способ определения токсичности отходов и почв

Формула изобретения

Способ определения токсичности образцов, заключающийся в измерении уровня тестовой функции микроорганизмов в присутствии и отсутствие анализируемого образца и вычислении токсичности на основании полученных результатов, отличающийся тем, что тестированию подвергают плотные образцы (отходы, почвы), причем тестирование проводят без предварительной процедуры получения водного экстракта образца, в качестве тест-объекта используют культуру почвенной бациллы, обладающей дегидрогеназной активностью, в качестве тест-функции используют его дегидрогеназную активность, которую определяют с применением ресазурина и регистрируют с использованием традиционного измерительного прибора для спектрофотометрии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам определению токсичности твердых отходов и почв путем приведения их в непосредственный контакт с бактериями и регистрации изменения дегидрогеназной активности бактерий, измеряемой с применением ресазурина. Изобретение может быть использовано в лабораториях экологического контроля, при разработке биотехнологий переработки отходов, при разработке технологий рекультивации загрязненных почв, при определении класса опасности отходов, для определения воздействия на объекты окружающей среды новых материалов, техногенных образований и отходов.

Известен биосенсор для определения токсичности химических загрязняющих веществ и жидких отходов, использующий природные или генетически модифицированные бактерии (Vibrio fischeri, Escherichia coli pUCD615 pRB28, Pseudomonas putida 556), иммобилизованные в тонкой пленке поливинилового спирта GB 19990025788 19991101 (1).

Известен микропланшетный способ определения токсичности соединений в жидких образцах, получаемых из водных, почвенных и воздушных объектов, который использует рекомбинантные люминисцентные микроорганизмы Escherichia coli DPD2511, DPD2540, DPD2794 and TV 1061, включенные в агар, альгинат натрия или полиакриламид, и основан на увеличении люминисценции при увеличении концентрации токсикантов, в жидких образцах KR 20010054588 20010905 (2).

Недостатками данных способов является то, что они позволяют определять непосредственно токсичность только жидких образцов, а при тестировании почвенных объектов требуют обязательного получения водного экстракта, что удлиняет и усложняет процедуру биотестирования.

Известен способ определения общей токсичности почв по интенсивности люминисценции бактерий (3). Способ основан на определении изменения интенсивности биолюминисценции генно-инженерного штамма бактерий (биосенсор «Эколюм») при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Интенсивность биолюминисценции определяется с помощью специализированного люминометра «Биотокс-10». При определении индекса токсичности почв анализу подвергают почвенную вытяжку, подготовленную путем 24-часовой экстракции почвы 5-кратным объемом дистиллированной воды. Основными недостатками этого способа являются невозможность определения токсичности непосредственно почвенных образцов и дороговизна измерительного прибора и биосенсора.

Известен способ определения аэробной дегидрогеназной активности почв, основанный на акцептировании отщепляемого в процессе дегидрирования микроорганизмами почвы водорода бесцветными солями тетразолия, в частности 2,3,5-трифенилтетразолийхлорид (ТТХ), и его превращении в 2,3,5-трифенилформазан, имеющий красную окраску с последующим измерением колориметрическим способом количества формазана (4).

Недостатком данного способа является невозможность определения дегидрогеназной активности образцов, в которых присутствует медь, связанная с негативным влиянием меди на абсорбцию продукта восстановления ТТХ 2,3,5-трифенилформазана (5).

Наиболее близким аналогом, выбранным в качестве прототипа по совокупности совпадающих признаков и достигаемому техническому результату, является изобретение «Штамм бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9580, используемый в качестве тест-культуры для определения токсичности объектов окружающей среды» RU 2346035 C1 (6). Реализация использования данного штамма осуществляется следующим образом. Предварительно получают водные экстракты из донных отложений или готовят водные растворы тестируемых токсикантов. Штамм выращивается на питательном агаре с 1,7% NaCl, готовится ночная культура, разбавляется и к аликвотам этой суспензии добавляются растворы веществ или водные экстракты донных отложений. После инкубирования проводят измерение люминисценции смесей, содержащих анализируемые соединения, и контрольных на люминометре ЛТ-01, в качестве контроля используют 1,7% раствор NaCl. Метод рекомендован для мониторинга водных объектов и донных отложений.

