

1.1. Введение

Во время разработки препаративной формы соединения 1А в виде капсул по 25 мкг в нескольких партиях наблюдалась ранее не выявленная примесь; примесь составляла в диапазоне от 0,8 до 1,2% материнского соединения. Эта примесь была идентифицирована в виде нитроаналога, далее именуемого как продукт реакции 1В.

Поэтому была идентифицирована теоретическая возможность образования in vivo этой примеси/продукта реакции. Следовательно, этот предполагаемый продукт реакции тестировали на генотоксическую активность в стандартном наборе исследований Международной конференции по гармонизации (ICH).

Этот пример резюмирует исследования генотоксичности, проведенные с продуктом реакции 1В, и относится к данным по клиническим воздействиям этой примеси/продукта реакции.

1.2. Генотоксичность

1.2.1. Продукт реакции 1В

1.2.1.1. Исследовательский анализ Ames

Продукт реакции 1В испытывали в двойных культурах в присутствии и отсутствие метаболической активации S-9. Изделия положительного контроля испытывали в двойных культурах и получали в DMSO (диметилсульфоксиде), за исключением азида натрия, который растворяли в воде. Отрицательные контроли (с носителем) испытывали в повторениях пяти культур.

Продукт реакции 1В проявил цитотоксичность в отношении к каждому из испытанных штаммов S.typhimurium и Е.coli. Цитотоксичность в диапазоне от минимальной до выраженной была очевидна на основании уменьшения среднего количества ревертантов и/или снижения плотности бактериальной фоновой популяции. По сравнению с отрицательными контролями, количества гистидин⁺ ревертантов были повышены в обработанных продуктом реакции 1В культурах штамма ТА100 соответственно в присутствии и отсутствие активации S-9. Как ожидалось, наблюдалось значимое увеличение количества гистидин ⁺ и триптофан⁺ ревертантов в культурах, обработанных соединениями положительного контроля.

В заключение, продукт реакции IB проявил положительную реакцию в данном исследовании.

1.2.1.2. Цитогенетическое исследование на первичных лимфоцитах человека

Цитогенетическое исследование in vitro выполняли для изучения способности продукта реакции IB вызывать хромосомные аберрации в культивированных лимфоцитах человека. На основании результатов поиска диапазона цитотоксическости концентрации от 5 до 30 мкг/мл были выбраны для оценки при 24-часовом воздействии без активации метаболических ферментов и концентрации от 2,5 до 20 мкг/мл были выбраны для 5-часового воздействия при вызванной Aroclor-1254 метаболической активации печени крыс (фракции S9).

При 5-часовом воздействии продукта реакции IB в присутствии метаболической активации S-9 происходило статистически значимое увеличение частоты хромосомных аберраций. При самой высокой концентрации, 20 мкг/мл, частота хромосомных аберраций составила 10,5%, по сравнению с 2,5% для контроля носителя, а снижение митотического показателя составило приблизительно 51%.

При 24-часовом воздействии продукта реакции IB в отсутствие метаболической активации S-9 происходило статистически значимое увеличение частоты хромосомных аберраций. При самой высокой концентрации, 40 мкг/мл, частота хромосомных аберраций составила 7,5%, по сравнению с 2,5% для контроля носителя, а снижение митотического показателя составило приблизительно 48%.

Как ожидалось, положительный контроль в каждом испытании вызывал статистически значимые увеличения частот поврежденных метафаз. Таким образом, была продемонстрирована достоверность этого анализа.

В заключение, продукт реакции IB был кластогенным для делящихся лимфоцитов человека при тестировании в максимальных концентрациях, рекомендуемых международными инструкциями для цитогенетических исследований in vitro.

1.2.1.3. Исследование микроядер у мышей после перорального введения продукта реакции IB

Продукт реакции IB оценивали в анализе микроядер костного мозга мышей для определения его генотоксического потенциала in vivo . Группам мышей перорально вводили последовательные дозы 1000, 1500 или 2000 мг/кг продукта реакции IB (т.е. до максимального уровня дозы, требуемого международными предписывающими инструкциями уполномоченных организаций ICH и OECD). Образцы костного мозга бедренной кости брали у вех животных приблизительно через 24 часа после введения последней дозы для оценки имеющих микроядра полихроматических эритроцитов (MN-PCE).

