способ прогноза развития нейтропении, вызванной комбинированной противовирусной терапией, у больных хроническим гепатитом с

Формула изобретения

Способ прогноза интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении in vitro у больных хроническим гепатитом С, получающих комбинированную противовирусную терапию (КПТ), путем постановки теста показателя повреждаемости нейтрофилов (ППН), отличающийся тем, что в ходе проведения теста осуществляют инкубацию крови с 0,02 мл индуктора апоптоза нейтрофилов (ИАН), состоящего из 0,2 г Ребетола и 1,7 млн ME Альтевира, разведенных в 1,0 л изотонического раствора, и приготавливают мазки с последующей микроскопией, при этом ППН вычисляют по формуле:

(H₁-Нк)/100,

где H₁ - количество поврежденных нейтрофилов в опыте;

Нк - количество тех же элементов в контроле;

100 - число сосчитанных в каждом мазке нейтрофилов, и при значении ППН 0,26±0,01 и выше прогнозируют высокий риск развития выраженной нейтропении у данной категории пациентов в случае проведения им в дальнейшем КПТ.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно инфекционным болезням, и предназначено для использования в качестве простого и доступного способа прогноза in vitro развития нейтропении у больных хроническим гепатитом С (ХГС), получающих комбинированную противовирусную терапию (КПТ).

ХГС относится к числу наиболее распространенных вирусных заболеваний печени и отличается выраженной склонностью к развитию цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. В настоящее время лишь применение комбинированой терапии препаратами рибавирина и интерферона альфа-2b (ИФН ) может обеспечить предупреждение этих неблагоприятных исходов ХГС. Согласно современным данным сочетание ИФН с рибавирином позволяет добиться стойкого вирусологического ответа.

Существует множество способов прогноза и динамического контроля за эффективностью противовирусной терапии у больных ХГС, отличающихся по своей трудоемкости и материальным затратам: В.А.Исаков. Современная терапия хронического вирусного гепатита С: Какая длительность комбинированной терапии оптимальна и почему? // Клиническая гастроэнтерология и гепатология. - 2009. - Т.2, № 1. - С.9-12.; К.-П.Майер. Гепатит и последствия гепатита: Практ. руководство: пер. с нем. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ГЕОТАР-МЕД, 2004. - С.267.; М.Г.Авдеева с соавт. Вирусные гепатиты: стратегия и тактика терапии, организация медицинской помощи: пособие для врачей. - Краснодар: ООО «Качество», 2009. - 262 с.; Инвитро-диагностика. Лабораторная диагностика (Под редакцией Е.А.Кондрашевой, А.Ю.Островского. - 3-е изд., переработанное и дополненное. - М.: Медиздат, 2009. - 832 с. и др.

К сожалению, все эти способы прогноза эффективности КПТ, выбранные нами в качестве аналогов, не учитывают вероятность развития такого серьезного нежелательного эффекта проводимого лечения, как развитие интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении. Между тем, клинические исследования показали, что у 95% пациентов, проходящих антивирусное лечение, количество нейтрофилов находится ниже нормы, у 20% из них развивается тяжелая нейтропения, требующая коррекции проводимой КПТ:

1) при снижении абсолютного числа нейтрофилов менее 750 кл/мкл рассматривается вопрос о снижении дозы ИФН в 2 раза;

2) у больных с абсолютным числом нейтрофилов менее 500 кл/мкл лечение прерывается до восстановления числа нейтрофилов выше 1000 кл/мкл.

Между тем, очень важно сохранить высокую терапевтическую дозу препаратов в первые 24 недели лечения, поскольку уменьшение доз противовирусного лечения в первые 20 недель приводит к значительному снижению стойкого вирусологического ответа у больных ХГС, что несомненно снижает эффективность КПТ.

Поэтому весьма актуальной проблемой представляется разработка методов прогноза развития интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных хроническим гепатитом C с целью наиболее раннего назначения препаратов, направленных на ее предупреждение.

