способ получения препарата фолликулостимулирующего гормона из аденогипофизов животных

Формула изобретения

Способ получения препарата фолликулостимулирующего гормона из аденогипофизов животных, включающий гомогенизацию, экстракцию, осаждение балластных белков, выделение и концентрацию гормона, отличающийся тем, что гомогенизацию осуществляют в соотношении 1:6-1:7 в присутствии буферного раствора с рН 7,0-7,5, включающего 0,89-0,90% натрия хлорида, 3,2-3,4% сернокислого аммония, 0,1% поверхностно-активного вещества твин-80, остальное - вода, а концентрацию гормона проводят путем замораживания смеси со скоростью 5°С/ч и последующего оттаивания и отделения растворимой фазы, содержащей фолликулостимулирующий гормон.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии, в частности к получению препаратов, используемых в животноводстве и ветеринарной медицине с целью стимуляции половой функции, а также при эндокринных нарушениях у самок сельскохозяйственных животных.

Известен способ получения препарата ФСГ из гипофизов лошадей ((W.E.Braselton, W.H. Mc Shan. Rurification and properties of folliclestimulating and luteinzing hormones from horse pituitary glands. - Arch. Biochem., 1970. v.139. - P.45), который включает измельчение гипофиза, экстракцию этанолом, диализацию против хлорида натрия, осаждение метафосфорной кислотой, центрифугирование, гельфильтрацию на сефадексе G-100, хроматографию на карбоксиметил-сефадексе, препаративный электрофорез в полиакриламидном челе, рехроматографию и стандартизацию препарата.

Известен также способ получения препарата ФСГ (А.с. СССР № 413947, А61К 17/18, 1974), который включает гомогенизацию железистой ткани, экстракцию и очистку гормона путем дифференцированного растворения его в растворах сернокислого аммония нисходящих концентраций.

Однако многоэтапность и сложность технологического процесса первого способа делает его длительным, что приводит к снижению выхода препарата. Недостатком второго способа является то, что применение для очистки гормона дифференцированного растворения в растворах сернокислого аммония разных концентраций не позволяет полностью освободиться от балластных белков, что приводит к потерям препарата и снижению его биологической активности.

В качестве протопипа выбран способ получения ФСГ, который включает гомогенизацию аденогипофизов животных, экстракцию, осаждение балластных белков и выделение гормона (Патент РФ № 2062619, 1996 г.). При этом для дезагрегации клеточной ткани и более полного перехода гормона в жидкую фазу в гомогенизат добавляют сернокислый аммоний, этиловый спирт и йодид калия.

Недостатком этого способа является то, что применение с целью дезагрегации клеточной ткани сернокислого аммония, этилового спирта и йодида калия процесс дезагрегации протекает на низком уровне и определенная часть гормона не освобождается из тканей аденогипофиза, что уменьшает выход препарата.

Целью изобретения является увеличения выхода препарата с высокой биологической активностью.

Для этого получают от животных гипофизы, отделяют аденогипофизы (передняя часть гипофизов) и заливают их буферным раствором с рН 7,0-7,5 в соотношении 1:6-7 и который включает 0,89-0,90% натрия хлорида, 3,2-3,4% сернокислого аммония, 0,1% твина-80. Данную смесь гомогенизируют в течение 2-4 мин при температуре 2-4°С до получения однородной массы. После этого гомогенизат экстрагируют в течение 50-60 мин при 2-4°С и центрифугируют до расслоения жидкости с образованием плотного осадка, после чего добавляют сернокислый аммоний до 35-40% от насыщения и вновь центрифугируют. Выделение гормона осуществляют путем ультрафильтрации под давлением и очистки методом ионообменной хроматографии с последующей очисткой на мембране физиологическим раствором с рН 4,2-4,5, отделением от катионита буферным раствором с рН 8,5-9,0 и концентрацией.

При увеличении времени гомогенизации, экстракции и повышении температуры происходит активизация протеолитических ферментов, что повышает гидролиз пептидов, в том числе и ФСГ, который относится к гликопротеидам. В этой связи выход препарата уменьшается.

При уменьшении времени гомогенизации, экстракции и понижении температуры снижается процесс дезагрегации клеточной ткани и уменьшается выход гормона из тканей аденогипофиза в жидкую фазу.