Ни одно животное не погибло во время исследования, и не наблюдались связанные с препаратом клинические признаки. Не наблюдалась токсичность в отношении костного мозга, по данным измерения значимого уменьшения полихроматических эритроцитов (PCE). Частоты MN-PCE были статистически увеличены при 1000 и 1500 мг/кг.

В заключение, у мышей были обнаружены независимые от дозы положительные реакции.

1.3. Клиническое воздействие продукта реакции IB

После перорального введения одиночных доз соединения 1А людям-добровольцам продукт реакции IB можно было выявить в плазме. Аналогичным образом, в испытании, в котором субъекты получали ежедневные дозы соединения 1А в течение двух недель, продукт реакции IB можно было выявить у нескольких субъектов.

В заключение, после введения соединения 1А людям в плазме можно было выявить потенциально мутагенный нитропродукт реакции 1В. Это происходит даже в случае, если введение проводится в течение относительно короткого периода (например, 14 дней, как указано выше). Потенциальные генотоксины обычно не зависят от дозы по их мутагенным эффектам, и, следовательно, присутствие даже низких уровней продукта реакции IB имеет клиническое значение. Кроме того, соединения формулы I обычно следует вводить в течение длительного периода времени, и, следовательно, предотвращение образования нитропродуктов реакции имеет первостепенное значение, если следует избегать потенциальных генотоксических эффектов, возникающих в результате накопления продуктов реакции.

1.4. Резюме и заключение

Было обнаружено, что примесь/продукт реакции соединения 1А, продукт реакции 1В, вызывает хромосомные аберрации в периферических лимфоцитах человека in vitro и не зависимые от дозы микроядра в исследовании микроядер у мышей in vivo.

Кроме того, продукт реакции 1В можно было выявить в плазме человека после кратковременного введения соединения 1А. Соответственно, ясно, что предотвращение образования нитропродукта реакции дало бы существенную выгоду и потому, что потенциальные генотоксины могут оказывать генотоксические эффекты в очень низких концентрациях, и потому, что соединения формулы I, такие как соединение 1А, в целом следует вводить хронически.

Пример 2. - Нитрат и нитрит - источники и механизмы нитрования

2.1 Введение

Возможным источником нитрования является не классический нитритный путь. Об этом пути впервые сообщили Uemura et al. (1978, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 9, 1076). Нитритный путь может протекать при умеренно низком рН (примерно 2) и, в отличие от нитратного пути, устойчив к воде. Нитритный путь ведет к получению вида свободного радикала, способного взаимодействовать с соединениями, содержащими гидроксилированный бензол (Beake et al. (1992) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 , 10, 1653).

Заявители считали, что этот путь был, вероятно, главным путем для нитрования перорально вводимых соединений формулы I в желудке и кишечнике.

Была произведена оценка среднего суточного потребления нитратов и нитритов из источников, отличных от пищевых добавок (T. Hambridge, WHO Food Additives Series: 50, Nitrate and Nitrite).

Что касается эндогенных источников нитрита, то известно, что нитрат продуцируется из нитрата в слюне под действием нитрат-редуктазы ротовой полости (Benjamin (2000) Ann. Zootech. 49, 207). Это приводит к концентрации нитрита в слюне примерно 200 мкМ. Средний человек проглатывает примерно 500 мл слюны в час. Это приводит к попаданию внутрь примерно 2,4 ммоль (110 мг) нитрита в день. Это составляет примерно 1,6 мг/кг/день нитрита (для среднего взрослого человека с массой тела 70 кг).

2.2. Исследование нитрования in vivo

В экспериментах, проведенных in vivo на крысах, было обнаружено, что после введения соединения 1А вместе с раствором нитрата и нитрита (соответственно 54 мг и 4 мг на крысу) примерно 6% введенной дозы соединения 1А было подвергнуто нитрованию.