Ближайшим аналогом к предлагаемому изобретению является способ аллергодиагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом показателем повреждаемости нейтрофилов (ППН). Согласно данному способу осуществляют постановку теста показателя повреждаемости нейтрофилов (ППН). Инкубируют кровь с аллергеном. Готовят мазки, окрашивают их цитохимическим методом на липиды. Вычисляют ППН по формуле. При значении ППН 0,55±0,02 и выше диагностируют ГЛПС (См. Патент России № 2137132, опубл. 10.09.1999, Кл. G01N 33/53).

Данное изобретение выбрано нами в качестве прототипа, как наиболее близкое к заявляемому по методике проведения теста и техническому решению.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа прогноза in vitro развития интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных хроническим гепатитом С, получающих комбинированную противовирусную терапию

Технический результат заключается в том, что заявляемый способ прост и экономичен, обеспечивает быстрое получение результата и не требует для своего проведения специально оборудованной лаборатории, а разработанный нами индуктор апоптоза нейтрофилов благодаря своим свойствам позволяет прогнозировать и предупреждать развитие интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении, повышая тем самым эффективность проводимой КПТ.

Поставленный технический результат достигается тем, что способ прогноза интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении in vitro у больных хроническим гепатитом С, получающих комбинированную противовирусную терапию (КПТ), включает постановку теста показателя повреждаемости нейтрофилов (ППН).

В соответствии с изобретением, в ходе проведения теста осуществляют инкубацию крови с 0,02 мл индуктора апоптоза нейтрофилов (ИАН), состоящего из 0,2 г Ребетола и 1,7 млн ME Альтевира, разведенных в 1,0 л изотонического раствора, и приготавливают мазки с последующей микроскопией, при этом ППН вычисляют по формуле:

(Н₁-Нк)/100,

где H₁ - количество поврежденных нейтрофилов в опыте;

Нк - количество тех же элементов в контроле;

100 - число сосчитанных в каждом мазке нейтрофилов,

и при значении ППН 0,26±0,01 и выше прогнозируют высокий риск развития выраженной нейтропении у данной категории пациентов в случае проведения им в дальнейшем КПТ.

Для решения поставленной задачи проводили определение показателя повреждаемости нейтрофилов (ППН) по методике, описанной Л.Б.Юшкевичем с соавт. Современные методы клинико-лабораторных исследований в диагностике профессиональных заболеваний. - М., 1973. С.53-56.

Тест заключается в оценке амебиодной активности нейтрофилов крови больных, которую рассматривают как начальную фазу апоптоза. При постановке теста учитывается деформация нейтрофильных лейкоцитов в виде изменения зернистости цитоплазмы, образования, повреждения или распада псевдоподий, а также мелкая фрагментация и расплывчатость в ядрах клеток. При правильно проведенном контроле число поврежденных нейтрофилов не превышает 10%. При инкубации крови сенсибилизированных лиц в смеси с водным раствором специфического индуктора реакция нейтрофилов заметно усиливается. ППН рассчитывается как разница между количеством поврежденных клеток в опыте и контроле, деленных на количество сосчитанных клеток. У несенсибилизированных людей выраженность ППН при внесении в кровь индуктора не превышает индекса 0,1.

Предлагаемый нами способ прогноза in vitro интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных ХГС осуществляется следующим образом. В микропипетку на 0,08 мл набирают кровь, взятую из пальца больного. Затем кровь вносят в пробирку, содержащую 0,02 мл 5%-ного водного раствора цитрата натрия, далее в эту же пробирку добавляется 0,02 мл водного раствора индуктора апоптоза нейтрофилов (ИАН). В качестве ИАН используются 0,2 г Ребетола и 1,7 млн ME Альтевира, разведенных в 1,0 л изотонического раствора, данный состав ИАН разработан на кафедре инфекционных болезней (зав. каф. проф Ю.М.Амбалов) совместно с кафедрой биохимии (зав. каф. проф. З.И.Микашинович) РостГМУ (ректор проф. А.А.Сависько) с учетом фармакокинетических и терапевтических свойств входящих в него препаратов (биодоступность, объем распределения в крови, максимальная концентрация препарата в крови, период полувыведения препарата).

