гепатопротекторное средство

Формула изобретения

Применение иммобилизированной на низкомолекулярном водорастворимом полимере с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве гепатопротекторного средства.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине, конкретно к фармакологии и гепатологии.

Для лечения заболеваний используется большое количество медикаментозных и немедикаментозных способов [1, 2].

Известен препарат нативной гиалуронидазы, обладающий гепатопротекторной активностью [3]. Данное средство является наиболее близким по технической сущности.

Недостатками данного средства являются высокий риск развития побочных эффектов и осложнений (связанных с токсичностью препарата и парентеральным единственно возможным путем его введения) [4, 5] при его использовании в эффективных дозах.

Известно средство, представляющее собой иммобилизированную с помощью ионизирующего излучения (нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидазу [6].

Нами впервые выявлены его выраженные гепатопротекторные свойства.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение показаний к применению иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы.

Поставленная задача достигается применением иммобилизированной на низкомолекулярном водорастворимом полимере с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве гепатопротекторного средства.

Новым в предлагаемом изобретении является использование иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве гепатопротекторного средства.

Используемое нами оригинальное средство иммобилизированной с помощью ионизирующего излучения (нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидазы [6] было разработано и получено ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент» (г.Новосибирск) совместно с НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск). Иммобилизацию гиалуронидазы осуществляли на низкомолекулярных водорастворимых полимерах, предварительно подвергшихся воздействию ионизирующего излучения в дозе 1-5 Мрад. Показано, что данное средство при его парентеральном и пероральном введении способно увеличивать резерв стволовых клеток в организме [6].

Заболевания печени и желчевыводящих путей являются весьма распространенными во всем мире и занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности населения нашей страны. Опасность для здоровья и социальная значимость данной патологии печени определяют необходимость постоянной разработки новых эффективных патогенетически обоснованных методов фармакологической терапии и профилактики данных заболеваний [1, 2]. При этом в последнее время активно ведутся исследования, направленные на разработку средств для лечения различных заболеваний, в том числе заболеваний печени, путем фармакологической стимуляции эндогенных стволовых клеток (СК) организма [7, 8]. Показано наличие гепатопротекторных свойств у препарата нативной гиалуронидазы [3], определяемых его системным/резорбтивным действием при парентеральном введении. Однако достижение указанного технического результата возможно лишь при использовании данного средства в токсичных высокоиммуногенных дозах [3], когда эндогенная система его инактивации (представленная в организме тканевыми и сывороточными факторами деградации гиалуронидазы) оказывается недостаточной и/или несостоятельной [9].

В то же время известно, что иммобилизизация гиалуронидазы с помощью ионизирующего излучения на низкомолекулярном носителе сопровождается появлением новых физико-химических свойств у данного фермента, делающих эффективным его применение в значительно более низких дозах, в том числе в качестве средства, увеличивающего популяцию родоначальных клеток в костном мозге [6]. Однако при этом следует отметить имеющую место значительную избирательность эффектов (биологических свойств) иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) в отношении клеток-предшественников различных классов [6], указывающую на уникальность спектра ее фармакологической активности (значительную специфику и отличие действия от препарата нативного фермента).

Кроме того, известно, что процесс манипуляции разнородными субстанциями на молекулярном уровне [10, 11], в том числе с использованием физических факторов, обладающих высокой энергией, может сопровождаться существенными изменениями стереохимической структуры исходных веществ и в конечном итоге приводить к модификации их свойств, характер которой зачастую является непредсказуемым.

Факт применения иммобилизированной гиалуронидазы с достижением нового технического результата, заключающегося в получении выраженных гепатопротекторных эффектов на фоне снижения риска развития осложнений, для специалиста является неочевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на беспородных крысах в количестве 52 штук массой 250-300 г и 37 мышах линии CBA/CaLac. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Экспериментальной моделью патологии печени являлся хронический токсический гепатит (ХТГ) [3]. У крыс ХТГ моделировался внутрижелудочным введением 50% раствора CCl₄ представляющем собой «классический» гепатотропный яд) на оливковом масле в дозе 2 мл/кг в течение 3-х недель 2 раза в неделю (6 раз). У мышей поражение печени вызывали внутрижелудочным введением тетрахлоруглерода (ТХУ) в виде 20% раствора на оливковом масле в объеме 0,2 мл/мышь живого веса по той же схеме. Для оценки состояния печени проводили биохимические исследования содержания в сыворотке крови аспартат-, аланинаминотрасфераз (АсАТ, АлАТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) на 7, 14, 21, 28 и 40-е сут, а также морфологическое исследование печени на 21-е и 40-е сут [12]. Кровь для исследования получали через катетер, имплантированный в бедренную артерию с последующей перевязкой сосудов. На гистологических препаратах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли количество клеток инфильтрата с помощью окулярной сетки Г.Г.Автандилова [13], содержащей 25 тест-точек. В 20 полях зрения подсчитывали количество клеток инфильтрата, попадающих на тест-точки сетки. Относительную площадь инфильтрации высчитывали как отношение точек сетки, приходящихся на клетки инфильтрата, ко всем точкам сетки в 20 полях зрения (т.е. к 500 точкам). Площадь соединительной ткани определяли с помощью средств компьютерной обработки графических данных. Для этого на стандартной площади среза печени (последовательные микрофотографии 10 полей зрения, выполненные микровидеокамерой "Digital micro", с программой передачи изображения на компьютер фирмы «Элекард», Томск) измеряли площадь структур, окрашенных пикрофуксином, и вычисляли процентное отношение к выбранной стандартной площади. Для исследования участия стволовых клеток в процессах восстановления печени у мышей на 7-е сут после последнего введения тетрахлоруглерода (ТХУ) методом клонирования in vitro определяли содержание паренхиматозных предшественников в печени (КОЕ-Печ) и количество мезенхимальных прогениторных элементов (КОЕ-Ф), содержащих в своем составе истинные (мультипотентные [14]) СК, в костном мозге и периферической крови [15]. С целью изучения механизмов регуляции функций СК с помощью иммуноферментного анализа определяли содержание SDF-1-фактора [16] в кондиционных средах культуры клеток печени и костного мозга. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1