2.3. Антиоксиданты

Как изложено выше, было высказано предположение, что механизм нитрования соединения 1А (а следовательно, других содержащих бензол соединений, таких как соединения формулы I) был через нитрит и, следовательно, опосредован свободными радикалами. Соответственно, считалось, что реакцию нитрования можно было ингибировать «тушителями» свободных радикалов/антиоксидантами.

В целом, в соответствии с настоящим изобретением можно использовать любой антиоксидант. «Истинными» антиоксидантами являются те, которые блокируют опосредованные радикалами цепные реакции взаимодействием со свободными радикалами (путем отдачи одиночного электрона радикальному виду). Примером такого истинного антиоксиданта является бутилированный гидрокситолуол (ВНТ). Другие примеры такого вида включают фенольные антиоксиданты, такие как феруловая кислота, рутин, катехин, эпикатехин, эпигаллокатехин, арикатехингаллат и эпигаллокатехингаллат. Многие такие виды являются естественно встречающимися, например антиоксиданты типа флавоноидов или транс-стилбенов. Восстанавливающие агенты представляют собой виды, имеющие более низкий окислительно-восстановительный потенциал, чем соединения, которые используются ими для защиты, и/или они могут действовать в качестве приманок. Примером агента, действующего таким образом, является аскорбиновая кислота. Кроме того, определенные агенты представляют собой «синергисты антиоксидантов». Эти агенты усиливают эффекты антиоксидантов и могут быть также включены в композиции по настоящему изобретению; примером является эдетат натрия.

Антиоксиданты можно также группировать в соответствии с их характеристиками растворимости. Растворимые в воде антиоксиданты включают аскорбиновую кислоту (или ее натриевую соль), фумаровую кислоту, яблочную кислоту, монотиоглицерин, метабисульфит калия (KO₃S-SO₂K), пропионовую кислоту (CH₃CH₂CO₂H), бисульфит натрия (NaHSO₃) и сульфит натрия (Na₂SO ₃). Нерастворимые в воде антиоксиданты включают альфа токоферол, аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), этилолеат и пропилгаллат.

2.4. Реакция нитрования и ее ингибирование

Известно, что L-тирозин может быть превращен в нитропродукт реакции, в котором группа NO₂ замещена в орто-положении относительно кольцевой гидроксильной группы. Экспериментальную процедуру для определения степени нитрования L-тирозина использовали для определения нитрования соединения 1А и его ингибирования отобранными антиоксидантами. Экспериментальная процедура для L-тирозина известна (1998, Chem. Res. Toxicol., II, 1578). Вкратце, растворы соединения 1А (50 мкМ) подвергали воздействию растворов NaNO₃ (2500 мкМ) и/или NaNO₂ (различные концентрации) при различных величинах рН, при 37°С и в присутствии или в отсутствие фосфатного буфера. Реакция нитрования ведет к образованию продукта 5'-нитрореакции соединения 1А. Этот продукт реакции можно выявить и количественно определить с использованием ВЭЖХ, причем продукт реакции имеет уменьшенное время удерживания (в используемых условиях), по сравнению с материнским соединением. Затем к тестируемым растворам, содержащим NaNO ₂ и 1A, добавляли ингибиторы антиоксиданта и тесты нитрования повторяли.

На фиг.1 показана серия ВЭЖХ хроматограмм 1А (50 мкМ) в присутствии от 50 нМ до 50 мкМ продукта реакции IB. Анализ проводили ВЭЖХ-МС/МС при следующих условиях:

Условия ВЭЖХ

Прибор: Waters Alliance 2795 LC

Предохранительная колонка: колонка Waters Sentry Guard Column, Symmetry С₁₈ 3,5 мкм, 2,1 × 10 мм.

Колонка: Waters Symmetry С₁₈ 3,5 мкм, 2,1 × 50 мм.

Температура колонки: 45°С

Объем инжекции: 5 мкл

Температура автосемплера: 10°С

Скорость потока: 0,2 мл/мин

Подвижная фаза:	А = 10 мМ ацетата аммония (рН=4,5 с уксусной кислотой),
	В = Ацетонитрил

Градиент:

Время (мин)	% А	% В	Скорость потока (мл/мин)	Кривая
0,00	90	10	0,2	линейная
1,00	0	100	0,2	линейная
2,00	0	100	0,2	линейная
2,10	90	10	0,2	линейная
4,00	90	10	0,2	линейная

Условия масс-спектрометрии:

Прибор: Micromass Quattro micro API

Режим: ESI -

Эксперимент: MRM (множественный мониторинг реакции)

Переходы MRM для соединения 1А: m/z 486,0>399,9 (t_R =3,47 мин)

Переходы MRM для продукта реакции 1В: m/z 531,0>444,9 (t_R=3,91 мин)

Предел количественного определения (LOQ):

LOQ для соединения 1А при MRM составляет 10 нМ в 50% ацетонитриле : 50% воды.

LOQ для продукта реакции 1В при MRM составляет 1 нМ в 50% ацетонитриле : 50% воды.

Ясно видно, что продукт реакции имеет уменьшенное время удерживания в использованных условиях, причем материнское соединение 1А элюируется примерно через 3,5 минуты, а продукт реакции элюируется примерно через 4 минуты.

После инкубации 1А с различными концентрациями NaNO₂ и/или NaNO₃ были получены результаты, представленные в таблице 1.

Таблица 1 Нитрование соединения 1А в присутствии нитрита и/или нитрата и в различных условиях рН
1A (мкМ)	NaNO 3 (мкМ)	NaNO 2 (мкМ)	Ингибирующий агент	pH	Время (ч)	Нитрование (%)
50				2 (HCl)	24	0
50				2 (фосфат)	24	0
50				6,4	24	0
50				7,2	24	0
50	2500	100		2 (HCl)	4	8,4
50	2500	100		2 (фосфат)	4	9,63
50	2500	100		6,4	4	0,017
50	2500	100		7,2	4	0
50	2500			2 (HCl)	4	0
50	2500			2 (фосфат)	4	0
50	2500			6,4	4	0
50	2500			7,2	4	0
50		100		2 (HCl)	4	98,6
50		100		2 (фосфат)	4	4,27
50		100		6,4	4	0,013
50		100		7,2	4	0

На основании этих данных можно сделать несколько выводов. Во-первых, ясно продемонстрировано, что одного нитрита в соответствующих условиях кислотности достаточно для вызова значительного нитрования соединения 1А. Как показано отрицательным контролем (ряды 1-4), результат нитрования не наблюдается, когда нитрит и нитрат отсутствуют. Во-вторых, присутствие фосфатного буфера может действительно привести к значительному ингибированию реакции на основе нитрита, причем реакция происходит в значительно большей степени в растворе HCl при рН 2, чем в буфере при рН 2. В-третьих, нитрат при рН 2 (HCl или буфер) не способен привести к определяемому нитрованию соединения 1А. В-четвертых, представляется, что нитрат в значительной степени ингибирует реакцию на основе нитрита (более чем на порядок величины; см. цифры, выделенные жирным шрифтом).

Таким образом, эти данные подтверждают, что реакция нитрования, наблюдавшаяся с соединениями, содержащими гидроксилированный бензол, такими как соединения формулы I (например, соединение 1А) при пероральном введении, опосредуется нитритом, а не нитратом. Эти данные также ясно демонстрируют важность кислотной среды для реакции нитрования. Композиции с энтеросолюбильным покрытием по настоящему изобретению снижают или предотвращают доступ кислотной среды к содержащимся в них фармакологически активным ингредиентам. Соответственно, подход с использованием такой препаративной формы способен значительно уменьшить реакцию нитрования, которая бы произошла в противном случае.

После добавления выбранных антиоксидантных агентов, ингибирующих соединение 1А в присутствии нитрита, были получены результаты, представленные в таблице 2. Количество использованного антиоксиданта в целом было примерно в 10-20 раз больше количества соединения 1А.