Одновременно с каждым определением ставился контрольный опыт, заключавшийся в том, что в пробирку с 0,08 мл крови того же испытуемого лица добавляется 0,04 мл 5%-ного раствора цитрата натрия без ИАН. Затем опытная и контрольная пробирки помещаются на 2 часа в термостат при температуре 37°С. Через 2 часа из крови каждой пробирки готовятся мазки с окраской по Романовскому-Гимза. Под иммерсионным увеличением в каждом мазке сосчитывается 100 нейтрофилов и учитывается процент поврежденных клеток.

Расчет индекса повреждаемости нейтрофилов проводится по формуле: (Н₁-Нк)/100, где Н₁ - количество поврежденных клеток в опыте; Нк - количество поврежденных в контроле; 100 - количество сосчитанных клеток.

Стандартность условий проявлялась в использовании точно дозированных количеств крови, антикоагулянта, ИАН, в постоянстве термостатной температуры, неизменности фактора времени. Объективность учета результатов реакции обеспечивалась тем, что в опытном мазке крови оценивалось повреждающее действие ИАН при подсчете 100 однородных форменных элементов - нейтрофилов, а неспецифическая реакция нейтрофилов на условия среды учитывалась путем подсчета 100 элементов в контрольном мазке.

Заявляемый способ основан на фактическом материале, полученном нами при углубленном клинико-лабораторном обследовании 112 больных (44 женщин, 68 мужчин) с РНК-положительным ХГС и равнозначных по своим исходным клинико-лабораторным данным. Все они нуждались в проведении КПТ и не имели к ней противопоказаний. Средний возраст обследованных составил 38,2±7,4 лет.

У 94 (83,9%) больных ХГС показатель ППН у исследуемых пациентов составил 0,07±0,01. Причем палочкоядерные нейтрофилы реагировали на ИАН в меньшей степени, чем сегментоядерные. Возможно это объясняется тем, что повышенную чувствительность к чужеродному агенту нейтрофилы приобретают уже после своего созревания. У 18 (16,1%) больных ХГС данный показатель оказался достоверно выше, чем у остальных (0,26±0,01; p<0,001). В дальнейшем именно в данной группе пациентов у 16 из них на разных этапах проведения противовирусной терапии («Альтевир» в/м 3 млн ME 3 раза в неделю и «Ребетол» перорально 800-1000 мг в сутки) была отмечена выраженная нейтропения, требующая коррекции КПТ либо ее прекращения. Таким образом, индукция апоптоза нейтрофилов является одним из наиболее существенных механизмов действия сочетания препаратов ИФН и рибавирина как in vitro, так и в условиях макроорганизма сенсибилизированных к ним лиц.

Изобретение иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Больной Т., 42 года (и.б. № 536-09), обратился в Гепатологический центр г.Ростова-на-Дону 12.03.2009 г. с обнаруженными в крови IgG к структурным и неструктурным белкам HCV и РНК HCV. Учитывая наличие показаний больному было назначено проведение комбинированной противовирусной терапии: «Альтевир» в/м 3 млн ME 3 раза в неделю и «Ребетол» перорально 1000 мг в сутки в 2 приема утром и вечером. Перед началом КПТ у больного согласно заявляемому способу определили ППН, который составил 0,2 ед. Через 4 недели от начала КПТ у больного начала развиваться нейтропения. Поскольку абсолютное число нейтрофилов через 6 недель снизилось до 700 кл/мкл, доза Альтевира была уменьшена на 50%.

Больная N., 36 лет (и.б. № 1302-10), страдающая ХГС, 3а генотипом HCV, поступила в Гепатологический центр г.Ростова-на-Дону 24.09.2010 г. для проведения противовирусной терапии. ППН - 0,06 ед. В течение 24 недель проведения КПТ у пациентки абсолютное число нейтрофилов оставалось в пределах допустимой нормы (>750 кл/мкл).

В соответствии с заявленным способом это означает, что определение ППН у больных ХГС перед началом КПТ позволяет прогнозировать у них вероятность развития интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении.