лечебно-профилактический биопрепарат против бактериальных и грибковых инфекций, обладающий антибиотикоустойчивостью

Формула изобретения

1. Лечебно-профилактический биопрепарат против бактериальных и грибковых инфекций, обладающий антибиотикоустойчивостью, включающий смесь биомассы двух штаммов бактерий Bacillus subtilis, стабилизатор, или наполнитель, или носитель, отличающийся тем, что он выполнен в сухой или жидкой форме и содержит смесь биомассы штамма В.subtilis 11В и биомассы штамма Bacillus subtilis 12B в равных соотношениях с титром соответственно не менее 1×10⁸ КОЕ/г или 1×10⁸ КОЕ/мл в количестве 25-50 или 91 мас.%, стабилизатор, или наполнитель, или носитель - остальное.

2. Лечебно-профилактический биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что он выполнен в сухой форме, содержит смесь биомассы штамма В. subtilis 11В и Bacillus subtilis 12B в равных соотношениях с титром не менее 1×10⁸ КОЕ/г и стабилизатор? или наполнитель, или носитель при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Смесь биомассы бактерий штамма
В. subtilis 11В и Bacillus subtilis 12B
в равных соотношениях
с титром не менее 1×108 КОЕ/г	25-50
Стабилизатор, или наполнитель, или носитель	остальное

3. Лечебно-профилактический биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что он выполнен в жидкой форме, содержит смесь биомассы бактерий штамма В.subtilis 11В и Bacillus subtilis 12B в равных соотношениях с титром не менее 1×10⁸ КОЕ/мл, а в качестве стабилизатора содержит натрия хлорид при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Смесь биомассы бактерий штамма
B.subtilis 11В и Bacillus subtilis 12B
в равных соотношениях
с титром не менее 1×108 КОЕ	91
Натрия хлорид	9

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии, ветеринарии и биотехнологии и представляет собой новый препарат - пробиотик из двух штаммов бактерий рода Bacillus, обладающий широким спектром антагонизма по отношению к различным патогенным видам бактерий и грибов, а также устойчивостью к широкому кругу антибиотиков.

В настоящее время препараты - пробиотики из бактерий рода Bacillus - находят широкое применение в ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных, поскольку подавляют развитие патогенных бактерий. Однако при тяжелых инфекционных заболеваниях иногда нельзя отказаться от назначения антибиотиков, поскольку они оказывают наиболее быстрый лечебный эффект. Применение антибиотиков приводит к негативным последствиям для организма животного: развитию дисбактериоза и снижению иммунитетета, а также к развитию антибиотикоустойчивости у патогенных штаммов. Для снятия негативных последствий антибиотикотерапии дополнительно применяют пробиотики, чем раньше используется пробиотик, тем меньше осложнений после антибиотикотерапии. Оптимально использование пробиотика одновременно с антибиотиком, но для этого штаммы, входящие в состав пробиотического препарата, должны обладать устойчивостью к антибиотикам.

Известен природный штамм Bacillus subtilis 11В, обладающий широким спектром антагонизма против бактериальных и грибных патогенов, вызывающих заболевания человека, животных и растений, что создает возможность создания на его основе препаратов-пробиотиков, способных лечить широкий круг заболеваний и использоваться в медицинской, ветеринарной и сельскохозяйственной практике (1).

Препарат на основе штамма Bacillus subtilis 11B (2) устойчив к действию антибиотиков пенициллинового ряда (b-лактамным антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину), полимиксину, а также малочувствителен к стрептомицину, гентамицину, тетрациклину. Поэтому назначать препарат для лечения людей и животных можно совместно с антибиотиками, к которым штамм Bacillus subtilis 11B имеет устойчивость, для предотвращения осложнений антибиотикотерапии (развития дисбиоза кишечника и снижения иммунитета).

Известен также природный Bacillus subtilis 12B (3) и препарат на его основе (4), используемый в качестве ветеринарного пробиотика. Штамм и препарат обладают антагонизмом в отношении патогенных ветеринарных штаммов патогенных бактерий и устойчивостью (или малой чувствительностью) к ряду антибиотиков, в том числе к тобрамицину, эритромицину, линкомицину, неомицину, рифампицину, т.е к тем антибиотикам, к которым чувствителен штамм Bacillus subtilis 11B.

Совмещение двух штаммов Bacillus subtilis 11B и Bacillus subtilis 12 в одном препарате позволяет расширить спектр антибиотикоустойчивости препарата и назначать препарат совместно с антибиотиками, без снижения его эффективности.

