способ нековалентной иммобилизации липополисахарида shigella flexneri 2a на твердом гидрофобном носителе

Формула изобретения

Способ иммобилизации липополисахарида Shigella flexneri 2a на твердом гидрофобном носителе за счет образования нековалентных связей между носителем и молекулами липополисахарида, отличающийся тем, что через колонку с гидрофобным носителем, представляющим собой октил-Сефарозу CL-4B пропускают раствор липополисахарида Shigella flexneri 2a в 0,05 М триэтиламмонийацетатном буфере, рН 4,7, содержащем 10% н-пропанола, с последующей отмывкой колонки тем же буфером.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области иммунофармакологии и может быть использовано при создании носителей для аффинной хроматографии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Афинная хроматография является одним из наиболее эффективных методов выделения и очистки специфических иммуноглобулинов (антител) [1]. Для этой цели обычно проводят следующую последовательность операций: активация твердого носителя, химическая иммобилизация на нем антигенного лиганда, обработка полученного таким образом носителя смесью, содержащей специфические иммуноглобулины, с образованием прочного иммунного комплекса иммобилизованного лиганда со специфическими иммуноглобулинами (комплекс антиген-антитело), удаление всех не связавшихся с лигандом компонентов смеси, диссоциация комплекса антиген-антитело, сопровождающаяся освобождением очищенных специфических иммуноглобулинов.

Одним из немногих недостатков данного метода является необходимость создания «сшивок» (зачастую очевидно многочисленных) при иммобилизации молекулы антигена на активированном носителе, что может привести к искажению ее пространственной структуры. При использовании аффинной хроматографии для выделения антител против липополисахаридов (ЛПС) грамотрицательных микроорганизмов часто возникают дополнительные затруднения, обусловленные образованием прочных мицелл, в состав которых может входить до несколько тысяч молекул ЛПС [2].

ЛПС является основным полисахаридным антигеном грамотрицательных бактерий, локализован на наружной поверхности внешней мембраны клеточной стенки и представляет собой семейство структурно родственных амфифильных макромолекул. Полисахаридный фрагмент ЛПС представлен О-специфическим полисахаридом (ОПС), построенным из олигосахаридных повторяющихся звеньев, количество которых может составлять от 1 до нескольких десятков. ОПС присоединяется к олигосахариду кора, который, в свою очередь, связан с липидным компонентом липидом А. Липид А служит «якорем», удерживающим молекулу ЛПС в мембране микробной клетки, а полисахаридный фрагмент направлен вовне в сторону окружающей среды.

