способ прогнозирования тяжести течения алкоголизма и развития психотических и судорожных осложнений

Формула изобретения

Способ прогнозирования тяжести течения алкоголизма и развития психотических и судорожных осложнений путем одновременного проведения биохимического и клинико-генетического исследований, отличающийся тем, что одновременно определяют активность дофамин-бета-гидроксилазы в плазме крови и генотип по Val 158/108 Met полиморфизму гена катехол-орто-метилтрансферазы, и при наличии активности дофамин-бета-гидроксилазы менее 20 нмоль/мл/мин в сочетании с генотипом А/А по Val 158/108 Met полиморфизму гена катехол-орто-метилтрансферазы прогнозируют неблагоприятное течение алкоголизма и развитие психотических и судорожных осложнений.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к наркологии.

Известен способ прогнозирования тяжести течения алкоголизма путем проведения клинических исследований (Алкоголизм. Руководство для врачей. Под ред. Г.В.Морозова, В.Е.Рожнова, Э.Я.Бабаяна. М., 1983). Недостатками этого способа являются его длительность, субъективность, зависимость точности прогноза от квалификации врача.

Известны способы клинико-биохимического (Murayama М., Matsushita S., Muramatsu Т., Higuchi S. Clinical characteristics and disease course of alcoholics with inactive aldehyde dehydrogenase-2. Alcohol. Clin. Exp. Res. 1998. 22(2), p.524-527) и клинико-генетического исследования тяжести течения алкоголизма (Lawford В.Е., Young R.М., Rowell J.A., Gibson J.N., Feeney G.F., Ritchie T.L., Synduiko K., Noble E.P. Association of the D2 dopamine receptor Al allele with alcoholism: medical severity of alcoholism and type of controls. Biol. Psychiatry, 1997, V.15, 41(4), p.386-393).

Недостатками этих способов является констатация настоящего статуса больного и невозможность прогнозирования тяжести дальнейшего течения алкоголизма.

Известен способ прогнозирования тяжести течения алкоголизма путем проведения клинико-генетических исследований генотипа 7/10-1 гена тирозингидроксилазы, по отсутствию которого прогнозируют неблагоприятное течение алкоголизма (RU 2225613 С1, 10.03.2004).

Недостатком этого способа является невысокая достоверность прогноза в связи с многофакторностью и полигенностью этиопатогенеза алкоголизма.

Техническим результатом предлагаемого решения является устранение вышеуказанных недостатков, возможность прогнозирования тяжести течения в начале заболевания, повышение точности и объективизации прогноза, расширение арсенала способов прогнозирования тяжести течения и развития психотических и судорожных осложнений при алкоголизме.

Указанный результат достигается тем, что одновременно исследуют активность фермента дофамин-бета-гидроксилазы (ДБГ) в плазме крови, определяют генотип по Val 158/108 Met полиморфизму гена катехол-орто-метилтрансферазы (КОМТ) и при наличии активности ДБГ менее 20 нмоль/мл/мин и А/А генотипа по Val 158/108 Met полиморфизму гена КОМТ прогнозируют неблагоприятное течение алкоголизма и развитие психотических и судорожных расстройств.

Способ осуществляют следующим образом.