Для повышения эффективности действия препаратов - пробиотиков из бацилл - создаются комплексные препараты, включающие несколько штаммов бактерий. Наиболее близкими к изобретению являются штаммы Bacillus subtilis и Bacillus liheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов (5).

Штаммы бактерий Bacillus Sabtilis ВКПМ В-7092, ВКПМ В-7048 и штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 используются в качестве компонентов препарата Ветом против вирусных и бактериальных инфекций. Препарат содержит смесь биомассы указанных штаммов в споровой форме с титром не менее 3×10¹⁰ спор/г. В состав препарата входят также крахмал и сахар при определенном количественном соотношении компонентов. Комплексный бактериальный препарат обладает широким спектром антивирусной и антибактериальной активности.

Недостатком данного препарата является отсутствие у данного препарата антагонизма в отношении плесневых грибов родов Fusarium, Alternaria, Penicillium - источников опасных микотоксинов, споры которых попадают в корма для животных и могут являться причиной микотоксикозов. Нет указаний на возможность использования препарата совместно с антибиотиками, без которых нельзя обходиться при тяжелых формах инфекции.

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового комплексного бактериального препарата - пробиотика на основе штаммов бактерий Bacillus subtilis 11B и Bacillus subtilis 12B, обладающего более широким спектром антагонистической активности, в том числе к штаммам родов Pseudomonas, Streptococcus, Escherihia coli, грибам родов Fusarium, Alternaria, Penicillium, и устойчивого к широкому кругу антибиотиков, что позволяет использовать его для лечения тяжелых форм инфекции при одновременной терапии с антибиотиком.

Для решения указанной задачи предлагаются:

- штамм бактерий Bacillus subtilis 11B, депонированый под номером ВКМ В-2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН 19.08.1999 г. Штамм выделен из здорового растения пшеницы в Уфимском районе. Идентификацию штамма проводили по «Определителю бактерий Берджи». - М.: Мир, 1997;

- штамм В. subtilis 12В, депонированный в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под номером 12В-ДЕП. Штамм выделен из зоокомпоста в Уфимском районе республики Башкортостан. Идентификацию штамма проводили по «Определителю бактерий Берджи». - М.: Мир, 1997.

Технический результат заключается в том, что препарат содержит биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis 11B и бактерий Bacillus subtilis 12В в равных соотношениях.

Сухая форма препарата дополнительно содержит крахмал и сахар.

Препарат содержит в качестве основы живые клетки штамма Bacillus subtilis 12В и штамма Bacillus subtilis 11B в равных количествах и стабилизатор (или носитель) при следующем соотношении компонентов, мас %:

Биомасса штаммов Bacillus subtilis, 1×108-10×10 9 живых микробных клеток в 1 мл препарата	90-99
Стабилизатор, наполнитель (носитель)	1-10

В качестве стабилизатора для жидкой формы препарата можно использовать натрия хлорид в концентрации 0,9%. При получении сухих форм препарата (гранулирование, таблетирование или лиофильное высушивание) в биомассу вносят наполнитель (или носитель), что обусловлено его защитным действием для бактериальных клеток при высушивании.

При получении сухой биомассы штаммов (для получения порошка или гранул) в биомассу дополнительно вносят глюконат или стеарат кальция, крахмал, желатин и сахарозу и др. стабилизаторы в количестве от 1,0-10,0 мас.% с целью придания биомассе необходимых физических свойств. При необходимости можно смешивать готовую биомассу с сорбентом (например, активированным углем, карболонгом, лактулозой, ацетилфталилцеллюлозой, гелем фосфата алюминия) в соотношении 1:1 по сухому остатку, после чего жидкость отделяют фильтрацией и высушивают микрогранулы иммобилизованной биомассы вакуумной сушкой до остаточной влажности 5-10%.

После получения биомассы в сухом виде (порошок, гранулы) биомассу смешивают со вспомогательными веществами в соотношении 2:1 - 3:1 и таблетируют. В качестве вспомогательных веществ используют (мас.%.): стеарат кальция (0,5-1,0), тальк (2,5-3,0) и(или) крахмал (0,5-1,0) и(или) аэросил (0,5-0,8), глюкозу (5,0-20,0), сухое молоко (10,0-30,0) и(или) метилцеллюлозу (или поливинилпирролидон) (0,1-0,5). Получают таблетированную форму препарата, удобную в употреблении.

Пример 1. На основе штамма B.subtilis 11В с типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены 5 вариантов жидкого препарата с различным содержанием микробных клеток в составе 1 дозы препарата.

Вариант 1. Препарат, содержащий, мас.%:

биомасса B.subtilis 11В, 0,5×10⁸ живых микробных клеток или колониеобразующих единиц (КОЕ);

биомасса B.subtilis 12В, 0,5×108 живых микробных клеток или колониеобразующих единиц (КОЕ)
в 1 мл препарата	91;
стабилизатор (натрия хлорид)	9.

Вариант 2.

Препарат, содержащий, мас.%:

биомасса B.subtilis 11В, 2×10⁸ живых микробных клеток (КОЕ);

биомасса B.subtilis 12В, 2×108 живых микробных клеток (КОЕ)
в 1 мл препарата	91,
стабилизатор (натрия хлорид)	9.

Вариант 3. Препарат, содержащий, мас.%:

биомасса B.subtilis 11В, 5×10 ⁸ живых микробных клеток (КОЕ);

биомасса B.subtilis 12В, 5×108 живых микробных клеток (КОЕ)
в 1 мл препарата	91;
стабилизатор (натрия жлорид)	9.

Вариант 4.

Препарат, содержащий, мас.%:

биомасса B.subtilis 11В, 1,0×10⁹ живых микробных клеток (КОЕ);

биомасса B.subtilis 12B, 1,0×109 живых микробных клеток (КОЕ)
в 1 мл препарата	91;
стабилизатор (натрия хлорид)	9.

Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные флаконы, укупоривали резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками.

Пример 2. Штамм В. subtilis 11В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.

Штамм В. subtilis 12В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.

Полученные биомассы смешивают в равных соотношениях (при необходимости концентрируют с помощью микрофильтрации до содержания микробных клеток 100×10⁹ кл/мл по ОСО на 10 ЕД). К биомассе добавляют стабилизатор на основе крахмала и лактозы или сахарозо-желатиновой среды, смешивают, гранулируют и подсушивают до остаточной влажности не более 5%. Далее порошок измельчают до получения однородной массы и дозировано расфасовывают во флаконы (или пакеты).

Вариант 5. Препарат, содержащий, мас.%.:

биомасса	25,0
крахмал	31,1
лактоза	42,6
метилцеллюлоза (или поливинилпирроллидон)	1,3

Готовый порошок белого или бежевого цвета, сладковатый на вкус. Остаточная влажность не более 5%. Порошок растворяется в воде, 0,1 н. HCl и нейтральных растворах в течение 15 мин с образованием рыхлого комковатого осадка. Готовый порошок содержат биомассу В. subtilis в количестве не менее (1,5±0,5)×10⁸ КОЕ/г.

Пример 3. Штамм В. subtilis 11В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.

Штамм В. subtilis 12В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.

Полученные биомассы смешивают в равных соотношениях (при необходимости концентрируют с помощью микрофильтрации до содержания микробных клеток 100×10⁹ кл/мл по ОСО на 10 ЕД). К биомассе добавляют стабилизатор на основе крахмала и лактозы или сахарозо-желатиновой среды и вносят глюконат кальция в количестве 2,0 мас.%, перемешивают и досушивают открытым способом (или лиофильно в кассетах). По окончании сушки порошок измельчают до получения однородной массы, добавляют вспомогательные вещества и таблетируют.

Вариант 6. Препарат, содержащий, мас.%:

биомасса	50,0
стеарат кальция	0,8
сахарозо-желатиновая среда	29,6
глюконат кальция	2,0
тальк	2,5
глюкоза	5,0
сухое молоко	10,0
метилцеллюлоза	0,1

Готовые таблетки имеют круглую форму диаметром 0,8-12 мм с гладкой твердой поверхностью беловато-серого или желтоватого цвета, сладковатые на вкус, со специфическим запахом. Средняя масса таблетки составляет от 0,75±0,05 г с остаточной влажностью не более 5%. Таблетки растворяются в 0,1 н. HCl и нейтральных растворах в течение 30-45 мин с образованием рыхлого комковатого осадка. Готовые таблетки содержат биомассу штамма В. subtilis в количестве (2,5±0,5)×10⁸ KOE.

Проверяли безвредность полученных вариантов препарата на лабораторных животных, специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур - представителей различных групп патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивость к антибиотикам.

Препарат характеризуется безвредностью (см. таблицу 1).

Для определения безвредности содержимое флакона с жидким препаратом использовали без разведения, порошок или таблетку разводили в 10 мл физиологического раствора и вводили 0,5 мл препарата перорально мышам. Для каждого варианта опыта использовали не менее 10 мышей массой 15-16 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания.

Таблица 1
Изучение безвредности препарата
№	Варианты препарата (кол-во клеток в 1 дозе)	Количество животных (штук)	Средняя масса животных, г
Было	Выжило	До введения	Через 1 сутки	Через 5 суток
1	0,5×10 8	10	10	15,4±0,3	15,6±0,3	16,9±0,3
2	2,0×10 8	10	10	15,7±0,2	15,9±0,3	17,0±0,2
3	5,0×10 8	10	10	15,82±0,2	16,0±0,2	17,08±0,2
4	1,0×10 9	10	10	15,65±0,2	15,7±0,2	17,1±0,2
5	1,5×10 8	10	10	16,0±0,2	16,1±0,2	17,2±0,2
6	2,5×10 8	10	10	15,6±0,2	15,8±0,2	17,1±0,2

Испытание показало, что все животные остались живыми, их первоначальная масса увеличилась, отсутствовали какие-либо признаки заболевания.

Препарат характеризуется широким спектром антагонистической активности в отношении тест-штаммов культур патогенных микроорганизмов (таблица 2).

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое флакона с порошком (или таблетку) растворяли в 2-5 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур.

Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N 2 без исследуемой культуры.

Таблица 2
Антагонистическая активность вариантов препарата
№	Тест-культуры	Варианты препарата (кол-во клеток в 1 дозе)
1	2	3	4	5	6
0,5×108	2,0×10 9	5,0×10 9	1,0×10 9	1,5×10 9	2,5×10 8
1	2	3	4	5	6	7	8
2	Staphylococcus	10-15	15-20	15-20	15-20	18-20	18-20
	aureus (Филиппов)
3	Staphylococcus	10-15	15-20	15-20	15-20	18-20	18-20
	aureus (Никифоров)
4	St. aureus 66	10-12	15-16	15-16	15-16	15-16	15-16
5	St. aureus 67	8-10	10-12	10-12	10-12	10-12	10-12
7	St. aureus 80	10-12	12-15	12-15	12-15	12-15	12-15
8	Proteus vulgaris 177	10-15	15-20	15-20	15-20	15-20	15-20
9	Pr. vulgaris 12	8-10	10-12	12-15	12-15	12-15	12-15
10	P. vulgaris 48	8-10	12-15	12-15	12-15	12-15	12-15
11	Pr. vulgaris 41	8-10	10-12	12-15	12-15	12-15	12-15
12	Proteus mirabilis 237	15-18	18-20	18-20	18-20	18-20	18-20
13	Pr. mirabilis 40	12-15	15-20	15-20	15-20	15-20	15-20
14	Pr. mirabilis 36	12-15	15-18	15-18	15-18	15-18	15-18
15	Pr. mirabilis 35	15-18	18-20	18-20	18-20	18-20	18-20
16	Candida albicans	25-30	25-30	25-30	25-30	25-30	25-30
17	Escherihia coli 177	20-22	22-25	22-25	22-25	22-25	22-25
18	E.coli 154	10-12	12-15	12-15	12-15	12-15	12-15
19	E.coli 140	10-12	12-15	12-15	12-15	12-15	12-15
20	Shigella sonne 2586	10-12	12-15	12-15	12-15	12-15	12-15
21	Shigella HK	20-22	22-25	22-25	22-25	22-25	22-25
22	Pseudomonas	12-15	15-20	15-20	15-20	15-20	15-20
	aeruginosa 8
23	P. aeruginosa 126	10-12	12-15	12-15	12-15	12-15	12-15
24	Streptococcus 321	10-12	12-15	12-15	12-15	12-15	12-15
25	Streptococcus 325	10-12	12-15	12-15	12-15	12-15	12-15
26	Streptococcus 191	10-12	12-15	12-15	12-15	12-15	12-15
27	Paratyhv 269	10-12	12-15	12-15	12-15	12-15	12-15
28	Paratyhv 15	12-15	15-20	15-20	15-20	15-20	15-20
29	Hexaere II 1230	12-15	15-20	15-20	15-20	15-20	15-20

Из данных таблицы 1 следует, что оптимальным количеством живых микробных клеток в одной дозе препарата является 2-5×10⁸. Снижение количества микробных клеток до 0,5×10⁸ снижает уровень антагонистической активности, а увеличение количества микробных клеток до 10×10 ⁸ и выше не изменяет существенным образом антагонистическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов. Использование препарата в таблетках (вариант 6) не снижает уровень антагонистической активности.

Препарат обладает устойчивостью к целому ряду антибиотиков (таблица 3).

Чувствительность препарата к антибиотикам определяли с помощью стандартных дисков, пропитанных антибиотиками. В чашку Петри с МПА наливали 1 мл клеточной суспензии препарата в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и равномерно распределяли по поверхности агара. Избыток удаляли пастеровской пипеткой. На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывали диски с антибиотиками, по 5 дисков на каждую чашку. Чашки выдерживали в термостате при температуре (37±1)°С в течение (18±2) ч, после чего измеряли зоны задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самого диска.

Таблица 3
Антибиотикоустойчивость вариантов препарата
№	Антибиотики	Зоны торможения роста, мм
Варианты препарата
1	2	3	4	5	6
1	Ампициллин	0-6	0-6	0-6	0-6	0-6	0-6
2	Бензилпенициллин	0	0	6	8	6	6-8
3	Карбенициллин	0	0	0	0	0	0
4	Полимиксин	0	0	0	0	0	0
5	Стрептомицин	0-8	0-8	0-8	0-8	0-8	0-8
6	Рифампицин	0-6	0-6	6	6	6-8	6-8
7	Гентамицин	0-7	0-7	0-6	0-6	0-6	0-6
8	Клотримазол	8-10	8-10	8-10	10	10	10
9	Левомицитин	18-20	18-20	18-20	18-20	18-20	18-20
10	Тетрациклин	6-8	6-8	6-8	6-8	6-8	6-8
11	Мономицин	6-8	6	6	6-8	6-8	8
12	Гептомицин	10-15	10-15	10-15	10-15	10-15	10-15
13	Клотримазол	10-12	10-12	10-12	10-12	10-12	10-12
14	Неомицин	6	6	0	6-8	6-8	6-8
15	Цепарин	15-20	15-20	15-20	15-20	15-20	15-20
16	Канамицин	10-15	10-15	10-15	10-15	10-15	10-15
17	Новограмон	20-25	20-25	20-25	20-25	20-25	20-25
18	Бисенгиол	10-15	10-15	10-15	10-15	10-15	10-15
19	Тобрамицин	6-8	0-8	0	6	6-9	6
20	Эритромицин	6-8	0	6	6	6-9	6-8

Из полученных данных следует, что препарат устойчив к действию антибиотиков пенициллинового ряда (b-лактамным антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину), полимиксину, а также малочувствителен к стрептомицину, гентамицину, тетрациклину, тобрамицину, эритромицину, мономицину, рифампицину.

Эффективность заявляемого препарата в оптимальных концентрациях микробных клеток (2-10)×10 ⁸ для нормализации микробиоценоза кишечника оценена при лечении 10 больных телят с выраженной диспепсией. Препарат назначали по 1 дозе два раза в день в течение 10 суток. Результаты исследования микрофлоры кишечника у больных телят до начала лечения и через 7-10 дней после окончания лечения представлены в таблице 4.

После назначения препарата симптомы диспепсии и диареи были купированы в течение 3-7 дней, препарат давали в течение 10 дней.

Показатели состояния микробиоценоза кишечника показывают, что терапевтическое действие препарата заключается в эффективном устранении УПМ (98,0%) и восстановлении нормофлоры (90%). Показана его абсолютная безвредность и хорошая переносимость.

Таблица 4
Состояние микрофлоры кишечника у больных телят на фоне лечения комплексным препаратом
Представители микрофлоры кишечника	Количество больных (n-30)
До лечения	После лечения
Абс.	%	Абс.	%
Снижение бифидобактерий (104-105)	30	100	4	13,3
Снижение лактобактерий (104-105)	22	73,3	2	6,6
Снижение споровых анаэробов (103-104)	18	60	4	13,3
Повышение УПФ (10 6), в том числе:
Протей	14	46,7	0	0

Клибсиелла	9	30,0	0	0
Гемолитические эшерихии	14	46,7	0	0
Стафилококки	18	60	3	1,0
Псевдомонады	6	20,0	0	0
Стрептококки	12	40,0	0	0
Лактозонегативные энтеробактерии	9	30,0	3	1,0
Грибки кандида	6	20,0	0	0
Сальмонеллы	4	13,3	0	0
Эффективность элиминации УПМ	98,0%
Эффективность восстановления нормофлоры	90%

Источники информации

1. Патент № 2182172 «Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности», опубл. 13.10.2002, бюл. № 13.

2. Патент № 2181596 «Лекарственный препарат из бактерий рода Bacillus», опубл. 27.04.2002, бюл. № 12.

3. Патент № 2169767 «Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности и устойчивостью к антибиотикам», опубл. 27.06.2001, бюл. № 18.

4. Патент № 2172175 «Лечебно-профилактический биопрепарат», опубл. 20.08.2001, бюл. № 23.

5. Патент № 2142287 «Штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов», опубл. 10.12.1999.