Основными недостатками данного изобретения являются:

- низкая эффективность, связанная с необходимостью получения водного экстракта из образца. Данный недостаток вызван тем, что в прототипе в качестве тестовой функции используется люминисценция; определение интенсивности люминисцении не позволяет присутствовать в реакционной смеси твердого образца и вызывает необходимость получения из образца водного экстракта. Однако при тестировании водного экстракта оценивается негативное влияние на тестовый организм только части соединений, присутствующих в образце, а именно водорастворимой части, которая переходит в водный экстракт. В то же время согласно опубликованным данным негативный эффект на живые организмы могут оказывать и вещества и элементы, находящиеся в связанном состоянии и не переходящие в водный экстракт (7, 8). Это приводит к тому, что при определении токсичности почв или донных отложений на основании тестирования их водных экстрактов анализу подвергают только водорастворимые токсиканты, и эффективность оценки токсичности всего образца в целом существенно снижается;

- трудоемкость метода, связанная с использованием морской бактерии Vibrio fischeri. Данный недостаток вызван тем, что Vibrio fischeri является морской бактерией, требующей особых условий для культивирования и биотестирования, поэтому требуется тщательная подготовка реакционной смеси для того, чтобы конечное содержание солей составляло 1,7%, что приводит к затруднению процесса биотестирования. Кроме этого, фермент люцефераза является очень чувствительным к температурным изменениям;

- дороговизна метода, связанная с необходимостью приобретения для определения люминесценции измерительного прибора люминографа;

- трудность в экстраполяции результатов биотестирования почв и отходов, связанная с тем, что бактерии Vibrio fischeri не являются представителями почвенного биоценоза, на который оказывают воздействие токсиканты, присутствующие в почве и отходах.

Целью заявленного технического решения является:

- повышение эффективности определения токсичности отходов и почв путем непосредственного контакта образца с тестовым объектом, в качестве которого используется культура почвенной бациллы, обладающей дегидрогеназной активностью, что позволяет оценивать влияние токсичных компонентов, присутствующих в образце, - водорастворимых и тесно связанных с матрицей образца;

- удешевление за счет использования традиционного измерительного прибора;

- снижение трудоемкости за счет применения культуры почвенной бациллы, обладающей дегидрогеназной активностью, не требующей особых условий культивирования и подготовки образца;

- исключение процедуры экстраполяции данных за счет замены тест-объекта, не являющегося представителем почвенных микроорганизмов, на типичный представитель.

Способ осуществляют следующим образом.

Испытуемый образец стерилизуют в автоклаве для инактивации микроорганизмов, присутствующих в образце, далее культуру почвенной бациллы, обладающей дегидрогеназной активностью, и выращенную до фазы, в которой она проявляет максимальную активность приводят в непосредственный контакт со смесью в течение определенного времени, разделяют жидкую и твердую фракции реакционной смеси и в жидкой фракции по изменению индикатора окислительно-восстановительного процесса определяют изменение скорости дегидрогеназной реакции, происходящей под действием образца.

Для расчета уровня токсичности предлагаемый способ реализуют параллельно в четырех вариантах.

Вариант 1 («опыт»). Из массы стерилизованного образца делают навеску, которую помещают в закрывающиеся пробирки. В пробирки с навеской добавляют бактериальную суспензию, дистиллированную воду и раствор ресазурина (индикатор окислительно-восстановительной реакции). Пробирки помещают в термостат при 28°С и периодически встряхивают. Через 24 часа реакционную смесь центрифугируют при 6000 об/мин и в надосадочной жидкости определяют спектрофотометрически невосстановленный резазурин.

Вариант 2 («опыт без бактерий»). Из массы образца делают навеску, которую помещают в закрывающиеся пробирки. В пробирки с навеской добавляют дистиллированную воду и раствор ресазурина, но не добавляют бактериальную суспензию, а заменяют ее таким же количеством дистиллированной воды. Далее процедуру проводят, как описано выше.

Вариант 3 («контроль активности бактерий»). В закрывающиеся пробирки приливают бактериальную суспензию, дистиллированную воду, раствор ресазурина, но не добавляют образец, заменяя его таким же количеством дистиллированной воды. Далее процедуру проводят, как описано выше.