Больному алкоголизмом проводят клиническое исследование с оценкой стадии заболевания по классификации Н.Н.Иванца (1983). Дополнительно в плазме крови исследуемого, полученной путем венепункции, проводят определение активности фермента ДБГ спектрофотометрическим методом (Nagatsu Т., Udenfriend S. Photometric assay of dopamine- -hydroxylase activity in human blood. Clinical Chemistry, 1972, Vol.18, № 9, p.980-983). Для опыта берут 2 пробирки с гепаринизированной плазмой крови испытуемого, одна служит контрольной, а другая - опытной пробой. К 0,05 мл плазмы крови испытуемого добавляют 0,4 мл дистиллированной воды. В дальнейшем добавление реактивов к пробам ведется параллельно. Добавляют 0,2 мл Na-ацетатного буфера (рН 5,0), 0,05 мл 90 мМ раствора CuSO₄, 0,05 мл 0,2 М раствора фумарата Na, 0,05 мл раствора паргилина (3,2 мг/мл), 0,05 мл 0,4 М раствора тирамина, 0,1 мл раствора каталазы (0,5 мг/мл) (раствор каталазы готовят непосредственно перед добавлением). Только в контрольную пробу добавляют 0,2 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. В опытную и контрольную пробы добавляют 0,05 мл 0,2 М раствора аскорбиновой кислоты, который готовят непосредственно перед добавлением. Опытные пробы сразу же инкубируют открытыми 30 минут при 37°С при непрерывном встряхивании. Затем в них добавляют 0,2 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. Опытные и контрольные пробы центрифугируют 15 минут при 5000 об/мин. Супернатант отсасывают и наносят на колонки со смолой DOWEX5OW 8 (смола предварительно переводится в Н⁺ форму промыванием колонок 2 мл 6 н. раствора соляной кислоты). Затем колонки дважды промывают 2 мл дистиллированной воды. Образованный в процессе реакции октопамин снимают со смолы 2 мл 3 н. раствора NH ₄OH и собирают в чистые пробирки. Элюированный октопамин окисляют в p-оксибензальдегид при добавлении в пробирки 0,2 мл 2% раствора NaJO₄. Избыток перйодата устраняют внесением в пробы 0,2 мл 10% раствора Na₂S₂O ₅ через 1-2 минуты после внесения NaJO₄. Измеряют оптическую плотность полученных растворов в опытной и контрольной пробах при двух длинах волн - 333 и 360 нм. Итоговая оптическая плотность составляет Д=(Д_опт 333-Д_опт 360)-(Д _конт 333-Д_конт 360). Калибровочную кривую строят по октопамину, содержание октопамина в пробах от 1 до 200 нмоль. Величина активности ДБГ выражается в нмоль/мл/мин.

Одновременно проводят генотипирование гена КОМТ по Val 158/108 Met полиморфизму методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (Szegedi A., Rujescu D., Tadic A., Muller М.J., Kohnen R., Staussen H.H., Dahmen N. The catechol-O-methyltransferase Val 158/108 Met polymorphism affects short-term treatment response to mirtazapine, but not to paroxetine in major depression. Pharmacogenomics Journal, 2005, Vol.5, № 1, p.49-53). Установлено, что замена аминокислоты валина на метионин в 108 положении растворимой КОМТ, приводящая к снижению активности КОМТ в 3 раза (или тех же аминокислот в положении 158 мембраносвязанной КОМТ), вызвана заменой гуанина на аденин в 158 кодоне гена КОМТ (ATG/Met/низкоактивный аллель, GTG/Val/высокоактивный аллель) (Grossman M.H., Littrel J.B., Weinstein R., Szumlanski C., Weinshilboum R.M. Identification of the possible basis for inherited differences in human catechol-O-methyltransferase. Trans. Neurosci. Soc., 1992, V.18, p.70; Lotta Т., Vidgren J., Tilgman C., Ulmanen I., Melen K., Julkunen I., Taskinen J. Kinetics of human soluble and membrane-bound catechol-O-methyltransferase: A revised mechanism and description of the thermolabile variant of the enzyme. Biochemistry, 1995, Vol.34, p.4202-4210). Генотипирование по Val 158/108 Met полиморфизму гена КОМТ осуществляют следующим образом. Выделение ДНК из крови производят с помощью набора «Wizard ^® Genomic DNA Purification Kit» фирмы Promega ^® согласно прилагающемуся протоколу. Методом полимеразной цепной реакции амплифицируют фрагмент гена длиной 169 п.н. при помощи следующих праймеров 5'-ACT-GTG-GCT-ACT-CAG-CTG-TG-3',5'-CCT-TTT-TCC-AGG-TCT-GAC-AA-3'. Амплификацию необходимых фрагментов ДНК проводят в буфере (50 мкл), состоящем из 670 mmol/l Tris-HCl (рН 8.8), 166 mmol/l (NH ₄)₂SO₄, 1% Triton X-100, 25 mmol/l MgCl₂ (буфер 1), с добавлением 250 mkmol/l смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1U термостабильной ДНК-полимеразы (TAQ-pol, ЛИТЕХ) и праймеров по 0,3 мкмоль каждого. Реакцию проводят согласно программе: 94°С 5 мин, 35 циклов: 94°С 30 сек, 59°С 12 сек, 72°С 20 сек, в конце 72°С 5 мин. 30 мкл амплификата подвергают расщеплению рестриктазой Hin Ш (Fermentas) 5U. Затем продукты расщепления подвергают электрофоретическому разделению в 3% агарозном геле, содержащем бромистый этидий, и анализируют в ультрафиолетовом свете. Если присутствует аденин в положении 108/158 (ATG/Met/низкоактивный аллель) при воздействии рестриктазы Hin Ш образуются фрагменты 96, 26, 29, 18 п.н. Наличие гуанина в 108/158 (GTG/Val/высокоактивный аллель) приводит к потере сайта рестрикции для Hin Ш, и образуются фрагменты размером 114, 26 и 29 п.н.