Внесение в гомогенизат поверхностно-активного вещества твин-80 способствует разрушению клеточных мембран. В результате активизируется процесс солюбилизации - самопроизвольного перехода нерастворимых в воде веществ в разведенный раствор с образованием термически устойчивой системы. В результате происходит более полный выход гормона из тканей аденогипофиза в жидкую фазу.

С целью освобождения смеси от балластных веществ проводят центрифугирование до расслоения жидкости с образованием плотного осадка. В надосадочную жидкость (фугат) для осаждения сопутствующих белков и других гормонов гипофиза вносят сернокислый аммоний до 35-40% от насыщения и вновь центрифугируют до образования плотного осадка. Полученный фугат с целью освобождения от сернокислого аммония и концентрирования гормона подвергают ультрафильтрации на мембране УАП-200 под давлением. Затем сконцентрированный гормон очищают методом ионообменной хроматографии. Для этого катионит КУ-2 перемешивают со сконцентрированным раствором гормона в течение 50-60 минут до полного их связывания, переносят на мембрану и отмывают от балластных белков физиологическим раствором с рН 4,2 до тех пор, пока в промывной жидкости не будет содержаться белка, наличие которого контролируют спектрофотометрически. Данная среда является оптимальной для связывания катионита с гормоном. При смещении рН в сторону увеличения или уменьшения взаимодействия гормона с катионитом не происходит. Отделяют гормон от катионита буферным раствором рН 8,5-9,0, что позволяет получить наиболее полный выход гормонального препарата.

После отделения смесь подвергают концентрации. С этой целью ее помещают в сосуд, переносят в рефрижератор и подвергают постепенному замораживанию со скоростью 5°С/ч. По мере замораживания растворимая фаза, содержащая ФСГ, скапливается в нижней части сосуда, и ее отделяют после оттаивания раствора.

Полученный препарат представляет сосбой прозрачную жидкость с желтоватым оттенком, без запаха и примесей.

Пример 1. У крупного рогатого скота в условиях мясокомбината отбирали гипофизы, отделяли аденогипофизы и замораживали в жидком азоте. К 100 г замороженных аденогипофизов приливали 700 мл буферного раствора с рН 7,0 и содержащего 6,3 г натрия хлорида, 23,8 г сернокислого аммония, 0,7 мл твин-80, и гомогенизировали в течение 3 мин при температуре 2-4°С до получения однородной массы. Затем гомогенизат экстрагировали в течение 60 мин при температуре 2-4°С. После этого гомогенизат экстрагировали в течение 60 минут при температуре 2-4°С. После этого грубую взвесь тканей осаждали центрифугированием при температуре 2-4°С до расслоения жидкости с образованием плотного осадка. В полученный фугат, для освобождения от сопутствующих белков и других гормонов гипофиза, вносили сернокислый аммоний до 40% от насыщения и вновь центрифугировали в том же режиме. Полученный фугат, с целью освобождения от сернокислого аммония и концентрирования гормона, подвергали ультрафильтрации на мембране УАП-200 под давлением. Сконцентрированный гормон очищали методом ионообменной хроматографии на катионите КУ-2. Для этого катионит предварительно обрабатывали в небольшом количестве физиологического раствора с рН 4,2 и затем прибавляли к нему сконцентрированный раствор гормона. Смесь перемешивали в течение 60 минут до полного связывания с катионитом. После этого катионит со связанным гормоном переносили на мембрану и отмывали от балластных белков физиологическим раствором с рН 4,2, до тех пор пока в промывной жидкости белок не обнаруживался. Отделяли гормон от катионита буферным раствором с рН 8,5-9,0.

После отделения смесь концентрировали. Для этого помещали в сосуд, переносили в рефрижератор и подвергали постепенному замораживанию со скоростью 5°С/ч. По мере замораживания растворимая фаза, содержащая фолликулостимулирующий гормон, скапливалась в нижний части сосуда и ее отделяли после оттаивания раствора. В результате получали концентрированный препарат в объеме 350 мл, без запаха и примесей.

Стандартизация полученного препарата в соответствии с препаратом ФСГ-п фирмы Scherinq Corporation (США) показала, что его биологическая активность составляла в 1 мл 50-60 ME (2,5-3,0 Armour Standard).