Вариант 4 («контроль на реактивы»). В закрывающиеся пробирки вместо образца помещают дистиллированную воду, вместо суспензии бактерий - дистиллированную воду и ресазурин. Дальнейшую процедуру проводят, как описано выше.

Все варианты опыта проводят в трех повторностях. Затем результаты каждого варианта усредняют. По результатам четырех вариантов испытаний производят вычисления с получением показателя токсичности исследуемых почв или отходов по формуле:

, где

D_пробы - оптическая плотность надосадочной жидкости пробы «опыт»;

D_спробы - оптическая плотность надосадочной жидкости пробы «опыт без бактерий».

D_Ка - оптическая плотность надосадочной жидкости пробы «контроль активности культуры».

D_сКа - оптическая плотность надосадочной жидкости пробы «контроль на реактивы».

Заключение о токсичности или нетоксичности образца делается общеизвестным способом на основании результатов определений дегидрогеназной активности бактерий в контроле и опыте. Проба считается токсичной, если величина Т составляет 50% и более. В этом случае для количественной оценки токсичности пробы устанавливают эффективную концентрацию образца - EC₅₀.

Способ реализуется следующим образом и поясняется таблицами 1, 2, 3.

Пример 1

Хранение культуры почвенной бациллы осуществляли в пробирках на мясопептонном агаре. Культивирование проводили при 28°С в колбах на 250 мл с 50 мл L-бульона (г/л): пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10. Для биотестирования культуру инкубировали на среде L-бульона (г/л): пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10 при температуре 28°С до достижения оптической плотности 1,5-1,7 опт.ед. ( =600 нм, кювета 10 мм).

Аликвоты этой культуры (3 мл) переносили в пробирки с завинчивающимися пробками, добавляли 3 г образца либо воды и проводили анализ в соответствии с четырьмя вариантами процедуры, описанными выше. Оценку токсичности проводили по относительному различию в дегидрогеназной реакции бактерий, индикатором которой служило восстановление ресазурина, в присутствии и отсутствии анализируемого образца (в опыте и контроле).

Для сравнения образцы подвергали тестированию по методу, используемому в исследованном уровне техники, в том числе и в прототипе. Для этого из образцов получали водные экстракты. Для приготовления водного экстракта навеску почвы 1 г разбавляли дехлорированной водой в соотношении 1:10, смесь встряхивали на ротаторе (1 ч, 60 об/мин), отстаивали 24 часа, затем фильтровали. При тестировании полученные экстракты (3 мл) использовали вместо 3 г анализируемых образцов.

Для количественной оценки токсичности пробы использовали характеристику ЕС₅₀ (effective concentration).

В случае определения токсичности образца предлагаемым методом ЕС₅₀ - это эффективная концентрация образца, вызывающая 50% ингибирование дегидрогеназной активности культуры по сравнению с активностью культуры в отсутствие образца. В случае определения токсичности образца на основании определения токсичности водного предлагаемому методу составило для образца с содержанием хрома 992 мг/кг 54 мг, что в 3,2 раза выше по сравнению со значением, установленным при анализе по способу с получением водного экстракта (как указано в прототипе). Также, например, при анализе токсичности образца, содержащего кадмий 58 мг/кг, различия в значениях EC₅₀ составили 4 раза, причем значение ЕС₅₀, установленное предлагаемым способом, оказалось ниже. Чем ниже значение ЕС ₅₀, тем более эффективен метод определения. Из приведенных данных следует, что значения ЕС₅₀, установленные при тестировании водного экстракта из образцов (как принято в прототипе), выше, т.е. требуется его меньшее разведение, чтобы достичь 50% ингибирующего эффекта, поэтому предлагаемый в данном техническом решении способ более эффективен.

Пример 2

Тестированию подвергали промышленные отходы: ЧС - Черный соляр из установки получения дорожных битумов, ШГ - Шлам из термогальванического цеха, ШВП - Шлам от ванн обезжиривания, ШГ2 - Гальванический шлам, фильтр-пресс-станция, ШФ - Шлам фосфатирования из ванны фосфатирования.

Для сравнительной оценки использовали характеристики ЕС₅₀ и EC₁₀. В случае определения токсичности образца предлагаемым методом ЕС₅₀ и ЕС ₁₀ - это эффективная масса образца, вызывающая 50% и 10% ингибирование дегидрогеназной активности культуры по сравнению с активностью культуры в отсутствие образца.

Результаты биотестирования приведены в таблице 2.

При биотестировании по предлагаемому способу значения ЕС₅₀ оказались существенно ниже по сравнению с ЕС₅₀, установленными способом с получением водного экстракта. Так, при анализе отхода ЧС ЕС ₅₀, определенная предлагаемым способом, составила 60 мг, тогда как способом с получением водного экстракта (как в прототипе) - 2300 мл и т.д. Это свидетельствует о том, что на тестовую функцию (дегидрогеназную активность) ингибирующее влияют не только водорастворимые токсиканты. Кроме того, из таблицы видно, что различия между установленными значениями ЕС₅₀ существенно отличаются для каждого из тестируемых отходов. Так, для отхода ЧС различия составили 38 раз, для отхода ШГ - 3,5 раза, для ШВП - 1,9 раз, для ШГ2 - 3 раза, для ШФ - 6,4 раза. Аналогичная картина наблюдается при анализе различий в ЕС₁₀. Так, различия составили 43, 2,4, 1,3, 2,3 и 3,9 раз для отходов ЧС, ШГ, ШВП, ШГ2 и ШФ соответственно. Эти различия свидетельствуют о том, что в составе отходов присутствуют вещества с разной растворимостью в воде, именно этим объясняются разные значения ЕС₅₀ и ЕС ₁₀. Разная растворимость веществ обуславливает разный негативный эффект токсикантов в отходах на живые организмы и подтверждает необходимость оценивания не только водорастворимых соединений в отходах, но и находящихся в связанном состоянии. Таким образом, представленные данные демонстрируют преимущество заявленного технического решения.

Пример 3

Почвенные образцы, загрязненные металлами и органическим токсикантом фунгицидом альто-супер, тестировали предлагаемым способом и способом с получением водного экстракта. В этих же образцах до того, как их простерилизовали в автоклаве, определили дегидрогеназную активность аборигенной микрофлоры для того, чтобы выяснить, насколько адекватно результаты биотестирования отражают негативное влияние токсикантов на реальное сообщество микроорганизмов в почве и, следовательно, насколько легко их будет впоследствии интерпретировать. Для сравнения определяли токсичность образцов. Результаты тестирования представлены в таблице 3.

Во-первых, из данных таблицы видно, что при тестировании по предлагаемому способу уровень ингибирующего эффекта значительно выше. Например, при загрязнении почвы фунгицидом альто-супер в концентрации 33,5 мг/кг уровень ингибирования различался в 1,9 раз, при загрязнении Cu (70 мг/кг) - в 1,5 раз, Cr (15,6 мг/кг) - в 1,6 раз и т.д.

Во-вторых, для того чтобы установить, результаты какого способа биотестирования наиболее адекватно отражают реальную ситуацию, был проведен корреляционный анализ. Установленный коэффициент корреляции (R) между результатами биотестирования по предлагаемому способу и результатами определения дегидрогеназной активности аборигенной микрофлоры оказался равным 0,96. При аналогичном анализе результатов биотестирования по способу с получением водного экстракта и результатов определения дегидрогеназной активности аборигенной микрофлоры коэффициент корреляции (R) составил 0,62. Таким образом, результаты, получаемые по предлагаемому способу, более адекватно отражают реальную ситуацию и поэтому более легко поддаются интерпретации.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, т.к. из исследованного уровня техники не выявлен способ, обладающий совокупностью заявленных в формуле изобретения признаков, позволяющий получить одновременно заявленную группу технических результатов (целей), а именно высокой эффективностью определения токсичности отходов, техногенных образований и почв за счет непосредственного контакта образца с тестовым объектом и низкой трудоемкостью при проведении анализа.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, т.к. заявленное техническое решение не следует явным образом для специалиста в данной области техники и является не очевидным для специалиста и позволяет разрешить противоречивые задачи, а именно: с одной стороны, способ должен быть простым и дешевым и при этом одновременно обладать высокой эффективностью при определении токсичности отходов, техногенных образований и почв.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. оно было реализовано на реальных промышленных отходах (черном соляре из установки получения дорожных битумов, шламе из термогальванического цеха, шламе от ванн обезжиривания, гальваническом шламе фильтр-пресс-станции, шламе фосфатирования из ванны фосфатирования), и получены заявленные результаты, а именно установлена более высокая эффективность заявленного технического решения, что подтверждается табличными данными. При этом для реализации заявленного промышленного решения требуется стандартное лабораторное оборудование, применяются традиционные реактивы и доступные микроорганизмы, например бациллы.