При одновременном обнаружении активности ДБГ менее 20 нмоль/мл/мин и А/А генотипа по Val 158/108 Met полиморфизму гена КОМТ прогнозируют неблагоприятное течение алкоголизма и развитие психотических и судорожных состояний.

Пример 1. Больной К., 31 год, поступил в клинику ННЦ наркологии Минздравсоцразвития РФ 20.04.2009 г. с диагнозом "Хронический алкоголизм 2-3 стадии" в состоянии начальной фазы абстинентного синдрома. Жалобы: слабость, сердцебиение, боли в области сердца, потоотделение, "видения" по ночам, бессонница. Отмечает острое желание выпить спиртного.

Анамнез: первая проба алкоголя в 14 лет, сопровождалась ощущением эйфории. Систематическое потребление с 16 лет: 2-3 раза в неделю массированный прием (водка в объеме до 1,5 литров). Выраженный абстинентный синдром сформировался к 19 годам.

Характер потребления: истинные запои до 5 недель с перерывами 6-14 дней. Характерно тяжелое течение абстинентного синдрома. Перенес алкогольный делирий, отмечены судорожные расстройства в состоянии абстиненции. Первично госпитализирован в возрасте 20 лет. Терапевтических ремиссий нет. Число госпитализаций по поводу алкоголизма на момент исследования - 6.

Проведено определение активности ДБГ в плазме крови, активность ДБГ 15 нмоль/мл/мин, одновременно определен генотип А/А по Val 158/108 Met полиморфизму гена КОМТ.

Таким образом, у данного больного неблагоприятное течение алкоголизма совпадает с активностью ДБГ менее 20 нмоль/мл/мин и с наличием генотипа А/А по Val 158/108 Met полиморфизму гена КОМТ.

Пример 2. Больной Б., 36 лет, поступил в клинику ННЦ наркологии Минздравсоцразвития РФ 15.02.2009 г. с диагнозом "Хронический алкоголизм 1-2 стадии" в состоянии начальной фазы абстинентного синдрома. Жалобы: тошнота, рвота, слабость, головокружение, бессонница. Отмечает желание выпить спиртного.

Анамнез: первая проба алкоголя в 15 лет. Систематическое потребление с 23 лет: 2-3 раза в месяц. Абстинентный синдром сформировался к 35 годам.

Характер потребления: псевдозапои до 4 дней. Связывает с "плохим настроением" и "подходящей компанией". Характерно легкое течение абстинентного синдрома. Психотических и судорожных расстройств не отмечено. Терапевтическая ремиссия составила 24 месяца. Настоящая госпитализация - впервые.

Проведено определение активности ДБГ в плазме крови, активность ДБГ 45 нмоль/мл/мин, одновременно определен генотип по Val 158/108 Met полиморфизму гена КОМТ. Обнаружен G/G генотип.

Таким образом, у данного больного относительно благоприятное течение алкоголизма совпадает с активностью ДБГ более 20 нмоль/мл/мин и наличием генотипа G/G по Val 158/108 Met полиморфизму гена КОМТ.

Предлагаемым способом проведено обследование 60 больных с диагнозом 2-3 стадии алкоголизма. Совпадение клинических и лабораторных данных выявлено в 85% случаев (p<0,05).

Предлагаемый способ прогнозирования тяжести течения алкоголизма имеет преимущества перед известными способами, заключающиеся в повышении точности и объективности прогноза, расширении арсенала способов прогнозирования тяжести течения и развития психотических и судорожных осложнений при алкоголизме, в том числе, и на начальной стадии заболевания, что имеет значение для выбора адекватной лечебной тактики.