Проверку препарата на токсичность проводили на белых мышах и морских свинках. После внутрибрюшинного введения изготовленного препарата явлений токсикоза и падежа среди лабораторных животных не наблюдалось.

Расфасовывали препарат в стеклянные флаконы по 50 мл, закрывали резиновыми и обкатывали алюминиевыми колпачками. Хранят препарат при температуре 2-5°С, срок годности 24 мес.

Пример 2. Производственную апробацию изготовленного препарата проводили в условиях учебно-опытного хозяйства Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И.Иванова. Препарат использовали с целью получения эмбрионов для их трансплантации у коров. Было сформировано три группы клинически здоровых коров-аналогов черно-пестрой породы по 10 голов в каждой. Первую группу стимулировали изготовленным препаратом ФСГ, вторую группу - препаратом ФСГ-п фирмы Scherinq Corporation, третью группу - препаратом-прототипом.

Стимуляцию коров всех групп препаратами начинали с 8 дня полового цикла по 5-дневной схеме в сочетании с простагландиновым препаратом эстрофаном (500 мкг). На 13-14 день полового цикла у стимулированных коров выявляли половую охоту быком-пробником и проводили искусственное осеменение. На 20 день полового цикла осуществляли нехирургическое извлечение эмбрионов и проводили их оценку.

Стимуляцию коров всех групп препаратами начинали с 9 дня полового цикла. С этой целью каждому животному внутримышечно вводили по 120 ME препарата два раза в сутки с интервалом через 12 часов. На третьи сутки после начала введения вместе с препаратами ФСГ вводили простагландиновый препарат эстрофан (500 мкг). Через 2 дня после введения эстрофана у коров выявляли половую охоту с использованием быка-пробника и при ее наличии проводили искусственное осеменение согласно инструкции. На 20 день полового цикла осуществляли нехирургическое извлечение эмбрионов и проводили их оценку.

Результаты исследований показали, что изготовленный препарат ФСГ по своей биологической активности не уступает препарату ФСГ-п и превосходит препарат-прототип (таблица 1).

Таблица 1
Стимуляция половой функции у коров препаратами ФСГ
Показатели	Используемые препараты
Опытный препарат	ФСГ-п	Препарат-прототип
Стимулировано коров	16	16	16
Проявилась супер-овуляция у коров	14 (87,5%)	14 (87,5%)	13 (81,2%)
Количество эмбрионов на донора	7,5±0,17*	7,8±0,24*	6,5±0,14
в том числе:
- полноценных	5,5±0,20*	6,0±0,21*	4,0±0,18
- дегенеративных	1,0±0,01	1,0±0,01	1,5±0,02
Примечание: * - при Р<0,05 по сравнению с препаратом-прототипом

Пример 3. В условиях свиноводческого комплекса «Магнитный» Курской области изготовленный препарат ФСГ использовали для стимуляции половой охоты у свиноматок-первопоросок после отъема поросят. Было отобрано три группы свиноматок крупной белой породы по 15 голов в каждой. Свиноматки первой опытной группы подвергались обработке изготовленным препаратом ФСГ, который вводили через 24 часа после отъема поросят внутримышечно в дозе 200 ME /гол. Свиноматок второй опытной группы стимулировали препаратом-прототипом по той же схеме, что и животных первой опытной группы. Свиноматкам третьей контрольной группы вместо препаратов вводили стерильную дистиллированную воду.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2, из которой следует, что после применения изготовленного препарата половая охота у свиноматок наступала раньше и синхронно по сравнению с препаратом-прототипом.

Таблица 2
Проявление половой охоты у свиноматок-первоопоросок после отъема поросят, подвергавшихся стимуляции препаратами ФСГ
Группа	Выявлена половая охота у свиноматок после отъема поросят в течение суток
1-5	6-10	11-15	16-20	Всего
1 (предложенный препарат)	6	9	-	-	15
2 (препарат-прототип)	4	4	5	-	13
3 (контрольная)	-	3	3	3	9

Таким образом предлагаемый способ получения препарата ФСГ из аденогипофизов животных позволяет получить препарат с высокой биологической активностью и не вызывающий побочных действий.