Источники информации:

(1) GB 19990025788 19991101 Immobilized bacteria.

(2) KR 20010054588 20010905 Kit for analysis of toxicity of toxic materials in sample usig fixed recombinant luminescent microorganisms.

(3) MP № 11-1/11-09. Определение общей токсичности почв по интенсивности биолюминисценции бактерий.

(4) Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии / Ф.Х.Хазиев; Ин-т биологии Уфим. НЦ - М.: Наука, 2005. - 252 с.

(5) Obbard J.P. Measurements of dehydrogenase activity using 2-p-iodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-pheniltetrazolium chloride in the presence of copper // Biol. Fertil. Soils. - 2001. - V.33. - P.328-330.

(6) RU 2346035 C1 13.08.2007. Заявка 2007130940/13. Опубликовано 10.02.2009. Бюл. № 4. Штамм бактерий Vibrio fischeri, используемый в качестве тест-культуры для определения токсичности объектов окружающей среды.

(7) Brandt, K.K. Decreased abundunce and diversity of culturable Pseudomonas spp. Populations with increasing copper exposure in tghe suger beet rhizosphere [текст] / K.K.Brandt, A.Petersen, P.Holm, O.Nybroe // Microbiol Ecology. - 2006. - No.56. - P.281-291.

(8) Ivask, A. Recombinant luminescent bacterial sensors fotr the measurement of bioavailability of cadmium and lead in soils polluted by metal smelters [текст] / A.Ivask, M.Fracois, A.Kahru, H.-C.Dobourguier, M.Virta, F.Douay // Chemosphere. - 2004. - No.55. - P.147-156.

Способ определения токсичности отходов и почв

Таблица 1
Образец	ЕС50 (мг), определенная по предлагаемому способу	ЕС50 (мкл), определенная по способу с получением водного экстракта
Почва, загрязненная хромом	600	3000
(VI) в концентрации 7,8 мг/кг
Почва, загрязненная хромом	54	176
(VI) в концентрации 992 мг/кг
Почва, загрязненная хромом	29	136
(VI) в концентрации 3971 мг/кг
Почва, загрязненная кадмием в	1500	3000
концентрации 3 мг/кг
Почва, загрязненная кадмием в	300	3000
концентрации 11,6 мг/кг
Почва, загрязненная кадмием в	107	429
концентрации 58 мг/кг

Таблица 2
	Биотестирование по предлагаемому способу	Биотестирование по способу с получением водного экстракта
	ЕС50	ЕС10	ЕС50	ЕС10
ЧС	60	24	2300	173
ШГ	62	22	218	53
ШВП	100	39	190	44
ШГ2	112	40	334	90
ШФ	34	15	216	58

Таблица 3
Токсикант в почве	Концентрация, мг/кг	Токсичность, %
Предлагаемый способ	Способ с использованием водного экстракта	Способ, основанный на оценке аборигенной микрофлоры
Cu	5	28	22	16
	15	50	38	47
	30	55	41	57
	60	70	47	78
	70	72	49	81
	120	80	61	83
	180	87	74	89
Cr	0,31	41	0	45
	3,1	46	0	57
	7,8	79	29	84
	15,6	93	58	93
	992	96	63	96
	3971	100	66	99
Ni	10	10	0	4
	20	17	11	18
	40	45	11	48
	60	62	13	64
	100	80	41	80
	250	92	54	94
Pb	15	9	7	5
	50	61	14	60
	100	77	21	75
	200	81	59	81
	250	86	64	89
	500	92	80	100
	1000	95	90	100
	1500	100	99	100
Фунгицид	0,3	0	0	0
альто-	0,7	2	0	0
супер	0,85	6	0	3
	1,1	27	0	9
	1,3	28	19	13
	6,7	57	21	37
	33,5	84	44	75
	67,8	88	58	87