Таблица 2 Ингибирование нитрования соединения 1А в присутствии нитрита посредством антиоксидантного ингибиторного агента
1A (мкМ)	NaNO2 (мкМ)	Ингибирующий агент	pH	Время (ч)	Нитрование (%)
50	100		2 (HCl)	4	98,6
50	100		6,4	24	0,02
50	400		6,4	24	0,12
50	800		6,4	24	0,21
50	100	BHT	2 (HCl)	24	0,02
50	100	Бисульфит натрия	2 (HCl)	4	0,00
50	100	Бисульфит натрия	2 (фосфат)	4	0,00
50	100	Бисульфит натрия	6,4	4	0,00
50	100	Бисульфит натрия	7,2	4	0,00
50	100	Бисульфит натрия	2 (HCl)	0	0,77
50	100	Бисульфит натрия	2 (фосфат)	0	0,11
50	100	Бисульфит натрия	2 (HCl)	2	0,11
50	100	Бисульфит натрия	2 (фосфат)	2	0,16
50	100	Бисульфит натрия	6,4 (NaAc)	2	0
50	100	Бисульфит натрия	6,4 (фосфат)	2	0
50	100	Бисульфит натрия	2 (HCl)	2	0,11
50	100	Бисульфит натрия	2 (фосфат)	4	0,17
50	100	Бисульфит натрия	6,4 (NaAc)	4	0
50	100	Бисульфит натрия	6,4 (фосфат)	4	0
50	100	Катехин	2 (HCl)	4	0,01
50	100	Катехин	2 (фосфат)	4	0,01
50	100	Катехин	6,4 (NaAc)	4	0
50	100	Катехин	6,4 (фосфат)	4	0
50	100	Катехин	2 (HCl)	24	0,02
50	100	Катехин	2 (фосфат)	24	0
50	100	Катехин	6,4 (NaAc)	24	0
50	100	Катехин	6,4 (фосфат)	24	0

Данные, представленные в таблице 2, позволяют сделать ряд существенных выводов. Ясно, что пока нитрит не подкислен, нитрование соединения 1А не происходит или происходит незначительно, даже когда концентрация нитрита увеличивается до восьми раз. Важнее то, что видно, что в условиях рН и концентрации нитрита, которые, как обнаружено, ведут к почти полному превращению тестируемого соединения в его нитропродукт реакции, присутствие ВНТ (нерастворимого в воде) или аскорбата (растворимого в воде) ведет по существу к полному ингибированию опосредованного нитритом нитрования (см. цифры, выделенные жирным шрифтом).

В целом, представленные в настоящем документе данные ясно иллюстрируют, что нитрит (NO₂), а не нитрат (NO₃) является вероятным источником нитрования in vivo, наблюдаемого у гидроксилированных содержащих бензол соединений, таких как соединения формулы I (например, соединение 1А). Это опосредованное нитритом нитрование происходит посредством механизма свободных радикалов и происходит в релевантной степени только в подкисленной среде. Включение антиоксиданта в композицию, содержащую гидроксилированное содержащее бензол соединение, в значительной степени ингибирует эту реакцию нитрования. В дополнение или альтернативно, защита композиции посредством энтеросолюбильного покрытия предотвратит вступление подкисленного нитрита в контакт с гидроксилированным содержащим бензол соединением и, таким образом, предоставляет мощную стратегию для стабилизации соединения против нитрования.

Пример 3 - Покрытая энтеросолюбильным покрытием препаративная форма соединения 1А

3.1. Измерения размера частиц соединения 1А до и после измельчения

Поскольку неизмельченное соединение 1А содержало большую пропорцию частиц, больше чем приблизительно 100 мкм, что воздействует на однородность содержимого таблетки, то соединение 1А измельчали. Для измельчения 2 × 2 г соединения 1А использовали устройство Retsch MM 2000. Сферическая частица диаметром 100 мкм с плотностью 1,5 г/см³ имеет массу приблизительно 1 мкг.