В мицеллах ЛПС, образующихся в водных растворах, липид А расположен внутри мицелл, а ОПС, построенный в большинстве случаев из гидрофильных моносахаридных остатков, как и в бактериальных клетках, направлен в сторону водной фазы. При иммобилизации ЛПС на активированном носителе образование ковалентных связей («сшивок») может происходить лишь с пространственно доступными молекулами ЛПС в мицеллах, а также с отдельными, не входящими в состав мицелл молекулами ЛПС, количество которых в водных растворах невелико. Таким образом, несмотря на то, что количественное определение может показать желаемый уровень иммобилизованного ЛПС, количество молекул ЛПС, необратимо ковалентно связанных с носителем, может оказаться невысоко. Поэтому нередко на стадии иммобилизации и на последующих стадиях аффинной хроматографии в элюатах наблюдается заметный уровень ЛПС, что приводит к контаминации целевого продукта.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предлагается способ иммобилизации ЛПС грамотрицательных бактерий на твердых гидрофобных матрицах без образования ковалентных связей между матрицей и молекулами ЛПС. Полученные т.о. активированные липополисахаридом носители могут быть использованы для выделения и очистки специфических антител к ЛПС с помощью аффинной хроматографии. Прочная связь между ЛПС и гидрофобной матрицей обеспечивает фиксацию ЛПС на поверхности матрицы как при образовании иммунного комплекса, так и в процессе его диссоциации. Предлагаемый способ включает обработку гидрофобной матрицы раствором демицеллированного ЛПС в водном буфере с рН 3,0-8,0, содержащем необходимое количество н-пропанола. Введением н-пропанола достигается демицеллирование ЛПС, что обеспечивает эффективную адсорбцию отдельных молекул ЛПС на поверхности матрицы. Склонность ЛПС к демицеллированию зависит от содержания гидрофобных компонентов в ОПС (N-ацетиламино-, дезокси-, дидезоксисахаров, О-ацетильных групп и т.п), а также от заряженности ОПС. Так ОПС, входящий в состав ЛПС, может быть как нейтральным, так и содержать кислотные фрагменты (остатки уроновых кислот, фосфат), положительно заряженные компоненты (остатки аминосахаров, этаноламин), а также иметь цвиттер-ионный характер, т.е. может нести, например, чередующиеся карбоксильные и аминогруппы. На степень демицеллирования ЛПС существенное влияние оказывает также состав, ионная сила и рН буфера. Поэтому при иммобилизации конкретного ЛПС необходимо определить оптимальный качественный и количественный состав буфера, обеспечивающий полное димицеллирование ЛПС. Контроль полноты демицеллирования может быть проведен с помощью проникающей гель-хроматографии на колонке с Сефарозой CL-4B или другим, сходным по характеристикам разделения гелем при элюции буфером, предназначенным для иммобилизации. Время удерживания демицеллированной формы ЛПС практически совпадает со временем удерживания ОПС, который может быть выделен из данного ЛПС с помощью мягкого кислотного гидролиза (1%-ная уксусная кислота, 100°С, 1 час), сопровождающегося отщеплением липида А.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В качестве твердого носителя для иммобилизации ЛПС могут быть использованы фенил-, метил-, этил-, бутил-, амил-, гексил-, децил- или додецилагароза (4% сшивки), а также октил-. или фенил-Сефароза CL-4B, а также колонки с Суперозой 4 или 6 (Fast Flow) или колонки с Toyopearl Resins бутил-650 и фенил-650. Концентрация н-пропанола в буфере определяется экспериментально, но обычно не превышает 10-15%. Концентрация солевых компонентов буфера не превышает 0,2 М. Температура в процессе иммобилизации поддерживается в интервале 10-20°С, причем температура, при которой проводится афинная хроматография, обычно не превышает температуры, поддерживающейся в процессе иммобилизации ЛПС на носителе. Время иммобилизации обычно составляет 0,5-20 часов. Гидрофобный носитель перемешивают с раствором ЛПС в буфере при скорости 20-50 об/мин с помощью орбитального шейкера и далее промывают буфером для аффинной хроматографии до отсутствия компонентов иммобилизационного буфера и ЛПС. Все стадии иммобилизации могут быть проведены также непосредственно в колонке для аффинной хроматографии. Для определения количества сорбировавшегося на носителе ЛПС отмеренный объем геля промывают 2-3-кратным объемом иммобилизационного буфера, содержащего 40-45% н-пропанола, с последующим диализом против дистиллированной воды и лиофилизацией.

ПРИМЕР

Следующий пример, приведенный в целях детализации и иллюстрации изобретения, не имеет цели ограничения притязаний настоящего изобретения.

Через колонку (1,5×1 см) с 10 мл октил-Сефарозы CL-4B пропускают 30 мл водного 0,05 М триэтиламмонийацетатного буфера, рН 4,7, содержащего 45% н-пропанола, со скоростью 5 мл/час, а затем колонку уравновешивают тем же буфером, содержащим 10% н-пропанола (об./об.) (буфер А). Далее на колонку, присоединенную к проточному УФ-детектору (длины волн 226 и 276 нм), наносят раствор 10 мг ЛПС Shigella flexneri 2a (получен водно-фенольной экстракцией по методу Вестфаля и Янна) в 3 мл буфера А. После промывания 30 мл буфера А колонку промывают 30 мл физ.раствора и наносят на нее 1 мл гипериммунной кроличьей сыворотки. Колонку промывают физ.раствором до поглощения при 226 нм менее 0,05 AU и далее 3,5 М раствором хлористого магния для разрушения иммунного комплекса. Фракции, содержащие (по данным УФ-детектора) белковые компоненты, объединяют, диализуют против физ.раствора (4 смены по 1 часу) при температуре 8-10°С и лиофилизуют. Сравнительный анализ исходной сыворотки и полученного продукта с помощью реакции торможения пассивной гемагглютинации, иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга показал, что в результате аффинной хроматографии количественно выделена смесь специфических антител против ЛПС Shigella flexneri 2a.

Источники информации

1. Аффинная хроматография. Методы. Редакторы П.Дин, У.Джонсон, Ф.Мидл. Пер. с англ. Канд. хим. наук Б.А.Клящицкого. М.: Мир, 1988.

2. High-molecular Weight Components in Lipopolysaccharides of Salmonella typhimurium, Salmonella minesota, and Escherichia coli. Peterson, A.A., and E.J.Mcgroarty. J.Bacteriology, 1985, 162:738-745.