средство, снижающее активность холестеролэстеразы

Формула изобретения

Применение трекрезана в качестве средства, снижающего активность холестеролэстеразы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и касается нового средства, влияющего на активность холестеролэстеразы.

Холестеролэстераза играет важную роль в обмене липидов в живых организмах. Составной частью многих тканей и секретов живых организмов является холестеролэстераза, которая выделена из поджелудочной железы ряда животных и человека; она представлена мономером с М=65000-69000, склонным к олигомеризации (М=300000-800000); оптимальная каталитическая активность проявляется при pH 4,25 (для лизосомальных ферментов). При действии холестеролэстераза гидролизует эфиры холестерина до свободного холестерина и жирных кислот.

Доказано, что холестеролэстераза является биомаркером активности атеросклеротического процесса и эффективности проводимого лечения как больных атеросклерозом, так и больных с осложнениями атеросклероза, в частности больных ишемической болезнью сердца - ИБС (стенокардией напряжения II ФК) [1].

Известно, что нарушения липидного обмена в виде атерогенных гиперхолестеринемий сопровождаются повышением свертываемости крови, что оправдывает применение в этих условиях препаратов с антикоагулянтным и липолитическим действием, например, гепарина. В свою очередь, коагуляционный гемостаз и липидный профиль в значительной мере определяется состоянием тромбоцитов, их ферментативными реакциями. В этом плане заслуживают внимания исследования и разработки средств, изменяющих активность липаз тромбоцитов, в частности холестеролэстеразы (ХЭ) тромбоцитов (КФ 3.1.1.13) с оптимумом pH 4,25 участвующий в регуляции катаболизма ЛПНП, гидролизует ЭХС полиеновых ЖК с длинной цепью (C₁₈, С₂₀ ). Среди насыщенных эфиров ХЭ гидролизует с большой скоростью холестериновый эфир меристиновой кислоты (С₁₄), катализирует гидролиз эфиров холестерина, а также их синтез из холестерина и свободных жирных кислот в лизосомах различных клеток [2, 3].

В литературе имеются сведения о возможности активации холестеролэстеразы химическими соединениями [А.В.Ефремов и др. Роль лизосомальных ферментов в генезе ведущих клинико-патофизиологических синдромов: факты и гипотезы. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2007. - N1. - С.18-21. - ISSN 0031-2991; О.В.Цыганкова, Л.А.Руяткина, З.Г.Бондарева. Лизосомальные ферменты. Новый взгляд на фундаментальные материи с позиций кардиолога.//Ж. Цитокины и воспаление. 2009, Т.8, № 4, с.17-24; Venu Т. Tadiboyina, Dora M. Liu, Brooke A. Miskie, Jian Wang, Robert A. Hegele Treatment of dyslipidemia with lovastatin and ezetimibe in an adolescent with cholesterol ester storage disease. // Lipids Health Dis. 2005; 4: 26] [4, 5, 6].

Известно также, что при введении некоторых препаратов, например липостабила, который оказывает гиполипидемическое действие, происходит активация холестеролэстеразы [М.А.Самсонов, А.В.Васильев, А.В.Погожева, С.Н.Бобкова. Сравнительная оценка гиполипидемического действия ПНЖК -3 и липостабила. // Вопр. Питания, 1996, № 4. с.12-16] [7].

Известно, что некоторые соединения не активируют, а ингибируют активность холестеролэстеразы. Так, при исследовании субстратной специфичности установлено, что галактозилцереброзид и фосфатидилсерин активируют активность холестеролэстеразы, а ганглиозид и лизолецитин, наоборот, ингибируют ее (Ф.Хухо. Нейрохимия, основы и принципы. - M.: Мир, 1990 г, стр.32) [19].

Однако существует потребность в поиске и внедрении в практику новых диагностических и лекарственных средств, обладающих активностью в отношении данного фермента.

Задачей изобретения является разработка нового средства, понижающего активность холестеролэстеразы (ХЭ).