Распределение размера частиц измеряли прибором Malvern MasterSize 2000, т.е. методикой лазерной дифракции. Образец порошка диспергировали в Tween 20 и воде.

Неизмельченное соединение 1А: Измерения выявили медианные диаметры, d(0,5), 101 и 103 мкм. 90% квартили, d(0,9) были 158 и 159 мкм.

Измельченное соединение 1А: После измельчения d(0,5) составил 20 мкм, а d(0,9) составила 85 мкм. Это было приемлемым распределением размера частиц.

3.2. Состав таблетки

Изготовленный лекарственный продукт представлял собой белую, круглую (диаметром 7 мм), выпуклую таблетку с энтеросолюбильным покрытием, имеющую два содержания активного вещества, 50 и 300 мкг соединения 1А (далее «1А») на таблетку. Полная композиция лекарственного продукта представлена ниже в таблице 3.1.

Таблица 3.1 Композиция таблеток 1А с энтеросолюбильным покрытием
Ингредиент	Количество, мг/единицу	Количество, мг/единицу	Стандарт
1A	0,050	0,300
Маннит	54,6	54,6	Европейская Фармакопея
Микрокристаллическая целлюлоза (МСС)	83,65	83,4	Европейская Фармакопея
Гипромеллоза	0,3	0,3	Европейская Фармакопея
Стеарат магния	1,4	1,4	Европейская Фармакопея
Очищенная вода*	15	15	Европейская Фармакопея
Дисперсия 30% сополимера метакриловой кислоты-этилакрилата (1:1)	25,0 (7,5**)	25,0 (7,5**)	Европейская Фармакопея
Тальк	3,75	3,75	Европейская Фармакопея
Триэтилцитрат	0,75	0,75	Европейская Фармакопея
Очищенная вода*	50,5	50,5	Европейская Фармакопея
*Испаряется во время процесса изготовления **В скобках - количество сухого сополимера Целевая масса ядер таблеток составляла 140 мг, а целевая масса пленки была 12 мг.

Серийный состав

Серийный состав (см. таблицу 3.2) для 50 мкг/таблетку и 300 мкг/таблетку относится к 6000 pcs (840 г) ядер таблеток во время получения таблеток и 5700 pcs (798 г) ядер таблеток во время покрытия.

Таблица 3.2 Серийный состав таблеток 1А с энтеросолюбильным покрытием
Ингредиент	Количество на серию (50 мкг/таблетку), г	Количество на серию (300 мкг/таблетку), г	Стандарт
1A	0,318*	1,908*
Маннит	327,6	327,6	Европейская Фармакопея
Микрокристаллическая целлюлоза	501,9	500,4	Европейская Фармакопея
Гипромеллоза	1,8	1,8	Европейская Фармакопея
Стеарат магния	8,4	8,4	Европейская Фармакопея
Очищенная вода**	90	90	Европейская Фармакопея
Дисперсия 30% сополимера метакриловой кислоты-этилакрилата (1:1)	158,2 (47,4***)	158,2 (47,4***)	Европейская Фармакопея
Тальк	23,7	23,7	Европейская Фармакопея
Триэтилцитрат	4,7	4,7	Европейская Фармакопея
Очищенная вода**	320	320	Европейская Фармакопея
*Включает 6% избыток вследствие потерь во время получения ядер таблеток **Испаряется во время процесса изготовления ***В скобках - количество сухого сополимера Количество суспензии покрытия (последние четыре ряда таблицы) включает 11% избыток вследствие потерь во время процесса покрытия.

3.3. Изготовление

Блок-диаграмма способа изготовления таблеток 1А с энтеросолюбильным покрытием представлена на фиг.2. Были изготовлены ядра таблеток с 50 мкг и 300 мкг 1А. Ядра таблеток представляют собой смесь «основного гранулированного материала» (содержащего 1А), маннита, гипромеллозы и стеарата магния. «Основной гранулированный материал» изготавливается суспендированием измельченного 1А в водном растворе гипромеллозы и распылением дисперсии на МСС. 6% Избыток 1А используется ввиду потерь. После испарения воды высушенный продукт просеивается. Порошковую смесь прессуют в круглые, выпуклые таблетки с подходящим сопротивлением раздавливанию и временем разрушения. Масса таблетки составляет 140 мг и диаметр 7 мм.

Ядра таблеток покрывают для получения устойчивости к среде желудка. Полимер представляет собой водную дисперсию сополимера метакриловой кислоты-этилацетата (Eudragit L30 D-55). Тальк добавляют в качестве глянцевателя к полимерной дисперсии, и триэтилцитрат функционирует в качестве пластификатора.

Функция каждого из эксципиентов представлена ниже в таблице.

Таблица 3.3 Функция эксципиентов
Ингредиент	Функция
Маннит	Наполнитель
Микрокристаллическая целлюлоза	Наполнитель, носитель для API, разрыхлитель
Гипромеллоза	Связывающий агент
Стеарат магния	Смазывающее вещество
Очищенная вода*	Растворитель
30% дисперсия сополимера метакриловой кислоты-этилацетата (1:1)	Полимер энтеросолюбильного покрытия
Тальк	Глянцеватель
Триэтилцитрат	Пластификатор
*Испаряется во время процесса изготовления

3.4. Анализ композиции с кишечнорастворимым покрытием

Ниже представлен пригодный подход для оценки содержания примесей и т.д. в таблетках с энтеросолюбильным покрытием. Соединение 1А экстрагируется из таблеток перемешиванием в растворителе образца. После центрифугирования для удаления нерастворимых частиц количество 1А, отдельных родственных веществ и общее количество родственных веществ в надосадочной жидкости можно определить с использованием инструментальных условий, описанных в таблице 3.4. Количество 1А и его родственных веществ определяется посредством хроматографии в обращенной фазе и УФ выявления.

Таблица 3.4 Параметры метода ВЭЖХ и растворы для таблеток 1А
Параметры способа и растворы
Прибор	Разделительный модуль Waters Alliance с УФ детектором Waters 2487 или эквивалентное оборудование ВЭЖХ с бинарным насосом и УФ детектором
Колонка	Waters Atlantis dC18, 150 × 2,1 мм, 3 мкм
Подвижная фаза А	0,05% трифторуксусная кислота в воде
Подвижная фаза В	0,05% трифторуксусная кислота в ацетонитриле
Растворитель образца	Подвижная фаза А/Подвижная фаза В (50/50)
Объем инжекции	50 мкл (таблетки 1А 50 мкг), 20 мкл (таблетки 1А 300 мкг)
Температура колонки	25°С
Скорость потока	0,3 мл/мин
Длина волн выявления	250 нм
Время цикла	60 минут
Программа градиента	Время (мин)	%А	%В
0	80	20
1	80	20
51	10	90
52	80	20
60	80	20
Типичное время удерживания (в указанных условиях ВЭЖХ)	Соединение	Время удерживания (мин)	Относительное время удерживания (RRT)
1А	26,4	1,00
Продукт реакции 1В	34,0	1,29

Тест растворения можно выполнить следующим образом. Тест растворения делится на две стадии: на первой стадии тестируется устойчивость энтеросолюбильного покрытия, а на второй стадии тестируется скорость растворения. Устойчивость покрытия тестируется в 0,1 М хлористоводородной кислоте в течение 3 часов. Растворение тестируется в 50 мМ буфера фосфата натрия при рН 6,8 в течение 1 часа. Взятые образцы центрифугируют для удаления нерастворимых частиц перед анализом.

Количество 1А, высвобождаемое из композиции, можно определить посредством хроматографии в обращенной фазе и УФ выявления в соответствии с таблицей 3.5.

