способ повышения физической выносливости в эксперименте

Формула изобретения

Способ повышения физической выносливости в эксперименте путем введения стволовых клеток, отличающийся тем, что мышам-гибридам (CBA×C57B1/6)F1 вводят фетальные клетки печени, полученные от эмбрионов (CBA×C57B1/6)F1, находившихся на 14-м дне гестационного периода.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для разработки комплексных программ подготовки спортсменов, а также людей, чья профессия связана с физическими нагрузками и экстремальными ситуациями.

Существует много способов повышения физической выносливости у людей: применение анаболических стероидов (АС), препаратов гормональной природы, наркотических веществ, алкоголя, мочегонных средств, анестетиков, психостимуляторов, транквилизаторов, сердечных гликозидов, бета-блокаторов, кровяной допинг (гемотрансфузия крови, повышение кислородосовместмости, введение дополнительных эритроцитов, введение искусственных переносчиков кислорода) [Leigh-Smith S. Blood boosting // Br J Sports Med. - 2004. - 38:99-101], введение эритропоэтина или его аналогов [Ekblom В., Berglund В. Effect of erythropoietin administration on maximal aerobic power // Scand J Med Sci Sports. - 1991. - 1:88-93] и другие.

Однако ряд из них способствует возникновению и развитию впервые возникших заболеваний и патологических состояний [Driessen М, Muessigbrodt Н, Dilling Н, Driessen В. Child sexual abuse associated with anabolic androgenic steroid use // Am J Psychiatry. 1996 Oct; 153(10): 1369; Ferrera PC, Putnam DL, Verdile VP. Anabolic steroid use as the possible precipitant of dilated cardiomyopathy // Cardiology. 1997, Mar-Apr; 88(2):218-20], приводящих к смертельному исходу [Fineschi V, Baroldi G, Monciotti F, et al. Anabolic steroid abuse and cardiac sudden death: a pathologic study // Arch Pathol Lab Med. 2001, Feb; 125(2):253-5], другие вызывают стойкую патологическую зависимость. Все они запрещены к применению Международным Олимпийским Комитетом (МОК) по этическим соображениям.

Известны способы повышения физической выносливости в эксперименте. К ним относится генетический допинг:

- введение генетически модифицированного аденовируса (AAVs), который вызывает увеличение выработки эритроцитов [Snyder RO, Spratt SK, Lagarde С, et al. Efficient and stable adeno-associated virus-mediated transduction in the skeletal muscle of adult immunocompetent mice // Hum Gene Ther. - 1997. - 1; 8(16):1891-900; Messina S, Mazzeo A, Bitto A, et al. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice // FASEB J. - 2007. - 21(13):3737-46; Gowdak L.H.W., Poliakova L., Wang X., et al. Adenovirus-mediated VEGF121 gene transfer stimulates angiogenesis in normoperfused skeletal muscle and preserves tissue perfusion after induction of ischemia // Circulation. - 2000. - 102:565-571].

- введение в мышечную ткань модифицированного гена, аналогичного ЕРО (эритропоэтину) [Diamanti-Kandarakis Е, Konstantinopoulos PA, Papailiou J, et al. Erythropoietin abuse and erythropoietin gene doping: detection strategies in the genomic era // Sports Med. - 2005; 35(10):831-40; Svensson EC, Black HB, Dugger DL, et al. Long-term erythropoietin expression in rodents and non-human primates following intramuscular injection of a replication-defective adenoviral vector // Hum Gene Ther. - 1997. - 10; 8(15): 1797-806]

- блокирование двух копий гена миостатина, которое приводит к значительному повышению мышечной массы [Whittemore LA, Song K, Li X, et al. Inhibition of myostatin in adult mice increases skeletal muscle mass and strength. // Biochem Biophys Res http://Commun.-2003.-Jan 24; 300(4):965-71].

- активирование в организме грызунов гена - "выключателя жира" [Wang YX., Zhang CL., Yu RT., et al. Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPAR5 // PloS Biol. - 2004. - 2(10):e294; Wolf G. The function of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor delta in energy homeostasis // Nutr Rev. - 2003. - 61(11):387-90], вследствие чего резко увеличивается выработка белка PPAR-delta. В результате наблюдается удвоение количества "медленных и выносливых" мышечных волокон. (Таким образом, они получают возможность пробегать без остановки 1,8 км, в то время как рекорд обычных мышей - 900 м) [Evans RM, Barish GD, Wang YX. PPARs and the complex journey to obesity // Nat Med. - 2004. - Apr; 10(4):355-61].

- введение в организм гена, отвечающего за выработку инсулиноподобного фактора роста - insulin-like growth factor 1 (IGF-1), который обладает уникальной способностью ускорять процесс регенерации мышечной ткани. В опытах на мышах показано, что помимо восстановления поврежденных мышц он увеличивает их массу без воздействия тренировок. За две недели лабораторные мыши нарастили 15% мускулатуры, и сила мышц увеличилась на 14% у молодых и на 27% у "старых" животных. Предполагается, что у людей прирост составит 10% в месяц [Barton-Davis E.R., Shoturma D.I., Musaro A., et al. Viral-mediated expression of insulin-like growth factor I blocks the aging-related los of skeletal muscle function // Medical Sciences. - 1998. - http://no22.-vol.95; 26:15603-15607; Goldspink G., Yang SY. Method of treating muscular disorders United States Patent // No. US 6,221,842 B1, Apr. 24, 2001; Goldspink G. Research on mechano growth factor: its potential for optimizing physical training as well as misuse in doping // Br J Sports Med. - 2005. - 39:787-788].

- введение эндотелиальной NO-синтетазы (ecNOS), отвечающей за тонус кровеносных сосудов, работу гладкомышечной мускулатуры сосудистой стенки и процессы тромбообразования [Nakane Е, Nohara R. Exercise therapy for heart failure // Nippon Rinsho. - 2006. - 64(5):962-7].

- введение гена роста клеток внутренней поверхности сосудов - vascular endothelial growth factor (VEGF), в том числе в сочетании с основным фактором роста фибробластов (bFGF) [Messina S, Mazzeo A, Bitto A, et al. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice // FASEB J. - 2007. - 21(13):3737-46; Lee JS, Kim JM, Kim KL, et al. Combined administration of naked DNA vectors encoding VEGF and bFGF enhances tissue perfusion and arteriogenesis in ischemic hindlimb // Biochem Biophys Res Commun. - 2007. - 7;360(4):752-8], в результате чего улучшается кровоснабжение мышц.

- введение животным гена, блокирующего синтез допамина в головном мозге, что способствует повышению работоспособности животных. Они начинают прилежно трудиться «просто так, а не за награду» [Liu Z., Richmond B.J., Murray Е.А., et al. DNA targeting of rhinal cortex D2 receptor protein reversibly blocks learning of cues that predict reward // Neuroscience. - August 17. - 2004. - vol. 101. - no.33. - 12339].

Все перечисленные способы - сложные, трудоемкие, а главное, приводят к стойкому прогрессирующему нарушению жизненно важных функций организма.

Известен способ использования клеток-предшественников пуповинной крови для регенерации скелетных мышц в эксперименте [Koponen JK, Kekarainen Т, Е Heinonen S, et al. Umbilical cord blood-derived progenitor cells enhance muscle regeneration in mouse hindlimb ischemia model // Mol Ther. - 2007. - 15(12):2172-7]. Авторы получили повышение регенеративной способности скелетных мышц и не ставили задачи изучить выносливость. Авторами использовались клетки-предшественники, которые имеют более низкий потенциал к пролиферации по сравнению с фетальными за счет повышенного содержания дифференцированных клеток по отношению к недифференцированным.

Задача: предложить способ повышения физической выносливости за счет введения фетальных клеток печени.

Решение поставленной задачи позволит получить технический результат, заключающийся в достижении повышения выносливости к физическим нагрузкам экспериментальных животных. Достигнутый технический результат позволит использовать способ для корректировки и совершенствования комплексных программ подготовки спортсменов к соревнованиям, а также лиц, профессия которых связана с экстремальными условиями.

Технический результат достигается за счет использования фетальных клеток печени, обладающих более высоким потенциалом к пролиферации, нежели стволовые клетки костного мозга. Кроме того, в предлагаемом способе учитывается срок взятия фетальных клеток - на 14-й день гестационного периода, периода оптимального соотношения эритроидных и миелоидных клеток-предшественников [Micklem HS, Ford СЕ, Evans ЕР, et al. Competitive in vivo proliferation of foetal and adult haematopoietic cells in lethally irradiated mice // J Cell Physiol. 1972; 79:293; Rebel VI, Miller CL, Eaves CJ, Lansdorp PM. The repopulation potential of fetal liver hematopoietic stem cells in mice exceeds that of their adult bone marrow counterparts // Blood. 1996; 87:3500; Harrison DE, Zhong RK, Jordan CT, et al. Relative to adult marrow, fetal liver repopulates nearly five times more effectively long-term than short-term // Exp Hematol. 1997; 25:293].

Поставленная задача решается за счет того, что мышам-гибридам (CBA×C57B1/6)F1 вводят фетальные клетки печени, полученные от эмбрионов (CBA×C57B1/6)F1, находившихся на 14-м дне гестационного периода.

Способ осуществляется следующим образом:

Мыши-гибриды (CBA×C57B1/6)F1, самцы в возрасте двух месяцев составляли 2 группы: опытную (n=40) и контрольную (n=40). Группы были сопоставимы по полу, возрасту и взяты из одного и того же питомника (вивария) в один и тот же день.

Фетальные клетки печени получали от эмбрионов (CBA×C57B1/6)F1, находившихся на 14-м дне гестационного периода. Нулевым днем гестации считали день обнаружения пробки во входе во влагалище у самок линии СВА.

Печень выделяли и ресуспендировали путем пропускания через иглы уменьшающегося диаметра, фильтровали через металлическую сеточку и 2 раза отмывали центрифугированием при 1500 оборотов/минуту в двух миллилитрах среды RPMI 1640 (ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская область, п.Кольцово, Россия) со сменой среды. Осадок клеток ресуспендировали в полной культуральной среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС)(ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская область, п.Кольцово), 10 мМ Hepes (ICN Biomedicals Inc.), 4×10 ^-5 М 2-меркаптоэтанола (L.Oba Feinchemie, Fischamene), 2 Мм L-глутамина (ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирскаяобласть, п.Кольцово), 40 мкг/мл гентамицина (ФГУП НПО «Вирион») и подсчитывали их общее количество в камере Горяева в дубле.

Животные опытной группы плавали в течение 4 месяцев при температуре воды = +32 - +35°С по 4 часа в день 5 раз в неделю, что соответствует физической нагрузке тяжелой интенсивности.

В качестве модели физических тренировок тяжелой интенсивности было выбрано плавание без груза по следующим причинам: плавание с грузом может приводить к излишне интенсивному напряжению и не допускает "отдыха"; каждое животное в режиме плавания без груза само определяет уровень физической активности, таким образом, несмотря на принудительный характер процедуры (мыши не могли самостоятельно выбираться из ванны), нагрузка была относительно добровольной. В отличие от других видов принудительных физических нагрузок плавание не приводит к перегреванию организма, что переносится грызунами значительно хуже, чем переохлаждение. Плавание является сильным стрессором для экспериментальных животных, поэтому условия проведения тренировок подбирались с намерением максимально снять этот фактор: мыши плавали в достаточно большой ванне (30 животных в ванне 60×30×20 см³ при температуре воды 32-35°С).

Мыши контрольной группы на протяжении этого времени по такому же графику подвергались "хэндлингу" (то есть их брали руками и возвращали обратно в клетку для создания одинаковых условий эксперимента). После окончания вышеуказанного периода опытная и контрольная группы были разделены на две подгруппы.

Половине животных из опытной группы внутривенно (в хвостовую вену) вводили фетальные клетки печени (ФКП), взятые от эмбрионов мышей-гибридов (CBA×C57B1/6)F1 на 14-й день периода гестации, в дозе 2×106 клеток/мышь [Kamminga L.M., Akkerman I., Weersing E., et al. Autonomous behavior of hematopoietic stem cells // Experimental Hematology. - 2000. - 28:1451-1459] в 0,5 мл полной культуральной среды RPMI 1640, другой части - среду, на которой разводили клетки (RPMI 1640), внутривенно 0,5 мл.

Аналогичную процедуру выполняли на мышах контрольной группы: половине животных внутривенно (в хвостовую вену) вводили фетальные клетки печени (ФКП), взятые от эмбрионов мышей-гибридов (CBA×C57B1/6)F1 на 14-ый день периода гестации, в дозе 2×10 ⁶ клеток/мышь в 0,5 мл полной культуральной среды RPMI 1640, другой половине - среду, на которой разводили клетки (RPMI 1640), внутривенно 0,5 мл.

Процедуру выполняли в один и тот же день утром в контрольной и опытной группах.

На следующий день после введения среды RPMI 1640 или фетальных клеток печени все животные опытной группы снова приступили к тренировкам по описанному выше графику: плавали при температуре воды = +32 - +35°С по 4 часа в день 5 раз в неделю. Мыши контрольной группы на протяжении этого времени по такому же графику подвергались "хэндлингу".

Для оценки выносливости к основанию хвоста и животу каждой мыши (из четырех групп) подвешивали груз, составляющий 8% от массы тела животного. Процедуру проводили каждые 15 дней. По позе животного в воде [Matsumoto K., Ishihara K., Tanaka K., et al. An adjustable-current swimming pool for the evaluation of endurance capacity of mice // J Appl Physiol. - 1996. - 81:1843-1846] и по прекращению движения лапами и хвостом отмечали время максимальной усталости. При погружении мыши на дно бассейна и отсутствии попыток продолжать плавание ее вынимали из резервуара. Время от момента опускания животного в бассейн и до прекращения плавания (погружение на дно бассейна) считалось временем проведения эксперимента.

В результате проведенного теста на выносливость было установлено, что введение фетальных клеток печени (ФКП) приводит к значительному увеличению продолжительности плавания в группе "пловцы + ФКП" по сравнению с группами "пловцы" (p<0,01) и контролем (p<0,01). Выявлено увеличение времени тренировки у контрольных грызунов, получивших ФКП, по сравнению с контрольной группой (p<0,01) и группами "пловцы" (p<0,01) и "пловцы + ФКП" (p<0,05). Другими словами, у нетренированных животных с введенными фетальными клетками печени выносливость повысилась в 2,78 раза по сравнению с грызунами, тренировавшимися непрерывно на протяжении 4 месяцев ("спортсменами") и в 1,24 раза по сравнению с пловцами, тренировавшимися 4 месяца и получившими фетальные клетки печени. Продолжительность плавания (часы):

Контроль	0,42	Пловцы	2,23**
Контроль + ФКП	6,21**	Пловцы + ФКП	5,0**
** - p<0,01

Перед выводом животных из эксперимента определяли количество эритроцитов концентрацию гемоглобина крови. Установлено, что после введения фетальных клеток печени (ФКП) показатели эритроцитов и концентрация гемоглобина достоверно не изменились.

Группы	Эритроциты,	Гемоглобин,
	Nx 10 12/л	г/л
	(M±m)	(M±m)

Контроль	6,33±0,34	119,17±5,11
Контроль + ФКП	7,18±0,44	118,74±5,52
Пловцы	6,84±0,30	118,72±2,98
Пловцы + ФКП	7,30±0,27	115,40±3,48
М - среднее значение
m - стандартная ошибка средней

Определяли уровень клеточных и гуморальных иммунных реакций.

Показатели гуморального иммунного ответа:

Первичный ответ на Т-зависимый антиген (IgM - АО К):

Контроль	116687	Пловцы	73177*
Контроль + ФКП	122830	Пловцы + ФКП	112233
* - p<0,05

Установлено статистически значимое подавление гуморального звена иммунного ответа у пловцов по сравнению с контрольной группой. Между группами "контроль + ФКП" и "пловцы + ФКП" достоверных различий не выявлено

Показатели клеточного иммунного ответа:

ГЗТ (в %):
Контроль	68	Пловцы	39*
Контроль + ФКП	74	Пловцы + ФКП	51
* - p<0,05

Установлено статистически значимое подавление клеточного звена иммунного ответа у пловцов по сравнению с контрольной группой. Между группами "контроль + ФКП" и "пловцы + ФКП" достоверных различий не выявлено.

Таким образом, в результате исследования установлено, что данный способ вызывает выраженное повышение выносливости (p<0,01) у животных, получивших фетальные клетки печени по сравнению с пловцами, не вызывает достоверных изменений показателей количества эритроцитов, концентрации гемоглобина между группами "пловцы" и "пловцы + ФКП", что может служить доказательством того, что предлагаемый способ не является допингом по определению. Установлено отсутствие подавления как гуморального, так и клеточного звеньев иммунного ответа.