Опытным животным после моделирования хронического токсического гепатита (на 19-е сут эксперимента) вводили: 1) перорально 1 раз в день в течение 2 суток по 50 ЕД/кг иммобилизированной с использованием направленного потока ускоренных электронов (1 Мрад) на полиэтиленгликоле гиалуронидазы (имГД-1); 2) внутрибрюшинно 1 раз в день в течение 10 суток по 25 ЕД/кг препарата иммобилизированной с помощью гамма-излучения (5 Мрад) на гидроксиэтиленкрахмале гиалуронидазы (имГД-2); 3) внутрибрюшинно 1 раз в день в течение 2 суток препарат нативной гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ), используемый режим введения нативной гиалуронидазы в предварительных экспериментах был определен как наиболее эффективный. Контрольным животным на фоне моделирования хронического токсического гепатита вводили физиологический раствор.

В ходе эксперимента курсовое введение тетрахлоруглерода сопровождалось появлением характерных, в том числе морфологических и биохимических, признаков хронического гепатита (табл.1, 2). Отмечалось повышение активности АлAT, AcAT и ЩФ в сыворотке крови на 7, 14, 21, 28, 40-е сут опыта и выраженное нарушение долькового строения печени (поля грануляционной ткани, новообразование сосудов и печеночных протоков, тельца Каунсильмена, выраженная крупнокапельная жировая дистрофия, жировые кисты).

Применение препаратов как нативной, так и иммобилизированной гиалуранидазы приводило к снижению ферментативной активности сыворотки крови, но наиболее низкие значения концентрации ферментов регистрировались в группах крыс, получавших имГД. При этом независимо от схемы введения данного препарата нормализация содержания сывороточной ЩФ отмечалась с 21-х сут, а АлАТ и АсАТ с 28-х опыта (табл.1).

Кроме того, у животных после введения нативной и иммобилизированной гиалуронидазы на фоне CCl_4-гепатита отмечалась сохранность долькового строения печени. При этом тельца Каунсильмена встречались лишь в единичных случаях, а жировая дистрофия гепатоцитов была преимущественно мелкокапельная. Менее существенная была и инфильтрация портальных трактов, причем в случае использования имГД инфильтрат не проникал внутрь доли. В то же время введение препаратов фермента сопровождалось значительным уменьшением площади соединительной ткани в печени (табл.2). Так, использование имГД в течение 2-х и 10-и сут приводило к снижению величины данного показателя на 40-е сут в 5,4 и 7,1 раз в сравнении с контролем соответственно. Причем указанные изменения были существенно более значимы, чем при использовании нативной гиалуронидазы.

Таким образом, биохимическое и морфологическое исследования состояния печени у крыс, получавших имГД на фоне моделирования хронического токсического гепатита, выявило выраженные противовоспалительные, антихолестатические и антисклеротические эффекты данного препарата, значительно превосходящие таковые у нативной гиалуронидазы.

Изучение механизмов гепатопротекторного действия имГД в экспериментах на мышах выявило его зависимость от состояния пула регионарных и костномозговых клеток-предшественников. При этом было показано, что использование препарата нативной гиалуронидазы приводит к увеличению количества паренхиматозных клеток-предшественников в печеночной ткани (КОЕ-Печ) на фоне отсутствия статистически значимых изменений со стороны СК костного мозга (представляющих собой «глубокий резерв» регенерации [6-8, 14]) и периферической крови, что полностью соответствовало полученным нами ранее данным [3] (табл.3). В то же время введение имГД сопровождалось не только стимуляцией регионарных предшественников, но и существенным расширением пула родоначальных клеток «ткани-депо» (костного мозга), их мобилизацией в периферическую кровь и направленным хомингом в пораженный орган, связанным с падением выработки SDF-1-фактора [16] клетками костного мозга на фоне увеличения его продукции элементами микроокружения печеночной ткани (табл.3).

Полученные результаты свидетельствуют о значительной модификации биологических свойств гиалуронидазы при ее иммобилизации на носителе с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза, заключающихся в стимуляции механизмов компенсации «глубокого резерва», определяемых СК гемопоэтической ткани [7, 8].

В целом представленные данные указывают на выраженную гепатопротекторную активность иммобилизированной гиалуронидазы, связанную с повышением реализации собственного регенераторного потенциала организма [3, 7, 8] в результате стимуляции функциональной активности костномозговых и регионарных клеток-предшественников.

Выявленные свойства предлагаемого средства указывают на высокую эффективность и перспективность его использования при дегенеративных заболеваниях печени, важным звеном патогенеза которых является низкая степень реализации собственного регенераторного потенциала организма.

Таблица 2
Влияние препаратов на морфологию печени крыс с хроническим CCl 4-гепатитом
Сроки исследования	Относительная площадь инфильтрата (%)	Относительная площадь соед. ткани (%)
21 сутки	40 сутки	21 сутки	40 сутки
H2O (контроль)	31,8±2,67*	27,30±1,3*	7,46±1,72*	7,8±0,47*
имГД-1	9,2±1,1*#	10,64±0,7*#&	1,89±0,2*#	1,44±0,17*#&
имГД-2	4,1±0,8*#&	6,3±0,5*#&	0,98±0,3#&	1,1±0,5#&
Нативная гиалуронидаза	8,4±0,7	13,4±0,7*#	1,6±0,3*#	2,3±0,09*#
* - отмечена достоверность различия показателя от фоновых значений при p<0,05;
# - отмечена достоверность различия показателя от контрольных значений при p<0,05;
& - отмечена достоверность различия показателя от его значений в группе животных, получавших препарат нативной гиалуронидазы при p<0,05.

Таблица 3
Влияние препаратов на содержание клеток-предшественников в костном мозге, периферической крови и печени и продукцию SDF-1-фактора клетками микроокружения тканей, X±m
Группы	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. мононуклеаров	КОЕ-Печ в печени, на 105 нуклеаров	SDF-1-фактор, клетки костного мозга (нг/мл)	SDF-1-фактор, клетки печени (нг/мл)
Фон	5,4±0,27	0,48±0,1	10,3±0,41	0,5±0,01	0,24±0,02
Контроль	6,2±0,4	0,5±0,09	6,1±0,08*	0,43±0,02*	0,22±0,01
имГД-1	7,63±0,4 *#&	4,6±0,2*#&	17,2±1,2*#&	0,32±0,01*# &	0,71±0,02*#&
имГД-2	9,2±0,3*#&	6,4±0,3*#&	20,6±1,1*#&	-	-
Нативная гиалуронидаза	6,1±0,3	0,57±0,3	13,7±0,8*	0,4±0,01*	0,28±0,03
* - отмечена достоверность различия показателя от фоновых значений при p<0,05;
# - отмечена достоверность различия показателя от контрольных значений при p<0,05;
& - отмечена достоверность различия показателя от его значений в группе животных, получавших препарат нативной гиалуронидазы при p<0,05.

Литература

1. Венгеровский А.И. Эффективность и механизм действия гепатопротекторов при экспериментальном токсическом повреждении печени: Дисс доктора мед. наук. - Томск, 1991. - С.4-57.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.1. - М.: Медицина, 1996. - 624 с.

3. Патент (RU) на изобретение № 2392000 «Способ терапии экспериментального хронического гепатита» (опубл. 20.06.2010, Бюл. № 17). Авторы: Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.

4. Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents. JAMA. - 1992 - Vol.268. - p.2845-2857.

5. De Swarte R.D., Drug allergy. In: Patterson R. e.a. Allergic Diseases Diagnosis and Management, 4th ed. Philadelphia, JB Lippincott. - 1993 - p.396-551.

6. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы. // Вестник РАМН. - 2009. - № 11. - С.6-9.

7. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.

8. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы. // Наука в России - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - № 1. С.4-8.

9. Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? // Glycobiology. - 2003. -Vol.13. - № 12. - P.105-115.

10. Сейфулла Р.Д., Тимофеев А.Б., Орджоникидзе З.Г. и др. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии. // Экспер. и клин. фарм. 2008. - Том 71. - № 1. - С.61-69.

11. Евдокимов Ю.М. Пространственно упорядоченные формы ДНК и ее комплексов - основа создания наноконструкций для медицины и биотехнологий. // Российские нанотехнологии. - 2006. - № 1-2. - С.256-264.

12. Holtzer H. Cell lineages, stem cells and the quantal cell cycle concept / Stem cells and tissue homeostasis. Eds: B.I.Lord, C.S.Poten, R.J.Cole. - New York, Cambrige Unyversity Press, 1978. - P.1-28.

13. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. - M.: Медицина, 1990. - 382 с.

14. Эпштейн О.И., Зюзьков Г.Н., Сотникова Н.В. и др. Механизмы гепатопротекторного эффекта препарата сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - № 4. - С.194-198.

15. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

16.Tang Y.L., Qian K., Zhang Y.C. et al. Mobilizing of haematopoietic stem cells to ischemic myocardium by plasmid mediated stromal-cell-derived factor-lalpha (SDF-lalpha) treatment // Regul. Pept. - 2005. - Vol.125. - P.1-8.