Таблица 3.5 Параметры метода ВЭЖХ и растворы для теста растворения таблеток 1А
Параметры способа и растворы
Ванна для растворения	Prolabo Dissolutest
Прибор для растворения	Модифицированный прибор 1 (корзинка) в соответствии с Фармакопеей США. Сосуды емкостью 100 мл
Установки ванны для растворения	Скорость перемешивания	100 ± 2 об/мин
Температура ванны	37,0 ± 0,5°С
Расстояние от корзины до дна сосуда	10 ± 1 мм
Прибор	Разделительный модуль Waters Alliance с УФ детектором Waters 2487 или эквивалентное оборудование ВЭЖХ с бинарным насосом и УФ детектором
Колонка	Waters Atlantis dC18, 150 × 2,1 мм, 3 мкм
Подвижная фаза А	0,05% трифторуксусная кислота в воде
Подвижная фаза В	0,05% трифторуксусная кислота в ацетонитриле
Среда растворения	Кислотная стадия	0,1 М HCl
Буферная стадия	50 мМ буфера фосфата натрия рН 6,8
Объем инжекции	Кислотная стадия	100 мкл
Буферная стадия	100 мкл (таблетки 1А 50 мкг), 15 мкл (таблетки 1А 300 мкг)
Температура колонки	25°С
Скорость потока	0,3 мл/мин
Длина волн выявления	250 нм
Время цикла	60 минут
Программа градиента	Время (мин)	%А	%В
0	65	35
19	30	70
20	65	35
26	65	35
Типичное время удерживания	Соединение	Время удерживания (мин)
1А	13,2

Было обнаружено, что высвобождение соединения 1А не выявлялось после теста растворения в 0,1 М HCl. Однако, когда тест растворения повторяли в среде с рН 6,8, растворение таблеток и высвобождение соединения 1А было в сущности полным для каждой тестированной таблетки.

Соответственно, при использовании in vivo, такие композиции с энтеросолюбильным покрытием предотвратит доступность активных ингредиентов воздействию кислотной содержащей нитрит среды в желудке и, таким образом, предотвратит или значительно снизит продукцию потенциально генотоксических продуктов реакции таких активных ингредиентов.

Пример 4: Нитрование дополнительных соединений формулы I

Тесты проводили на следующих дополнительных соединениях формулы I для определения их предрасположенности к нитрованию:

Было обнаружено, что во всех случаях подверженность воздействию растворов различных концентраций нитрата и нитрита, как в описанном выше примере 2.4, привела к нитрованию.

Пример 5: Клиническое тестирование

Клинически релевантные дозировки соединения 1А вводили людям в форме раствора в одной дозе. Нитрованный продукт реакции выявляли у значительного числа субъектов. Когда соединение вводили в форме таблеток с энтеросолюбильным покрытием, то наблюдалось резкое снижение содержания нитрованного продукта.

Энтеросолюбильные таблетки с внутренним слоем

В этом примере все количества представлены в мг на единицу дозы. Карбонат кальция (наполнитель, 122,8) и мальтодекстрин (связывающее вещество, 12,15) смешивали в сухих условиях в миксере с высоким сдвигом. Соединение 1А (0,025) растворяли, используя миксер, в вмеси очищенной воды (15) и этанола (10), и затем, перемешивая, добавляли раствор к смеси кальция карбоната и мальтодекстрина. Готовую влажную массу гранулировали, сушили в сушилке с псевдоожиженном слоем и промешивали через сито. Промешенные гранулы смешивали с кроскармелозой натрия (разрыхлитель) (4,2) используя барабанную мешалку двухконусного типа, и готовую смесь смешивали с стеаратом магния (смазывающее вещество, 0,85) в мешалке двухконусного типа. Полученную в результате порошковую смесь формовали в таблетки, используя ротационный таблеточный пресс.

Внутреннее покрытие Opadry AMB® (6,0) наносили на полученные таблеточные ядра, используя дражировочный котел. Дальнейшее, энтеросолюбильное, покрытие наносили, используя 30% дисперсию Эудрагита (Eudragit) L30-D55®, 1:1 сополимера метакриловой кислоты-этил акрилата (25,0), вместе с тальком (глидант, 7,0) и триэтилцитратом (пластификатор, 1,4) в дражировочном котле.

Второй набор таблеток получали таким же образом, за исключением того, что Соединение 1А было в количестве 0,50 мг на дозированную единицу.

Были получены таблетки хорошего качества.