Поставленная задача решается новым отечественным препаратом трекрезан, что позволяет расширить область его применения.

Трекрезан обладает широким спектром терапевтического действия и отвечает формуле:

[2 - СН₃С₆Н ₄OСН₂СОО]^- [NH(CH₂CH ₂OH)₃]⁺

Известно применение трекрезана как препарата, повышающего иммунитет и адаптивные свойства организма [8]. Свойство трекрезана влиять на общую активность холестеролэстеразы в литературе не описаны.

Применение трекрезана по новому назначению стало возможным благодаря выявленным нами его новым свойствам. Впервые показано, что введение трекрезана снижает активность лизосомального липолитического фермента из класса гидролаз (КФ 3.1.1) - холестеролэстеразы (КФ 3.1.1.13).

Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована ниже представленными данными.

Пример 1

Методика. В исследование включены 27 больных ИБС: стенокардией напряжения II ФК (17 мужчин и 10 женщин), средний возраст - 55,4±6,7 лет. Диагноз верифицировали на основании рекомендаций ААК/ААС/ЕОК, 2003 и Канадской классификации СтН в модификации ВКНЦ.

В исследование не включались больные с нестабильной стенокардией, инфарктом миокарда давностью менее 3 месяцев, с тяжелой и злокачественной артериальной гипертензией, с хронической сердечной недостаточностью ФК III-IV по NYHA, со стойкой артериальной гипотензией (САД<100 мм рт.ст.), с AV-блокадой II-II-III степени, синдромом слабости синусового узла, с выраженной почечной и печеночной недостаточностью, а также с заболеваниями или состояниями, которые могли повлиять на объективность исследования.

Все пациенты в течение 30 дней до начала исследования получали стандартную терапию СтН, которая при необходимости включала нитраты (изосор-бида динитрат 40-80 мг/сут), -адреноблокаторы (атенолол 25-50 мг/сут), дезагреганты (аспирин 125 мг/сут), ингибиторы АПФ (каптоприл 25-50 мг/сут), а затем в составе комплексного лечения трекрезан, по 600 мг в сутки в течение 30 дней. Реологические свойства крови (РСК) исследовали на вискозиометре ротационного типа АКР-2 (МП "Комед", Россия) [9], оценивали вязкость крови (ВКр), индекс агрегации эритроцитов (ИАЭ) и индекс деформируемости эритроцитов (ИДЭ), вязкость плазмы (ВПл). Фибриноген плазмы крови (ФБПл) определяли по методике Клаусса [10]. Эуглобулиновым методом (ЭуЛ) оценивали активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), тромбиновое время (ТВ), фибринолитическую активность крови [10]. Агрегационную активность тромбоцитов изучали по методом, рекомендованным [9]. Содержание холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ) определяли ферментативным способом на анализаторе FP-900 (Финляндия), ХС липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) - в супернатанте после преципитации липопротеидов других классов хлоридом магния. ХС липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) рассчитывали по формуле W.Friedwald [11]. Индекс атерогенности (ИА) определяли методом [10]. Исследования проводили до начала лечения и через 1,5 месяца комплексного лечения. Тромбоциты выделяли из крови путем последовательного центрифугирования в градиенте фиколлверографии методом [12]. Активность кислой холестеролэстеразы (КХЭ) определяли по методу [13], в модификации [14].

Результаты обрабатывали статистически.

Результаты. При сравнении исходных показателей РСК и гемостаза отмечено превышение верхних границ нормы исходных средних значений: вязкость крови при скоростях сдвига 200 с^-1 (ВКр200), - в 1,1 раза, вязкость крови при скоростях сдвига 100 с^-1 (BKp100) - в 1,1раза, вязкость крови при скоростях сдвига 20 с^-1 (ВКр20) - в 1,4 раза. Среднее значение ИДЭ составило -1,093+0,057, что меньше нормы в 1,10 раза, и свидетельствовало о повышенной жесткости эритроцитов и их меньшей доступности для капиллярной зоны микроциркуляции (табл.1). После применения в течение месяца стандартного лечения отмечено некоторая положительная, но не достоверная динамика показателей РСК и гемостаза. При добавлении трекрезана в дозе 600 мг в сутки к стандартной терапии в течение 1 месяца наблюдались достоверные положительные изменения РСК: снижение ВКр200, ВКр100, ВКр20, ИАЭ, ВПл, ФБПл, ИАТр, укорочение времени ЭуЛ и удлинение ТВ (табл.1).

Не выявлено значимых побочных эффектов или осложнений, связанных с приемом трекрезана, требовавших его отмены.

Вместе с тем, на фоне проводимого стандартного лечения наблюдалось повышение уровня активности КХЭ тромбоцитов, которые, как известно, являются составной частью атеросклеротического процесса особенно на ранних стадиях повреждений. Изменения тромботической формации включают активацию тромбоцитов с последующей адгезией к субэндотелиальному коллагену [15]. Все это свидетельствует о нарушении липидного обмена и не противоречит результатам других исследований [1, 16]. После добавления к стандартизованному лечению СтН трекрезана, у больных ИБС отмечалось достоверное снижение активности КХЭ в Тц на 37% по сравнению с активностью этого фермента до начала лечения и снижение уровня ХС, ЛПНП, ЛПОНП, ТГ, ИА (табл.2).

Таким образом, одним из ключевых звеньев в сложной цепи механизма действия трекрезана является влияние на общую активность ХЭ в условиях развития атеросклеротического процесса.

Таблица 1
Реологические свойства крови и гемостаз у больных СтН ПФК при включении трекрезана в комплексное лечение(n=27) (М±m)
Показатель	Исходно	Через 1 месяц станд. леч.	Через месяц после вкл. трекрезана
Вязкость крови при скоростях сдвига 200 с-1 (ВКр200) (сП)	5,7±0,06	5,6±0,09	5,4±0,07
Вязкость крови при скоростях сдвига 100 с-1 (ВКр100) (сП)	6,2±0,08	6,0±0,11	5,8±0,08
Вязкость крови при скоростях сдвига 20 c-1 (BKp20) (сП)	8,6±0,09	8,3±0,06	7,9±0,06
Вязкость плазмы (Впл) (сП)	1,9±0,02	1,86±0,04	1,7±0,01
Индекс агрегации эритроцитов (ИАЭ)	1,4±0,09	1,37±0,08	1,3±0,06
Индекс деформируемости эритроцитов (ИДЭ)	1,07±0,04	1,07±0,06	1,08±0,1
Гематокрит (%)	41,8±3,7	41,5±2,4	41,5±3,2
Общий белок (ОБ) (г/л)	76,2±11,5	75,9±7,4	75,5±9,2
Фибриноген плазмы крови (ФБПл) (г/л)	345,4±14,8	341,9±13,7	301,9±12,3
Спонтанная агрегация тромбоцитов (САТр) (%)	6,8±0,2	6,8±0,3	6,6±0,3
Индуцированная-АДФ агрегация тромбоцитов (ИАТр) (%)	49,6±1,1	42,9±1,8	39,9±1,5
Активированное частичное тромбо-пластиновое время АЧТВ (сек)	38,5±1,2	40,2±1,9	43,8±2,7
Протромбиновое время (ПВ) (секунды)	16,1±2,2	16,5±2,8	17,3±3,2
Тромбиновое время (ТВ) (секунды)	17,6±1,9	18,4±1,7	23,5±1,6
Время эуглобулинового лизиса ЭуЛ (секунды)	204,9±15,8	198,5±26,4	180,5±15,3
Примечание: р<0,05

Таблица 2
Изменение активности кислой холестеролэстеразы в тромбоцитах (мкмоль/мин на 1 г белка) и уровня липидов у больных СтН ФК II при включении трекрезана в состав комплексной терапии (n=27) (M±SD)
Показатель	Исходно	через 1 месяц станд. лечения	через месяц после вкл. трекрезана
КХЭ (Тц)	0,68±0,02	0,62±0,08	0,43±0,02
ХС ммоль/л	6,52±0,21	6,33±0,18	5,73±0,20
ЛПВП ммоль/л	0,97±0,13	0,98±0,10	1,17±0,11
ЛПНП ммоль/л	4,49±0,15	4,36±0,07	3,76±0,08
ЛПОНП ммоль/л	1,06±0,14	0,99±0,17	0,80±0,13
ТГ ммоль/л	2,32±0,17	2,17±0,14	1,77±0,11
ИА	5,72±0,34	5,46±0,28	3,89±0,28
Примечание: - р<0,05

Пример 2

Эксперименты проведены на кроликах породы Шиншилла с исходной массой тела 1,8-2,0 кг. Кроликам опытных групп (10 животных) вводили внутримышечно свежеприготовленный водный раствор трекрезана (Тк) в дозе 25 мг/кг, в течение 3 мес. В конце экспериментов у животных в грудном отделе аорты стандартными методами определяли содержание липидов, триацилглицеринов, -липопротеинов и холестерина. Планиметрически оценивали индекс ее пораженности атеросклеротическими бляшками (ИПА). Для определения активности ХЭ из кусочков грудной аорты диспергированием выделяли клетки интимы методом [17]. Для этого использовали раствор (0,5 мл), содержащий коллагеназу тип 4 и эластазу тип 3 («sigma», США). Время диспергирования 75 мин при 37°С (1 мл/50 мг ткани). Полученную суспензию клеток промывали холодным раствором Хенкса. Осадок при последней промывке гомогенизировали в 2 мл 0,25М раствора сахарозы pH 7,4 с 0,001 м ЭДТА. Конечное разведение гомогенатов аорты соответствовало 1:20 (вес: объем). Супернатант использовали для исследования активности ХЭ. Активность ХЭ определяли по методу [13], в модификации [14], используя в качестве субстрата 12,7 мкмолей холестерол-(1-14с)-олеата (удельная мКи/ммоль («Amershem», Англия). Субстрат предварительно освобождали от загрязнения жирными кислотами экстракцией, затем добавляли в небольшое количество бензола, содержащего 1,25 ммоль немеченого холестерол олеата и 127 ммоль яичного лецетина. Растворитель упаривают в токе азота. Несколько раз промывают хлороформом при 37°С. Затем в колбу, содержащую субстратную смесь, заливают 10 мл 10 мм тирс-НСl буфера pH 7,0 с 100 мм ЛСД. Суспензию переносят в 15 мл сосуд с охлаждением (или баню со льдом) и озвучивают 12 мин на Brenson W-350 дезинтеграторе со стандартным диаметром наконечника 0,5 дюймовым и мощностью около 100 Вт. Полученную опалесцирующую суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 30000 об/мин («Beckmen» L-5). Препарат хранят при 4°С в течение 2 нед.

Источник фермента - суспензия клеток (аорта) разбавляли в 3 раза буфером pH 7,4 (среда выделения с дигитоником), субстрат разводили в 0,1 М ацетатном буфере pH 3,9 с 5,0 мм таурохолатом натрия в соотношении 1:4 (об/об). К 0,1 мл материала добавляли 0,1 мл раствора субстрата, инкубировали на водяной бане при 37 градусах С 90 мин и останавливали реакцию органической смесью, состоящей из метанола, хлороформа и гептана (2,5 мл) в соотношении 1,4:1,3:1 (об/об) соответственно, после чего добавляли 0,1 М боратный буфер pH 10,0 (1,05 мл) и проводили активное смешивание на встряхивателе «Vortex» в течение 5 мин. Далее смесь центрифугировали в течение 10 мин при 2500-3000 об/мин на центрифуге РС-6. После разделения фаз отбирали 0,5 мл верхней светлой фазы и подсчитывали ее в сцинциляционной жидкости (на 1 л толуола-4 г РРО и 0,2 г РОРОР) на счетчике «Mark-3» (Голландия).

Активность холестеролэстеразы (А) рассчитывали по формуле:

где СРМ - счет в импульсах/мин; 1,27 - количество немеченого холестерололата в пробе, мкмоль; 40 - разведение в ходе энзиматической реакции; 4,9 - коэффициент фазового распределения меченого холестерололеата; t - время инкубации, мин.

Активность выражали в количестве образующихся микромолей холестерололеата с учетом распределения в фазах под действием холестеролэстеразы в мин на 1 г белка.

Результаты обрабатывали статистически.

Результаты ферментативного анализа представлены в табл.3.

Таблица 3
Показатели липидного обмена при применении трекрезана
Показатели	Ткань аорты
Эталон, ИПА(%)=3,1±1,1
Липиды общие (ммоль/л)	0,2±0,01
Холестерол (ммоль/л)	0,1±0,01
Триацилглицерины (ммоль/л)	0,1±0,01
-липопротеины (ммоль/л)	-
Холестеролэстераза (мкмоль/мин на 1 г белка)	32,4±2,33
Опыт-трекрезан в дозе 25 мг/кг в/м 2 месяца, ИПА (%)=36±5
Липиды общие (ммоль/л)	1,1±0,1
Холестерол (ммоль/л)	0,3±0,1
Триацилглицерины (ммоль/л)	0,2±0,04
-липопротеины (ммоль/л)	-
Холестеролэстераза (мкмоль/мин на 1 г белка)	24,6±1,11
Примечание: - р<0,05 по отношению к контролю.

Корреляционный анализ выявил связь между уровнем активности ХЭ и показателями липидного обмена после введения Трекрезана (табл.4).

Таблица 4
Коэффициенты корреляции (г) активности холестеролэстеразы в ткани аорты с показателями липидного обмена при применении трекрезана в дозе 25 мг/кг в/м
Фермент	Липиды общие (ммоль/л)	Холестерин (ммоль/л)	Триацилглицерины (ммоль/л)	-липопротеины (ммоль/л)	ИПА (%)
ХЭ	r=0,18	r=0,20	r=0,21	r=0,17	r=0,27

Активацию системы лизосомального липолиза можно рассматривать как компенсаторную реакцию ферментных систем на фоне преобладания неспецифического, нерегулируемого эндоцитоза модифицированных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) или надмолекулярных ЛПНП-содержащих комплексов. При этом в условиях субстратного насыщения может возникнуть относительная недостаточность отдельных лизосомальных ферментов (в частности ХЭ), гидролизующей эфиры холестерина (ЭХС), что приводит к аккумуляции ЭХС и триглицеридов в клетках крови и повышению риска развития атеросклероза [18]. Наряду с этим изменения в состоянии лизосомального аппарата интимы можно расценивать и как адаптационные перестройки на стадии липоидоза, и как результат функциональной недостаточности на стадии образования фиброзной бляшки.

Таким образом, реакции холестеролэстеразы указывают на структурно-функциональные нарушения в деятельности субклеточных структур при развитии атеросклероза и соответственно полезными могут быть средства, активные в отношении таких реакций.

Установление новых свойств трекрезана позволит использовать его, например, для повышения устойчивости сосудистой системы к холестерину при развитии атеросклеротического процесса. Также он может быть использован для образования вторичных посредников или предшественников в синтезе биологически активных веществ - эйкозаноидов. Ввиду важности выявленного механизма корреляции активности ферментной системы в зависимости от состояния организма трекрезан можно использовать не только для профилактики и/или лечения состояний, связанных с нарушением нормальной функции холестеролэстеразы, но и при диагностике структурно-функциональных нарушений в деятельности субклеточных структур при развитии атеросклероза, а также при скрининге, соединений, обладающей такой же активностью.

Литература

1. Васильев А.В., Варсанович Е.А., Погожева А.В., Самсонов М.А., Бобкова С.Н.: Липолитические ферменты лизосом тромбоцитов и мононуклеаров в патогенезе ИБС. // «Вопр. мед. химии» 1992, № 5. С.27-29.

2. А.А.Покровский, В.А.Тутельян. Лизосомы. - Наука, 1976, 380 с.

3. X.Брокерхоф, Р.Дженсен. Липолитические ферменты, пер. с англ., - М., 1978, с.242-356.

4. А.В.Ефремов [и др.]. Роль лизосомальных ферментов в генезе ведущих клинико-патофизиологических синдромов: факты и гипотезы. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия: научно-теоретический журнал. - 2007. - N1. - С.18-21. - ISSN 0031-2991.

5. О.В.Цыганкова, Л.А.Руяткина, З.Г.Бондарева Лизосомальные ферменты. Новый взгляд на фундаментальные материи с позиций кардиолога. // Ж. Цитокины и воспаление. 2009, Т.8, № 4, с.17-24.

6. Venu T. Tadiboyina, Dora M. Liu, Brooke A. Miskie, Jian Wang, Robert A. Hegele Treatment of dyslipidemia with lovastatin and ezetimibe in an adolescent with cholesterol ester storage disease.// Lipids Health Dis. 2005; 4: 26.

7. М.А.Самсонов, А.В.Васильев, А.В.Погожева, С.Н.Бобкова. Сравнительная оценка гиполипидемического действия ПНЖК w-3 и липостабила. // Вопр. Питания, 1996, № 4. с.12-16.

8. Воронков М.Г., Расулов М.М. Трекрезан - родоначальник нового класса адаптогенов и иммуномодуляторов II Хим.-фарм.Ж., 2007, № 1, с.3-9.

9. Захарченко В.Н. // В сб. "Реологические исследования в медицине", вып.I, - М.: Медицина, (1997), С.2.

10. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. - М.: Медицина. (1987), С.106-174.

11. Friedwald W.T., Levy R.I., Fredrickson D.S. Estimation of plasma low density lipoprotein cholesterol concentration with use of the preparative ultracentrifuge. // Clin. Chem. (1972); V.18, P.499-502.

12. Gmeling-Meyling F., Waldmann Т. Separation of human blood mono-cytes and lymphocytes on a continuous percoll gradient. // J. Immun. Methods (1980). Vol.26, № 1, Р.308-603.

13. Pittman R.C., Khao J.C., Steinberg D. Cholesterol esterase in rat adipose tissue and its activation by cyclic adanosin 3'5'-monophosphate-dependent protein kinase. // J. Biol. Chem. (1975); Vol.250. - P.4505-4510.

14. Severson D.J., Fletcher T. Characterisation of cholesterol ester hydrolase activities in rabbit and guinea pig aortas. // Atherosclerosis (1978); Vol.31. - P.21-32.

15. Packard R.R., Libby P. Inflammation in atherosclerosis: from vascular biology to biomarker discovery and risk prediction. // din Chem. (2008). Vol.54, № 1. P.24-38.

16. Kamanna V.S., Vora S., Roh D., Kirschenbaum M.A. Comparative Comparative studies on acid cholesterol esterase in renal blood vessels and aorta of control and hypercholesterolemic rabbits. // Atherosclerosis. (1992) Vol.94, № 1, P.27-33.

17. Haley N.J., Powler S., De Duve C. Lysosomal and cholesteryl esterase activity in normal and lipid laden aortic cells. // J. Lipid Research. - 1980. - N 8. - P.961-969.

18. Нагорнев В.А. Методология в изучении проблемы атеросклероза. // Мед. акад. Ж. 2005, т.5, в.3, с.121-133.

19. Ф.Хухо. Нейрохимия, основы и принципы. - М.: Мир, 1990 г, стр.32.